专利名称:一种以石榴皮为原料酶法制备鞣花酸的方法
技术领域:
本发明涉及一种以石榴皮为原料酶法制备鞣花酸的方法。属食品、医药、化工领域。
背景技术:
鞣花斷2 , 3 , 7 , 82tet rahydroxybenzopyrano[ 5 , 4 , 3cde ]benzopyran一5 , lO—dione),是广泛存在于各种软果、坚果等植物组织中的一种天然多酚组分,它是没食子酸的二聚衍生物,是一种多酚二内酯。它不仅能以游离的形式存在,而且更多的是以縮合形式(如鞣花单宁、苷等)存在于自然界。纯鞣花酸是一种黄色针状晶体,熔点(妣啶)大于36(TC,微溶于水、醇,溶于碱、吡啶,不溶于醚。鞣花酸分子式CmH60s,分子量为302,其结构如下
、o
近十年来,由于发现了鞣花酸的抗突变、抗癌变效应,以及对化学致癌物质的抑制作用,引起了人们广泛的关注。鞣花酸的制备方法主要有以下几种方法
一种是从植物中提取鞣花酸。自然界中,红木莓、草莓、石榴以及蕨类等植物中含有少量鞣花酸(1 %)。目前,国际上约有四五家工厂在以草莓、石榴为原料,可生产出含量为5 %左右的天然鞣花酸提取物,用于食品添加剂;用此工艺可生产高纯度的鞭花酸,但由于原料成本较高、且原料中鞣花酸含量的限制而实际意义不大。
一种是通过倍酸(或其酯)的氧化聚合。没食子酸在过氧化物酶的氧化作
用下,(见Nrusingha C.Mishra and Barry Gold. Synthesis of 13c-and 14c-labrleddllagic acid[J]. Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals, 1990,8: 927-94)其主要产物是鞣花酸。此工艺过程中,鞣花酸的产率为20% 30%。但没食子酸(酯)的制备过程繁琐复杂,酶也需要精制纯化,而且产物中还有一种未知的醌类物质,其与鞣花酸的比例为l : 2.4,给产品的分离纯化带来了一定的困难,目前较少用此法进行鞣花酸的生产。
微生物法生产鞣花酸是利用橡碗单宁为原料,在发酵过程中产生鞣花酸,由于鞣花酸不溶于水,发酵过程中有大量的菌丝体产生,并且这种方法反应时间长,为后续的分离纯化带来了很大的困难。也不易于得到高纯度的鞣花酸。
发明内容
本发明的目的是提供一种以石榴皮为原料酶法制备鞣花酸的方法。通过发酵获得含降解鞣花单宁的酶的菌体,经过超声破碎,得到粗的单宁酶,与石榴皮中提取的鞣花单宁发生酶促反应,分离纯化获得纯度较高的鞣花酸。实现降低成本,废物利用,提高鞣花酸产量和纯度的目的。
本发明的以石榴皮为原料酶法制备鞣花酸的方法,通过可降解鞣花单宁的单宁酶与輮花单宁进行酶促反应,得到鞣花酸粗产品,经溶剂结晶纯化获得纯鞣花酸,具体步骤和条件为
A鞣花单宁的提取
将烘干的石榴皮粉碎后,加入到体积浓度为20 60%的乙醇水溶液中,置于功率为80-100W的超声波作用下超声处理2-3次,每次25-40分钟,得到鞣花单宁的乙醇水溶液,浓縮回收乙醇后,得到鞣花单宁浓縮液;
B单宁酶的发酵培养
将黑曲霉Aspergillus niger3.316接种于发酵种子培养基中,25-3(TC下培
5养20-24小时,移至产酶培养基中,25-3(TC下培养4-6天,离心并用去离子 水洗涤,获得含单宁酶的菌体,加入pH-5.0的柠檬酸缓冲液后得到菌悬液, 菌悬液于冰浴中在功率400-600W的超声波作用下进行20-30分钟超声破碎, 得到粗的单宁酶;
C酶促转化反应
将步骤A得到的鞣花单宁浓縮液,加水稀释至原来体积的1-2倍,用 NaOH水溶液调节pH至5.0-5.5,将步骤B得到的粗酶液加入其中,粗酶液 与稀释后的鞣花单宁溶液的体积比为1: 2-3, 25-3(TC下酶促转化反应40-48 小时,反应液经过滤,得到粗鞣花酸产品;
