专利名称：杂色云芝漆酶在甲醇毕赤酵母中异源表达发酵工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物酶制剂领域，特别涉及一种杂色云芝漆酶在甲醇毕赤酵母中异源表 达发酵工艺。
背景技术：
漆酶是一种含铜的多酚氧化酶(p-diphenol oxidase, EC 1.10.3.2)，是木质素降解酶系的主 要成分之一。自然界中诸如杂色云芝Cbr/o^^ ^i^ico7or等白腐菌均能分泌漆酶。白腐 菌是目前最重要的漆酶产生菌，但白腐菌生长周期长、酶活低，不利于工业化生产。目前， 国内主要围绕如何提高白腐菌漆酶的产量而开展研究，采用菌种筛选和改造，培养方式及 培养条件优化来达到利用微生物生产漆酶的目的。
近年来，有关漆酶的研究越来越受到国际上的重视，由于漆酶能降解木质素，而且能 降解多种有毒化合物，所以漆酶在食品工业、造纸工业、保护环境及其他领域具有很大的 研究价值和应用潜力。因此研究漆酶的异源表达具有重要的现实意义。随着分子生物学技 术的发展， 一些漆酶基因已经从木质素降解菌中隆并进行了性质分析，为实现漆酶基因 的异源表达奠定了坚实的理论基础。19卯年Kojima首次将Con7ow Wa"/m的漆酶基因进 行了克隆并在酉良酒酵母Sacc/wra附;;cey cewv她e中表达(Kojima Y， TsukudaY， KawaiY." a/. Cloning, sequence analysis, and expression of ligninolytic phenoloxidase genes of the white-rot basidiomycete Co〃'o/ws /2frsw加[J]. Journal of Biological Chemistry, 1990， 265: 15224-15230 (白腐菌CoWo/m /z/^Wm漆酶基因的克隆，序列分析和表达，生物化学杂志))。 2003年Liu等利用P/c/z/apastor^表达了 Fo/we "g"oras的漆酶(Liu W， Chao Y， Liu S. a/. Molecular cloning and characterization of a laccase gene from the basidiomycete Fowe //gwoyws and expression in ZVcW"Applied Microbiology and Biotechnology. 2003， 63: 174-181 (白腐菌Fowe //gmmAS漆酶基因的特性和分子克隆及在巴斯德毕赤酵母户/c/z/fl /7"ston's中 表达，应用微生物和生物技术))。
白腐菌漆酶为胞外蛋白，它是由一系列同工酶组成的，典型的分子量在60-80kDa。杂 色云芝是一种典型的木材白腐菌，对木质素的降解能力较强。杂色云芝在液体培养基中产 生的漆酶同工酶主要是Lccl 。利用甲醇毕赤酵母(户/c/z/a附"/^"0//0^对杂色云芝漆酶Lccl 进行了异源表达构建基因工程菌己有报道(郭梅，白东清，蒲军，杜连祥，路福平.去自身 信号肽漆酶基因的克隆及转化甲醇毕赤酵母，2005年全国工业微生物年会论文，200'5.4: 66-70。)(郭梅，蒲军，杜连祥，路福平，白东清.杂色云芝漆酶基因(Lccl)的克隆及 在甲醇毕赤酵母中的表达，菌物学报，2005， 24 (2): 221-226)。
甲醇毕赤酵母(i^/z/awe^^o/ZcY^PMADlG,是一种新型外源基因表达系统，异源蛋 白的表达仅需少量甲醇作为诱导剂。甲醇毕赤酵母PMAD16高密度发酵时培养基的组成以及发酵条件直接影响菌体的生长和外源基因的表达。PMAD16可以甲醇为唯一碳源生长， 因此利用甲醇毕赤酵母表达外源蛋白时，往往需要生长培养基与诱导表达培养基分丌，通 常采用传统转换培养基诱导法，先用葡萄糖为碳源的BMDY培养基增殖酵母，再离心收集 菌体，然后重悬在含甲醇的BMMY培养基中诱导外源基因的表达，这种表达方法本研究也 有报道，(郭梅，路福平，蒲军，白东清，杜连祥.杂色云芝漆酶基因在甲醇毕赤酵母中表 达条件研究，食品研究与开发，2006， 27 (4): 82-84)，但这种方式操作繁琐，浪费培养基， 同时增加了染菌机会，尤其在用发酵罐大量培养酵母生产外源蛋白时极为不利，不适宜工 业化生产。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种杂色云芝漆酶在甲醇毕赤酵母中异
