专利名称：：一种生产甘露聚糖酶的方法及其专用固定化生物膜的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种生产甘露聚糖酶的方法及其专用固定化生物膜。
背景技术：
：甘露聚糖酶作为一种半纤维素酶，是水解甘露聚糖最主要也是最关键的酶，可广泛应用于食品、造纸、饲料、纺织、印染等行业，具有巨大的应用前景和生产价值。目前甘露聚糖酶的生产方式主要是游离细胞的液体发酵和固态发酵，国内有关甘露聚糖酶产量的报道是:32'C下液体培养芽孢杆菌M-21，其产酶水平为1487U/mL(周芳等，食品与发酵工业，2007Vol.33No.2);在适宜条件下发酵罐培养欧文氏杆菌变异菌株CXJZll-Ol，产酶水平为3050U/mL(成莉风等，中国麻业科学，2007Vol.29No.5);固态发酵黑曲霉LW-1，产酶水平为24879U/g(李剑芳等，食品与生物技术学报，2007Vol.26No.4)。嗜热枯草芽孢杆菌WY45和WY34是甘露聚糖酶的高产菌株，在5(TC条件下液体发酵培养，其产甘露聚糖酶的能力分别为2800U/mL(柴萍萍等，中国农业大学学报，2005Vol.10No.3)和1105U/mL(Jiangetal.，CarbohydratePolymers,2006Vol.66No.1)。上述发酵方法的缺点是产酶水平低、提取方式复杂及生产成本高。
发明内容本发明的目的是提供一种固定化生物膜。本发明所提供的固定化生物膜是将产甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌固定在微孔滤膜上得到的。所述产甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌可为枯草芽孢杆菌WY34或WY45。所述微孔滤膜可为聚醚砜膜、尼龙6膜、醋酸纤维素膜或聚丙烯膜。本发明中所使用的微孔滤膜的孔径可为0.2—0.4um，厚度为100-160um。所述微孔滤膜在固定所述产甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌前，进行如下活化将所述微孔滤膜在8_12%(体积百分含量)的甲醛溶液中，在35—50X:浸泡3—5h。本发明的另一个目的是提供一种生产甘露聚糖酶的方法。本发明所提供的生产甘露聚糖酶的方法是培养固定在所述固定化生物膜上的产甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌，得到甘露聚糖酶。所述微孔滤膜的单面表面积与所述培养的培养基的体积的比例为lcm2:lml-lcm2:8mL，具体为lcm2:4mL。所述培养的培养基可按照如下方法配制魔芋粉10—30g、酵母提取物3—7g、胰蛋白胨6—12g、KH2P043—7g、MgS04.7H200.4—0.8g，加水到1000ml，自然pH值。所述培养具体可为在40—5(TC进行旋转半径为12mm、转速为150—220rpm的振荡培养。本发明中的固定在滤膜上的固定化细胞可进行批次培养，单批次培养后的固定化生物膜经无菌水清洗后，可进行4一8次连续使用，且产酶水平保持在游离细胞产酶水平之上，批次培养固定化枯草芽孢杆菌WY34细胞平均产酶水平为1800—3500U/mL，是游离细胞产酶水平的1.1一2.0倍；批次培养固定化枯草芽孢杆菌WY45细胞平均产酶水平为3025—3990U/mL，是游离细胞产酶水平的1.l一l.4倍。本发明利用膜固定化细胞生产甘露聚糖酶的方法具有操作简单、条件温和、固定效果良好的优点，且产物易分离，并能显著提高细胞的产酶水平，降低生产成本。图1为聚醚砜膜固定化细胞培养18h后7000倍下的电镜图图2为聚醚砜膜固定化细胞与游离细胞的产酶情况图3为尼龙6膜固定化细胞培养18h后7000倍下的电镜图图4为尼龙6膜固定化细胞与游离细胞的产酶情况图5为醋酸纤维素膜固定化细胞与游离细胞的产酶情况图6为聚丙烯膜固定化细胞与游离细胞的产酶情况具体实施例方式实施例1、聚醚砜膜固定化枯草芽孢杆菌产甘露聚糖酶下述步骤中所用的发酵培养基按照如下方法配制魔芋粉(武汉市清江魔芋制品有限公司，型号1A级魔芋精粉)30g、酵母提取物(英国0xoid公司，货号OXOIDCM0019B)7g、月夷蛋白胨(英国0xoid公司，货号OXOIDLP0042B)12g、KH2P047g、MgS04.7H200.8g，加水到1000mL，自然pH。发酵培养温度为50°C、转速为220rpm(旋转半径12mm)。1、膜的活化将孔径为0.4um，厚度为100um的聚醚砜膜(北京北化黎明膜分离技术有限4公司，PES)在45'C条件下浸泡于浓度为12%(体积百分含量)的甲醛溶液中，浸泡时间为3h。2、固定化细胞以枯草芽孢杆菌WY34(ZhengqiangJiang，YunWei,DaoyiLi,PingpingChai，LiteLi,IsaoKusakabe.High-levelproduction,purificationandcharacterizationofathermostableb-mannanasefromthenewlyisolatedBacillussubtilisWY34.CarbohydratePolymers,2006,66(1):88-96.)作为酶源，将枯草芽孢杆菌WY34活化后接入装有20mL新鲜发酵培养基的IOOmL三角瓶中，于50。C条件下220rpm连续培养16-24h，加入活化后的聚醚砜膜，使膜单面的表面积与发酵液的体积比例为1cm2:lmL，于50。