专利名称：中药dna检测试剂盒及鉴定方法
技术领域：
本发明涉及中药检测技术领域，更具体地说，是一种中药DNA检测试剂盒 及鉴定方法。
背景技术：
中药材易混品种的监督和检验是药品检验部门每年重点工作内容之一，目 前国内外在中药材检测上普遍采用化学、红外、紫外、液相色谱等分析方法， 上述方法对同科同属不同种的易混药材鉴别的专署性差，而且红外、紫外、液 相色谱等方法又存在着对化学结构相似的物质特异性不强、操作繁琐、费用高 等弊端，难以满足对中药易混品种的鉴定。由于现有分析方法的局限性，很难 对目前存在的中药易混品种的真、伪作出准确判断。本发明人从吉林市药品检 验所近几年的中药同品种的质量考察中发现，符合国家药品标准的不一定是真 正疗效好的药品，而非正式企业生产的假药，如按现有的分析方法检验，结论 的确符合规定。
发明内容
本发明人遵循线粒体DNA (mtDNA)作为遗传信息的载体，用于研究动植 物起源进化遗传学理论，线粒体细胞色素b (cytb)基因DNA片段进化速度适 中，用于分析种内、种间遗传多样性和生物的分类、系统发育。本发明的目的 是对三种易混中药线粒体DNA的全部基因组进行筛选，提供一种能够准确鉴别 易混中药材的特异性，使用方便的中药DNA检测试剂盒，并提供其简便、快速、 检测结果可靠的鉴定方法。
本发明的目的是由以下技术方案来实现的。一种中药DNA检测试剂盒，其特征是，它包含
(a) 鉴定反应体系总体系为100iiL，其中含有缓冲液10 uL， 12.5mM dNTP4-10 uL， O.lmM鹿鞭引物、贝母引物和防己引物中的一种1. 5 -4. 0 u L, Taq DNA聚合酶2-10 n L，待检样本DNA 2-5 u L，余为双蒸馏水；
(b) 阳性对照反应体系总体系为100pL，其中含有缓冲液10iiL， 12.5 mMdNTP4-10 u L， 0. lmM鹿鞭引物、贝母引物和防己引物中的一种1. 5-4. 0 HL， Taq DNA聚合酶2-10 u L，与鹿鞭引物、贝母引物和防己引物中的一种 相应的鹿鞭、贝母和防己DNA中的一种2-5 nL，余为双蒸馏水；
(c) 阴性对照反应体系总体系为100uL，其中含有缓冲液10 uL，12.5 mM dNTP4-10 n L， O.lmM鹿鞭引物、贝母引物和防己引物中的一种1. 5 -4. 0 u L， Taq DNA聚合酶2-10 u L，牛鞭、假贝母和伪防己DNA中的一种2-5 u L， 余为双蒸馏水。
中药DNA鉴定方法，其特征是，它包含以下步骤
(l)设计鹿鞭、贝母、防己线粒体DNA三对特异寡核苷酸引物，含有鹿鞭、 贝母、防己DNA序列，如下鹿鞭引物、贝母引物、防己引物 鹿鞭引物
5， ATACATCCGATACAACAGC 3' 5， GAT嵐TGGGAGATAAGTG 3, 贝母引物
5， ATCATCCGATCAATAACAG 3， 5' AGGGAGMTAATAAAGTGAAA 3' 防己引物
5， AGACACATTCGTMCTC 3，5， CTCATTTMTAGGTATA 3， (2)人工合成鹿鞭、贝母、防己线粒体DNA三对特异寡核苷酸引物，采用 ABI3900高通量合成仪，固相亚磷酰胺三酯合成； (3 )建立中药DNA检测试剂盒
(a) 鉴定反应体系总体系为100uL，其中含有缓冲液10 uL， 12.5mM dNTP4-10 yL， O.lmM鹿鞭引物、贝母引物和防己引物中的一种1. 5-4. 0 u L， Taq DNA聚合酶2-10 u L，待检样本DNA 2-5 u L，余为双蒸馏水；
(b) 阳性对照反应体系总体系为lOOyL，其中含有缓冲液10 yL，12.5 mMdNTP4-10 n L， 0. lmM鹿鞭引物、贝母引物和防己引物中的一种1. 5-4. 0 liL， Taq DNA聚合酶2-10 u L，与鹿鞭引物、贝母引物和防己引物中的一种 相应的鹿鞭、贝母和防己DNA中的一种2-5 nL，余为双蒸馏水；
(c) 阴性对照反应体系总体系为100iiL,含有缓冲液10 ii L， 12.5mM dNTP4-10 nL， O.lmM鹿鞭引物、贝母引物和防己引物中的一种1. 5 -4. 0 y L， Taq DNA聚合酶2-10 w L，牛鞭、假贝母和伪防己DNA中的一种2-5 y L， 余为双蒸馏水；