源表达发酵工艺，本发明的技术方案概述如下
杂色云芝漆酶在甲醇毕赤酵母中异源表达发酵工艺，包括如下歩骤
(1) 准备菌株和培养基
菌株基因工程菌甲醇毕赤酵母PMAD16/pMETaA-Zcc7;
发酵培养基15 30g/L蛋白胨，5 30g/L葡萄糖，5 20g/L酵母粉，10 25g/L酵母氮 源，3 X 10-4~7X l(T4g/L生物素，0.1 0.6mmol/L的Cu2+，用pH为4.0~7.0的浓度为100mmol/L 的磷酸盐缓冲液配制；
(2) 基因工程菌生长培养
将活化的菌种甲醇毕赤酵母PMAD16/pMETaA-丄"/接种在经灭菌的所述发酵培养基 中，在温度25 3rC下，振荡或搅拌培养15-36h;
(3) 基因工程菌的诱导培养
间歇或流加含3X1(T4~7X10—4g/L生物素的甲醇进行诱导培养，使甲醇终体积浓度为 0.2~2.0%，温度15 30。C，诱导时间96 216h，得到杂色云芝重组漆酶。
优选的是所述的发酵培养基为20 25g/L蛋白胨，10 20g/L葡萄糖，10 15g/L酵母 粉，15~23g/L酵母氮源，4xlO-4 6X10-4g/L生物素，0.2~0.4mmol/L的Cu2+，用pH为5~7 的浓度为10Ommol/L的磷酸盐缓冲液配制。
所述的012+为硫酸铜或氯化铜中的离子。
所述歩骤(2)为将活化的菌种甲醇毕赤酵母PMAD16/pMETaA-i:cc7接种在经灭菌 的所述发酵培养基中，在温度28 3(TC下，振荡或搅拌培养20-30h;
所述步骤(3)为间歇或流加含5X10^6X10—、/L生物素的甲醇进行诱导培养，使 甲醇终体积浓度为0.5~1.3%，温度18 25。C，诱导时间108~156h。
本发明的一种杂色云芝漆酶在甲醇毕赤酵母中异源表达发酵工艺，不需更换培养基， 进行直接诱导培养。确定了发酵工艺参数，建立了一种操作简便、工艺简单、污染率低、 成本低、发酵周期短、漆酶表达量高的发酵工艺。本发明为漆酶规模化生产奠定了基础。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一歩说明。实施例1
一种杂色云芝漆酶在甲醇毕赤酵母中异源表达发酵工艺，包括如下歩骤
(1) 准备菌株和培养基
菌株基因工程菌甲醇毕赤酵母PMAD16/pMETaA-Zc";由天津农学院的实验室构建 并保存(附有天津农学院提供的证明)；
发酵培养基20g/L蛋白胨，10g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，13.4g/L酵母氮源(YNB)， 4xl(T4g/L生物素，0.2mmol/L的Cu2+ (硫酸铜)，用pH为6.5的100mmol/L的磷酸盐缓冲 液配制；
(2) 基因工程菌生长培养 从固体斜面上取少量活化的菌种甲醇毕赤酵母PMAD16/pMETaA-丄cc7接种在经灭菌
的所述发酵培养基中，装液量10%，培养温度3(TC，振荡培养20h; G)基因工程菌的诱导培养
间歇加含5X1(TVL生物素的甲醇进行诱导培养，每隔24h加一次，使甲醇终体积浓 度为0.8%,诱导培养温度2(TC，诱导时间108h，过滤分离得到杂色云芝重组漆酶(粗制 剂)。再经分离与纯化得到纯化杂色云芝重组漆酶。
本发明的一种杂色云芝漆酶在甲醇毕赤酵母中异源表达发酵工艺，使发酵液中漆酶酶 活可达4500U/L (丁香醛连氮法)。
杂色云芝重组漆酶粗制剂，可直接应用于染料脱色、降解有毒污染物、纸桨漂白等， 也可再进行分离纯化得到纯化漆酶，扩大漆酶的应用范围。 漆酶活力测定