D溶剂结晶纯化
将步骤C得到的鞣花酸粗产品加入甲醇,在70 80。C温度下萃取3 9 小时后,将萃取液浓縮至饱和,降至室温结晶,反应液过滤后,滤饼经水洗、 干燥,得到淡黄色鞣花酸产品,纯度为95%以上。
所述的发酵培养基的组成和含量是NaN03 1.5-2.5 g/1 , K2HP04 0.5-1.5g/l, MgS04-7H20 0.4-0.8 g/l, KC1 0.4-0.8 g/l, FeS04 0,008-0.015 g/l, 蔗糖25-35 g/l,其余为水。
所述的产酶培养基的组成和含量为鞣花单宁10-16g/l,KH2PO40.5-1.5 g/l, K2HPO40.5-1.5g/l, NaN031.5-2.5 g/l, KC1 0.4-0.8 g/l, MgS04'7H20 0.4-0.8 g/l, FeS04 0.008-0.015 g/1 ,乳糖5-15g/1,吐温-80 1.5-3ml/l,用NaOH水溶液调节 pH值为4-4.5。
为了提高产品的纯度在步骤D的溶剂结晶纯化中,萃取分二至三次完成, 每次1 3小时。
本发明的方法实质是利用酶的催化效率高,选择性强,作用条件温和等 特点,通过发酵并提取可降解鞣花单宁的单宁酶后,与鞣花单宁发生酶促反 应生成鞣花酸,经分离纯化后获得高纯度的鞣花酸。
本发明的优点是工艺简单,制备过程绿色化,三废排放少,适合大规模的生产,产品品质好。我国是石榴种植大国,其果皮除被部分用于中药材 以外,大部分都被人们抛弃,造成了很大的浪费。本发明以石榴皮为原料, 原材料成本低,可提高农产品的附加值。本发明采用酶法生产鞣花酸,由于 酶的反应条件温和,无需高温,高压等操作,改善了生产环境,大大节约化 学物质的消耗量,且三废污染小,容易治理。采用酶促反应,其特异性高, 专一性的降解鞣花单宁中的酯键,具有转化效率高、反应时间短,副产物少 的特点。
具体实施例方式
A鞣花单宁的提取
将烘干的80千克石榴皮粉碎后,加入到600L体积浓度为40%的乙醇的 水溶液中,于功率80W的超声波作用下,超声处理25分钟,取出收集滤液, 剩余的残渣再重复上述超声处理二次,得到的鞣花单宁的乙醇水溶液,浓縮 回收乙醇后,得到鞣花单宁浓縮液240L。 B单宁酶的发酵培养
发酵种子培养基的组份和含量为NaN03 2 g/l, K2HP04 lg/1 , MgS04.7H20 0.6 g/l, KC10.6g/1, FeS04 0.01 g/l,蔗糖30g/l,其余为水。灭 菌后,立即加入黑曲霉Aspergillus niger 3.316,在30。C, 165rpm下摇床培养 24小时,以5%接种量移至产酶培养基中,产酶培养基的组份和质量含量 鞣花单宁I6g/1, KH2P04 1 g/l, K2HP04 1 g/l, NaN03 2 g/l, KC1 0.6 g/l, MgS04'7H20 0.6g/l, FeS04 0.01 g/l,乳糖10g/l,吐温-80 2ml,用5mol/L 的NaOH溶液调节pH值为4。在28。C, 165rpm下摇床培养4天,离心并用 去离子水洗涤至洗出液为pH=7,收集菌体,按每克湿菌体5ml的比例加入 0.01mol/L柠檬酸缓冲液(pH=5.0)后得到菌悬液,菌悬液于400w的功率下 于冰浴中进行破碎,破碎时间为30分钟,离心,得到的上清液为粗酶液。 C转化反应将步骤A得到的鞣花单宁浓縮液,加水稀释至350L,用5mol/L的NaOH 调节pH:5.2,将步骤B得到的粗酶液加入其中,粗酶液与稀释后的鞣花单宁 溶液的体积比为l: 3。在3(TC, 90rpm下用摇床转化反应48小时。反应液 经过滤,得到粗鞣花酸。 D溶剂结晶