(4)设计反应程序
分别将中药DNA检测试剂盒的(a)鉴定反应体系、(b)阳性对照反应体系 和(c)阴性对照反应体系的总体系各100uL加入反应管中，置于PCR反应仪 中按下列程序进行
鹿鞭引物94。C预变性3-7 min， 94°C 30s，退火温度57°C 30s， 72°C 1 min-30s， 35个循环，72。C延伸5-8min， 4°C;
贝母引物:94。C预变扭3-7 min， 94°C 1 min-30s，退火温度58°C 30s， 72°C1 min-30s， 35个循环，72。C延伸5-8min， 4°C;防己引物94。C预变性3-7 min， 94°C 1 min-30s，退火温度55°C 30s， 72°C 1 min-30s， 35个循环，72。C延伸5-8min， 4°C; (5)结果判定
反应产物使用1.5-1.8 %琼脂糖凝胶，在DYY-III型水平电泳仪上电泳， 60-70mV电泳45min-lh，分子量100-1200 bp的DNA Marker作参照，凝胶成像 分析系统观察得出结果。
本发明的中药鉴定试剂盒能够准确鉴别中药材的特异性，使用方便；鉴 定方法具有简便、快速、检测结果可靠等优点。
图l为鹿鞭引物检测结果图。 图2为贝母引物检测结果图。 图3为防己引物检测结果图。
图l中l为阳性对照；2鹿鞭DNA与阳性对照出现相同结果为320bp; 3 为标准分子量；4为阴性结果。
图2中5为阳性对照；6贝母DNA与阳性对照出现相同结果为280bp; 7为阴性结果；8为标准分子量。
图3中9为阴性结果；IO阳性对照；11为防己DNA结果与阳性对照出现
相同结果为300bp; 12为标准分子量。
具体实施例方式
下面利用实施例对本发明作进一步说明。
中药DNA鉴定方法，它包含以下步骤
(a)鉴定反应体系总体系为100uL，其中含有缓冲液10 uL, 12.5mM dNTP4-10 nL， 0, lmM鹿鞭引物、贝母引物和防己引物中的一种1. 5 -4. 0 yL， Taq DNA聚合酶2-10 u L，待检样本DNA 2-5 u L，余为双蒸馏水；0. 1 mM 鹿鞭引物、贝母引物和防己引物根据鉴定种类选择，鹿鞭、贝母和防己DNA亦 相应的根据鉴定种类选择；
(b) 阳性对照反应体系总体系为100uL，其中含有缓冲液10 uL，12.5 mMdNTP4-10 u L， 0. lmM鹿鞭引物、贝母引物和防己引物中的一种1. 5 -4. 0 lxL， Taq DNA聚合酶2-10 u L，与鹿鞭引物、贝母引物和防己引物中的一种 相应的鹿鞭、贝母和防己DNA中的一种2-5 nL，余为双蒸馏水；0. lmM鹿鞭 引物、贝母引物和防己引物根据鉴定种类选择，鹿鞭、贝母和防己DNA亦相应 的根据鉴定种类选择；
(c) 阴性对照反应体系总体系为100yL，其中含有缓冲液10 UL，12.5 mM dNTP4-10 u L, 0. lmM鹿鞭引物、贝母引物和防己引物中的一种1. 5 -4. 0 uL, TaqDNA聚合酶2-10 li L，牛鞭、假贝母和伪防己DNA中的一种2-5 n L， 余为双蒸馏水。O.lmM鹿鞭引物、贝母引物和防己引物根据鉴定种类选择，牛 鞭、假贝母和伪防己DNA亦相应的根据鉴定种类选择。
中药DNA鉴定方法，它包含以下步骤
(l)设计鹿鞭、贝母、防己线粒体DNA三对特异寡核苷酸引物，含有鹿鞭、 贝母、防己DNA序列，如下鹿鞭引物、贝母引物、防己引物 鹿鞭引物
5， ATACATCCGATACMCAGC 3， 5' GAT嵐TGGGAGATMGTG 3, 贝母引物
5， ATCATCCGATCAATMCAG 3， 5' AGGGAGMTMTMAGTGMA 3，防己引物
5， AGACACATTCGTMCTC 3， 5' CTCATTTMTAGGTATA 3'
(2)人工合成鹿鞭、贝母、防己线粒体DNA三对特异寡核苷酸引物，采用 ABI3900高通量合成仪，固相亚磷酰胺三酯合成；
(3 )建立中药DNA检测试剂盒