按照Galliano的测定方法进行(Galliano H， Gas Q Seris J L. Lignin degradation by 及/g/f/o/7o/"M51 Zigwoswi1 involves synergistic action of two enzyme: MnP and Laccase. Enzyme and Microbial Technology, 1991， 13: 478~482 (及/gitfo/ onw Z/gmwMS猛过氧4七 物酶和漆酶降解木质素的协作增效作用，酶和微生物技术))。3.5mL反应混合液中， 含0.2mL0.5mmol/L的丁香醛连氮液，1.5mL 50mmol/L磷酸缓冲液(pH5.8)和1.8mL 适当稀释的酶液，25'C反应5min后，于525nm处测定吸光度。 一个酶活单位定义为 在25"条件下每分钟使1 ix mol的底物转化所需的酶量。(丁香醛连氮的摩尔消光系数 s 525=65000M"1. cm—')。
实施例2
一种杂色云芝漆酶在甲醇毕赤酵母中异源表达发酵工艺，包括如下步骤 (1)准备菌株和培养基
菌株基因工程菌甲醇毕赤酵母PMAD16/pMETocA-丄c";由天津农学院的实验室构建 并保存；
发酵培养基15g/L蛋白胨，30g/L葡萄糖，5g/L酵母粉，15g/L酵母氮源(YNB)， 3xlCT4 g/L生物素，0.2mmol/L的Cu2+ (氯化铜)，用pH为4.0的100mmol/L的磷酸盐缓冲液配 制；(2)基因工程菌生长培养
从固体斜面上取少量活化的菌种甲醇毕赤酵母PMAD16/pMETaA-丄cc7接种在经灭菌 的所述发酵培养基中，装液量40%，培养温度28'C、搅拌培养24h; G)基因工程菌的诱导培养
流加含6Xl(^g/L生物素的甲醇进行诱导培养，使甲醇终体积浓度为0.2%，诱导培养 温度15°C，诱导时间216h，过滤分离得到杂色云芝重组漆酶(粗制剂)。再经分离与纯化 得到纯化杂色云芝重组漆酶。 实施例3
一种杂色云芝漆酶在甲醇毕赤酵母中异源表达发酵工艺，包括如下步骤
(1) 准备菌株和培养基
菌株基因工程菌甲醇毕赤酵母PMAD16/pMETctA-丄cc7;由天津农学院的实验室构建 并保存；
发酵培养基25g/L蛋白胨，15g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，10g/L酵母氮源(YNB)， 6xl(T4g/L生物素，0.4mmol/L的Cu2+ (硫酸铜)，用pH为7.0的100mmol/L的磷酸盐缓冲 液配制；
(2) 基因工程菌生长培养 从固体斜面上取少量活化菌种甲醇毕赤酵母PMAD16/pMETaA-丄cc7接种在经灭菌的
所述发酵培养基中，装液量30%，培养温度31"C，搅拌培养15h;
(3) 基因工程菌询诱导培养 间歇加含3Xl(^g/L生物素的甲醇进行诱导培养，每隔24h加一次，使甲醇终体积浓
度为1.3%，诱导培养温度30°C，诱导时间96h，过滤分离得到杂色云芝重组漆酶(粗制剂)。
再经分离与纯化得到纯化杂色云芝重组漆酶。
实施例4
一种杂色云芝漆酶在甲醇毕赤酵母中异源表达发酵工艺，包括如下步骤
(1) 准备菌株和培养基
菌株基因工程菌甲醇毕赤酵母PMAD16/pMETaA-丄c";由天津农学院的实验室构建 并保存；
发酵培养基30g/L蛋白胨，5g/L葡萄糖，15g/L酵母粉，25g/L酵母氮源(YNB)， 7xl0"4 g/L生物素，0.1mmol/L的Cu2+ (氯化铜)，用pH为7.0的100mmol/L的磷酸盐缓冲液配 制；
(2) 基因工程菌生长培养 从固体斜面上取少量活化菌种甲醇毕赤酵母PMAD16/pMETaA-丄c"接种在经灭菌的
所述发酵培养基中，装液量20%，培养温度25'C，搅拌培养36h;
(3) 基因工程菌的诱导培养 流加7X1(TVL生物素的甲醇进行诱导培养，使甲醇终体积浓度为2.0%，诱导培养温
度18°C，诱导时间156h，过滤分离得到杂色云芝重组漆酶(粗制剂)。再经分离与纯化得到纯化杂色云芝重组漆酶。 实施例5