将得到的粗产品用甲醇75t:萃取,萃取次数为3次,每次1小时,固液 分离,合并液体,蒸发浓縮,冷却结晶,过滤晶体,干燥,得到淡黄色鞣花 酸粉末。原料含鞣花单宁为10.13%,得率为原料的4.1% ,纯度为96.5%。
实施例2:
A鞣花单宁的提取
将烘干的80千克石榴皮粉碎后,加入到600L体积浓度为60%的乙醇水 溶液中,功率100W的超声波作用下,超声处理30分钟,取出收集滤液,剩 余的残渣再重复上述超声处理二次,得到鞣花单宁的乙醇水溶液,浓縮回收 乙醇后,得到鞣花单宁浓縮液200L。 B单宁酶的发酵培养
所述的发酵种子培养基的组份和含量为NaN03 1.5g/l, K2HP04 0.5g/l, MgSO4.7H2O0.5g/l, KC10.5g/1, FeS04 0.01 g/l,蔗糖25 g/l,其余为水。灭 菌后,立即加入黑曲霉Aspergillus niger 3.316,在28。C, 165rpm下摇床培养 22小时,以5%接种量移至产酶培养基中,产酶培养基的组份和含量鞣花 单宁10g/l, KH2PO40,5g/l, K2HPO40.5g/l, NaN03 1.5 g/l, KC1 0.4 g/l, MgSO4.7H2O0.4g/l, FeS04 0.008 g/l,乳糖5g/l,吐温-80 3ml/l,用5mol/L的 NaOH调节pH值为4.3。在28。C, 165rpm下摇床培养6天,离心并用生理 盐水洗涤至洗出液为pH=7,收集菌体,按每克湿菌体5ml的比例加入O.lmol/L 柠檬酸缓冲液后(pH=5.0)得到菌悬液,菌悬液于500W的功率下于冰浴中 进行破碎,破碎时间为25分钟,离心,得到的上清液为粗酶液。 C转化反应
8将步骤A得到的鞣花单宁浓縮液,加水稀释至300L,用5mol/L的NaOH 调节pH-5.5,将步骤B得到的粗酶液加入其中,粗酶液与稀释后的鞣花单宁 溶液的体积比为l: 2.5。在28r, 100rpm下用摇床转化反应40小时。反应 液经过滤,得到粗鞣花酸。 D溶剂结晶
将得到的粗产品用甲醇75'C萃取,萃取次数为2次,每次2小时,固液 分离,合并液体,蒸发浓縮,冷却结晶,过滤晶体,干燥,得到淡黄色鞣花 酸粉末,原料含鞣花单宁为11.5%,得率为原料的4.3%,纯度为98%。
实施例3:
A鞣花单宁的提取
将烘干的80千克石榴皮粉碎后,加入到600L体积浓度为50%的乙醇水 溶液中,于功率90W的超声波作用下,超声处理40分钟,取出收集滤液, 剩余的残渣再重复上述超声处理一次,得到的单宁酸的乙醇水溶液浓縮回收 乙醇后,得到鞣花单宁浓縮液200L。 B单宁酶的发酵培养
发酵种子培养基的组份和含量为NaN03 2.5 g/l, K2HP041.5g/l, MgS04.7H20 0.8g/l, KCL0.8g/1, FeSO40.015g/l,蔗糖35 g/l, 其余为水。 灭菌后,立即加入黑曲霉Aspergillus niger 3.316,在25。C, 165rpm下摇床培 养24小时,以5%接种量移至产酶培养基中,产酶培养基的组份和含量:鞣花 单宁13g/l, KH2P04 1.5g/l, K2HP04 1.5 g/l, NaN032.5 g/l, KC1 0.8 g/l, MgSO4.7H2O0.8g/l, FeSO40.015g/l,乳糖15g/l,吐》显-80 1.5ml/l,用5mol/L 的NaOH调节pH值为4.5。在25。C, 165rpm下摇床培养5天,离心并用生 理盐水洗涤至洗出液为pH=7,收集菌体,按每克湿菌体5ml的比例加入 0.05mol/L拧檬酸缓冲液(pH=5.0)后得到菌悬液,菌悬液于600W的功率下 于冰浴中进行破碎,破碎时间为20分钟,离心,得到的上清液为粗酶液。 C转化反应