(a) 鉴定反应体系总体系为100yL，其中含有缓冲液10 u L， 12.5mM dNTP4-10 wL， O.lmM鹿鞭引物、贝母引物和防己引物中的一种1. 5 -4. 0 y L， Taq DNA聚合酶2-10 y L，待检样本DNA 2-5 、 L，余为双蒸馏水；
(b) 阳性对照反应体系总体系为100ixL，其中含有缓冲液10 uL, 12.5 mMdNTP4-10 u L， 0. lmM鹿鞭引物、贝母引物和防己引物中的一种1. 5-4. 0 liL， Taq DNA聚合酶2-10 u L，与鹿鞭引物、贝母引物和防己引物中的一种 相应的鹿鞭、贝母和防己DNA中的一种2-5 nL，余为双蒸馏水；
(c) 阴性对照反应体系总体系为100nL，其中含有缓冲液10 nL，12.5 mM dNTP4-10 u L， 0. lmM鹿鞭引物、贝母引物和防己引物中的一种1. 5 -4. 0 y L， Taq DNA聚合酶2-10 P L，牛鞭、假贝母和伪防己DNA中的一种2-5 u L， 余为双蒸馏水；
(4)设计反应程序
分别将中药DNA检测试剂盒的(a)鉴定反应体系、(b)阳性对照反应体系 和(c)阴性对照反应体系的总体系各100uL力B入500iiL反应管中，置于PCR 反应仪中按下列程序进行
鹿鞭引物94。C预变性3-7 min， 94°C 30s，退火温度57°C 30s， 72°C 1 min-30s， 35个循环，72。C延伸5-8min， 4°C;
10贝母引物94。C预变性3-7 min， 94°C 1 min-30s，退火温度58°C 30s， 72°C1 min-30s， 35个循环，72。C延伸5-8min， 4°C;
防己引物94。C预变性3-7 min， 94°C 1 min-30s，退火温度55°C 30s， 72°C 1 min-30s， 35个循环，72。C延伸5-8min， 4°C; (5)结果判定
反应产物使用1.5-1.8 %琼脂糖凝胶，在DYY-III型水平电泳仪上电泳， 60-70mV电泳45min-lh，分子量100-1200 bp的DNA Marker作参照，凝胶成像 分析系统观察得出结果。
本发明所用的固相亚磷酰胺三酯由上海生物工程公司合成，市场有售； 缓冲液含有500 mM KCl， 100 mM Tris-HC1 (PH8. 4), 15 mM MgCl2，市场有售； 12. 5 mM dNTP为12. 5 mM脱氧核苷三磷酸，市场有售；Taq DNA聚合酶，市场 有售；1.5-1.8%琼脂糖凝胶，市场有售；DYY-III型水平电泳仪由北京市六一 仪器厂制造的市售仪器；分子量100-1200 bp的DNA Marker为标准分子量， 市场有售；凝胶成像分析系统，市场有售。
参照图1，鹿鞭DNA与阳性对照出现相同结果为320bp。
参照图2，贝母DNA与阳性对照出现相同结果为280bp。 参照图3，防己DNA结果与阳性对照出现相同结果为300bp。
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权利要求
1. 一种中药DNA检测试剂盒，其特征是，它包含(a)鉴定反应体系总体系为100μL，其中含有缓冲液10μL，12.5mMdNTP4-10μL，0.1mM鹿鞭引物、贝母引物和防己引物中的一种1.5-4.0μL，Taq DNA聚合酶2-10μL，与鹿鞭引物、贝母引物和防己引物中的一种相应的鹿鞭、贝母和防己DNA中的一种2-5μL，余为双蒸馏水；(b)阳性对照反应体系总体系为100μL，其中含有缓冲液10μL，12.5mM dNTP 4-10μL，0.1mM鹿鞭引物、贝母引物和防己引物中的一种1.5-4.0μL，Taq DNA聚合酶2-10μL，与鹿鞭引物、贝母引物和防己引物中的一种相应的鹿鞭、贝母和防己DNA中的一种2-5μL，余为双蒸馏水；(c)阴性对照反应体系总体系为100μL，其中含有缓冲液10μL，12.5mM dNTP4-10μL，0.1mM鹿鞭引物、贝母引物和防己引物中的一种1.5-4.0μL，Taq DNA聚合酶2-10μL，牛鞭、假贝母和伪防己DNA中的一种2-5μL，余为双蒸馏水。