一种杂色云芝漆酶在甲醇毕赤酵母中异源表达发酵工艺，包括如下步骤
(1) 准备菌株和培养基
菌株基因工程菌甲醇毕赤酵母PMAD16/pMETaA-Zcc7;由本研究天津农学院的实验 室并保存；
, 发酵培养基22g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，20g/L酵母粉，23g/L酵母氮源(YNB)， 5xlO'4g/L生物素，0.6mmol/L的Cu2+ (氯化铜)，用pH为5.0的10Ommol/L的磷酸盐缓冲 液配制；
(2) 基因工程菌生长培养 从固体斜面上取少量活化菌种甲醇毕赤酵母PMAD16/pMETccA-Zc"接种在经灭菌的
所述发酵培养基中，装液量20%，培养温度25'C，搅拌培养30h;
(3) 基因工程菌的诱导培养 流加7X10— /L生物素的甲醇进行诱导培养，使甲醇终体积浓度为0.5%，诱导培养温
度25。C，诱导时间156h，过滤分离得到杂色云芝重组漆酶(粗制剂)。再经分离与纯化得 到纯化杂色云芝重组漆酶。
权利要求
1. 杂色云芝漆酶在甲醇毕赤酵母中异源表达发酵工艺，其特征是包括如下步骤(1)准备菌株和培养基菌株基因工程菌甲醇毕赤酵母PMAD16/pMETαA-Lcc1；发酵培养基15～30g/L蛋白胨，5～30g/L葡萄糖，5～20g/L酵母粉，10～25g/L酵母氮源，3×10-4～7×10-4g/L生物素，0.1～0.6mmol/L的Cu2+，用pH为4.0～7.0的浓度为100mmol/L的磷酸盐缓冲液配制；(2)基因工程菌生长培养将活化的菌种甲醇毕赤酵母PMAD16/pMETαA-Lcc1接种在经灭菌的所述发酵培养基中，在温度25～31℃下，振荡或搅拌培养15-36h；(3)基因工程菌的诱导培养间歇或流加含3×10-4～7×10-4g/L生物素的甲醇进行诱导培养，使甲醇终体积浓度为0.2～2.0％，温度15～30℃，诱导时间96～216h，得到杂色云芝重组漆酶。
2. 根据权利要求l所述的杂色云芝漆酶在甲醇毕赤酵母中异源表达发酵工艺，其特征在于 所述的发酵培养基为20 25g/L蛋白胨，10 20g/L葡萄糖，10~15g/L酵母粉，15~23g/L酵 母氮源，4xlO-4 6X l(T4g/L生物素，0.2~0.4mmol/L的Cu2+，用pH为5~7的浓度为100mmol/L 的磷酸盐缓冲液配制。
3. 根据权利要求1或2所述的杂色云芝漆酶在甲醇毕赤酵母中异源表达发酵工艺，其特征 在于所述的Cu^为硫酸铜或氯化铜中的离子。
4. 根据权利要求l所述的杂色云芝漆酶在甲醇毕赤酵母中异源表达发酵工艺，其特征在于 所述步骤(2)为将活化的菌种甲醇毕赤酵母PMAD16/pMETaA-丄cd接种在经灭菌的所 述发酵培养基中，在温度28 30'C下，振荡或搅拌培养20-30h;
5. 根据权利要求l所述的杂色云芝漆酶在甲醇毕赤酵母中异源表达发酵工艺，其特征在于 所述歩骤(3)为间歇或流加含5X10、6X104g/L生物素的甲醇进行诱导培养，使甲醇 终体积浓度为0.5~1.3%，温度18 25。C，诱导时间108 156h。
全文摘要
本发明公开了一种杂色云芝漆酶在甲醇毕赤酵母中异源表达发酵工艺，步骤为(1)准备基因工程菌甲醇毕赤酵母PMAD16/pMETαA-Lcc1和发酵培养基；(2)将活化的菌株接种在经灭菌的发酵培养基中，在25～31℃，振荡或搅拌培养15-36h；(3)间歇或流加含生物素的甲醇进行诱导培养，使甲醇终体积浓度为0.2～2.0％，温度15～30℃，诱导时间96～216h，得到杂色云芝重组漆酶，本发明的工艺，不需更换培养基，进行直接诱导培养，确定了发酵工艺参数，建立了一种操作简便、污染率低、成本低、发酵周期短、漆酶表达量高的发酵工艺。
文档编号C12N9/04GK101544964SQ20081005252
公开日2009年9月30日 申请日期2008年3月26日 优先权日2008年3月26日
发明者李托平, 鹏 梁, 娜 王, 白东清, 军 蒲, 路福平, 梅 郭 申请人:天津农学院