9将步骤A得到的鞣花单宁浓縮液,加水稀释至400L,用5mol/L的NaOH 调节pH-5.0,将步骤B得到的粗酶液加入其中,粗酶液与稀释后的鞣花单宁 溶液的体积比为l: 2。在25'C, 110rpm下用摇床转化反应44小时。反应液 经过滤,得到粗鞣花酸。 D溶剂结晶
将得到的粗产品用甲醇75。C萃取,萃取次数为3次,每次2小时,固液 分离,合并液体,蒸发浓縮,冷却结晶,过滤晶体,干燥,得到淡黄色鞣花 酸粉末,原料含鞣花单宁为9.1%,得率为原料的3.9%,纯度为98.8%。
权利要求
1. 一种以石榴皮为原料酶法制备鞣花酸的方法,通过单宁酶与鞣花单宁的酶促反应,得到鞣花酸粗产品,经溶剂结晶纯化获得纯鞣花酸,具体步骤和条件为A鞣花单宁的提取将烘干的石榴皮粉碎后,加入到体积浓度为20~60%的乙醇水溶液中,置于功率为80-100W的超声波作用下超声处理2-3次,每次25-40分钟,得到鞣花单宁的乙醇水溶液,浓缩回收乙醇后,得到鞣花单宁浓缩液;B单宁酶的发酵培养将黑曲霉Aspergillus niger3.316接种于发酵培养基中,25-30℃下培养20-24小时,移至产酶培养基中,在25-30℃下培养4-6天,离心并用去离子水洗涤,获得含单宁酶的菌体,加入pH=5.0的柠檬酸缓冲液得到菌悬液,菌悬液于冰浴中在功率400-600W的超声波作用下进行超声破碎,破碎时间为20-30分钟,得到单宁酶的粗酶液;C酶促转化反应将步骤A得到的鞣花单宁浓缩液,加水稀释至原来体积的1-2倍,用NaOH水溶液调节pH至5.0-5.5,将步骤B得到的粗酶液加入其中,粗酶液与稀释后的鞣花单宁溶液的体积比为1∶2-3,在25-30℃下酶促转化反应40-48小时,反应液经过滤,得到鞣花酸粗产品;D溶剂结晶纯化将步骤C得到的鞣花酸粗产品加入甲醇,在70~80℃温度下萃取3~9小时后,将萃取液浓缩至饱和,降至室温结晶,反应液过滤后,滤饼经水洗、干燥,得到淡黄色鞣花酸产品。
2.根据权利要求1的方法,其特征是发酵种子培养基的组成和含量 是NaN03 1.5-2.5 g/l, K2HP04 0.5画1.5g/1, MgS04.7H20 0.4-0.8 g/l, KC1 0.4-0.8g/l, FeS04 0.008-0.015 g/1 ,蔗糖25-35 g/1 ,其余为水。
3. 根据权利要求1的方法,其特征是产酶培养基的组成和含量为鞣花单宁10-16g/l, KH2P04 0.5-1.5 g/l, K2HP04 0.5-1.5g/l, NaN031.5-2.5 g/l, KCI 0.4-0.8 g/l, MgS04.7H20 0.4-0.8 g/l, FeS04 0.008-0.015 g/l,乳糖5画15g/1, 吐温-80 1.5-3ml/l,用NaOH水溶液调节pH值为4-4.5。
4. 根据权利要求l的方法,其特征是步骤D的溶剂结晶纯化中,萃 取分二至三次完成,每次1 3小时。
全文摘要
本发明涉及一种以石榴皮为原料酶法制备鞣花酸的方法。属食品、医药、化工领域。本发明以我国大量被人们废弃的石榴皮为原料提取鞣花单宁,利用酶的催化效率高,选择性强,作用条件温和等特点,通过发酵,获得含降解鞣花单宁的单宁酶,与鞣花单宁发生酶促反应,生成鞣花酸,经过溶剂结晶纯化,获得价格昂贵的医用高纯度的鞣花酸。本发明可降低原料成本,废物利用,并提高鞣花酸产量和纯度,适合大规模的生产。
文档编号C12P17/18GK101481714SQ20081005600
公开日2009年7月15日 申请日期2008年1月11日 优先权日2008年1月11日
发明者倩 张, 艳 程, 袁其朋 申请人:北京化工大学