2. —种中药DNA鉴史方法，其持征是，'t包舍以下步腺(1)设计鹿鞭、贝母、防己线粒体DNA三对特异寡核苷酸引物，含有鹿鞭、 贝母、防己DNA序列，如下鹿鞭引物、贝母引物、防己引物 鹿鞭引物5' ATACATCCGATACAACAGC 3' 5' GATAAATGGGAGATAAGTG 3'贝母引物5' ATCATCCGATCAATAACAG 3' 5, AGGGAGAATAATAAAGTGAAA 3'防己引物5' AGACACATTCGTAACTC 3' 5' CTCATTTAATAGGTATA 3'(2)人工合成鹿鞭、贝母、防己线粒体DNA三对特异寡核苷酸引物，采用 ABI3900高通量合成仪，固相亚磷酰胺三酯合成； (3 )建立中药DNA检测试剂盒(a) 鉴定反应体系总体系为100iiL，其中含有缓冲液10 yL， 12.5raM dNTP4-10 ix L， 0. lmM鹿鞭引物、贝母引物和防己引物中的一种1. 5 -4. 0 u L， TaqDNA聚合酶2-10 ix L，与鹿鞭引物、贝母引物和防己引物中的一种相应的 鹿鞭、贝母和防己DNA中的一种2-5 UL，余为双蒸馏水；(b) 阳性对照反应体系总体系为100uL，其中含有缓冲液10 yL, 12.5 mM dNTP 4-10 y L， 0.1 mM鹿鞭引物、贝母引物和防己引物中的一种1. 5 -4.0 yL， Taq DNA聚合酶2-10 y L，与鹿鞭引物、贝母引物和防己引物中的一种相 应的鹿鞭、贝母和防己DNA中的一种2-5 yL，余为双蒸馏水；(c) 阴性对照反应体系总体系为100uL，其中含有缓冲液10 yL， 12.5 mMdNTP4-10 u L， O.lmM鹿鞭引物、贝母引物和防己引物中的一种1. 5-4. 0 u L， Taq DNA聚合酶2-10 u L，牛鞭、假贝母和伪防己DNA中的一种2-5 p L， 余为双蒸馏水；(4)设计反应程序分别将中药DNA检测试剂盒的(a)鉴定反应体系、(b)阳性对照反应体系 和(c)阴性对照反应体系的总体系各IOOPL加入反应管中，置于PCR反应仪 中按下列程序进行鹿鞭引物94。C预变性3-7 min， 94°C 30s，退火温度57°C 30s， 72°C 1 min-30s， 35个循环，72。C延伸5-8min， 4°C;贝母引物94。C预变性3-7 min， 94。C 1 min-30s，退火温度58 °C 30s， 72°C1 min-30s， 35个循环，72。C延伸5-8min, 4'C;防己引物94。C预变性3-7 min， 94。C 1 min-30s，退火温度55°C 30s， 72。C 1 min-30s， 35个循环，72。C延伸5-8min, 4°C; (5)结果判定反应产物使用1.5-1.8 %琼脂糖凝胶，在DYY-III型水平电泳仪上电泳， 60-70mV电泳45min-lh，分子量100-1200 bp的DNA Marker作参照，凝胶成像 分析系统观察得出结果。
全文摘要
本发明涉及中药检测技术领域，是一种中药DNA检测试剂盒，它包含鉴定反应体系、阳性对照反应体系和阴性对照反应体系，鉴定反应体系与阳性对照反应体系均含有缓冲液，12.5mM dNTP，0.1mM鹿鞭引物、贝母引物和防己引物中的一种，Taq DNA聚合酶，鹿鞭、贝母和防己DNA中的一种，以及待检样本DNA，双蒸馏水；阴性对照反应体系含有缓冲液，12.5mM dNTP，0.1mM鹿鞭引物、贝母引物和防己引物中的一种，Taq DNA聚合酶，牛鞭、假贝母和伪防己DNA中的一种，双蒸馏水。中药DNA鉴定方法是设计鹿鞭、贝母、防己线粒体DNA三对特异寡核苷酸引物、人工合成、确定反应程序和结果判定等步骤，中药鉴定试剂盒能够准确鉴别中药材的特异性；鉴定方法具有简便、快速、检测结果可靠等优点。
文档编号C12Q1/68GK101434989SQ20081005164
公开日2009年5月20日 申请日期2008年12月15日 优先权日2008年12月15日
发明者孙红霞, 张丽华, 李明成, 王冰梅 申请人:北华大学