C条件下220rpm培养16-24h，直至膜吸附细胞的量为0.l—O.3mg/cra2(以菌体干重计)。得到固定了枯草芽孢杆菌WY34的聚醚砜膜。聚醚砜膜固定枯草芽孢杆菌WY34的效果如图1所示。3、利用膜固定化细胞生产甘露聚糖酶将固定了枯草芽孢杆菌WY34的聚醚砜膜取出，用无菌水反复冲洗以去除膜表面吸附不牢的菌体及其他杂质，将清洗后的膜转入新鲜的上述发酵培养基中(100mL三角瓶，装液量为20mL)，于50。C条件下220rpm(旋转半径12mm)连续培养4d，完成第一批次固定化细胞培养。第一批次培养完成后，将聚醚砜膜取出用无菌水清洗，再将膜转移到新鲜的上述发酵培养基中(100raL三角瓶，装液量为20mU，于50'C条件下220rpm(旋转半径12mm)连续培养4d，完成第二批次固定化细胞培养。依次类推，在相同条件下重复培养，完成第三、四、五、六、七、八批次固定化细胞培养。同时设置以下游离细胞对照将枯草芽孢杆菌WY34活化后接入装有20mL新鲜发酵培养基的100mL三角瓶中，于50。C条件下220rpm连续培养16-24h，准确吸取0.2mL发酵液加入到新鲜的上述液体培养基中(100mL三角瓶，装液量为20mL)，于50。C条件下220rpm(旋转半径12mm)连续培养4d，完成第一批次游离细胞培养。第一批次游离细胞培养完成后，吸取0.2mL第一批次游离细胞的发酵液加入到新鲜的上述液体培养基中(100mL三角瓶，装液量为20mL)，于50T条件下220rpm(旋转半径12mm)连续培养4d，完成第二批次游离细胞培养。依次类推，在相同条件下重复培养，完成第三、四、五、六、七、八批次游离细胞培养。5将发酵液10000rpm离心10min，取上清即得到粗酶液，采用DNS法测定上清液中甘露聚糖酶的活力，具体测定方法如下以0.5%(质量百分含量)的槐豆胶溶液为底物(将槐豆胶溶于0.05mol/LpH6.0的柠檬酸钠缓冲液中)，0.9raL0.5%(质量百分含量)的槐豆胶溶液中加入O.lmL上述得到的经适当稀释的酶液，60'C条件下反应IOmin，DNS法测定反应液中的还原糖量；同时以D-甘露糖(美国Amresco公司，货号AmrescoJ443)为标准。在上述条件下，反应1min产生1umol甘露糖所需的酶量为一个酶活单位(U)。实验设三次重复，聚醚砜膜固定化细胞与游离细胞的产酶情况如图2所示，图2中数值为三次重复的平均值土标准差。结果表明，聚醚砜膜固定化细胞经七批次半连续培养，单批次平均产酶水平为2000—3500U/mL(图2中的纵坐标是相对酶活性，以第一批次游离细胞的酶活性为100°%，第一批次游离细胞的酶活性为1758U/mL)，是游离细胞产酶水平的1.2—2.0倍。实施例2、尼龙6膜固定化枯草芽孢杆菌产甘露聚糖酶下述步骤中所用的发酵培养基按照如下方法配制魔芋粉(武汉市清江魔芋制品有限公司，型号1A级魔芋精粉)10g、酵母提取物(英国Oxoid公司，货号OXOIDCM0019B)3g、胰蛋白胨(英国Oxoid公司，货号OXOIDLP0042B)6g、KH2P043g、MgS04.7H200.4g，加水到1000ml，自然pH。发酵培养温度为40°C、转速为150rpm(旋转半径12mm)。1、膜的活化将孔径为0.2um，厚度为160um的尼龙6膜(北京北化黎明膜分离技术有限公司，JN6)在35匸条件下浸泡于浓度为8%(体积百分含量)的甲醛溶液中，浸泡时间为5h。2、固定化细胞以枯草芽孢杆菌WY34(ZhengqiangJiang,YunWei,DaoyiLi，PingpingChai，LiteLi，IsaoKusakabe.High-levelproduction,purificationandcharacterizationofathermostableb-mannanasefromthenewlyisolatedBacillussubtilisWY34.CarbohydratePolymers,2006,66(l):88-96.)作为酶源，将枯草芽孢杆菌WY34活化后接入装有20mL新鲜发酵培养基的IOOmL三角瓶中，于4(TC条件下150rpm连续培养16-24h，加入活化后的尼龙6膜，使膜单面的表面积与发酵液的体积比例为1cm2:8raL，于4(TC条件下150rpm培养16-24h，直至膜吸附细胞的量为0.1—0.3mg/cm2(以菌体干重计)。得到固定了枯草芽孢杆菌WY34的尼龙6膜。尼龙6膜固定枯草芽孢杆菌WY34的效果如图3所示。3、利用膜固定化细胞生产甘露聚糖酶将固定了枯草芽孢杆菌WY34的尼龙6膜取出，用无菌水反复冲洗以去除膜表面吸附不牢的菌体及其他杂质，将清洗后的膜转入新鲜的上述发酵培养基中(100mL三角瓶，装液量为20mL)，于40。C条件下150rpm(旋转半径12mm)连续培养5d，完成第一批次固定化细胞培养。第一批次培养完成后，将尼龙6膜取出用无菌水清洗，再将膜转移到新鲜的上述发酵培养基中(100mL三角瓶，装液量为20mL)，于40'C条件下150rpm(旋转半径12mm)连续培养5d，完成第二批次固定化细胞培养。依次类推，在相同条件下重复培养，完成第三、四、五、六、七批次固定化细胞培养。同时设置以下游离细胞对照将枯草芽孢杆菌WY34活化后接入装有20mL新鲜发酵培养基的IOOmL三角瓶中，于40。C条件下150rpm连续培养16-24h，准确吸取0.2mL发酵液加入到新鲜的上述液体培养基中(100mL三角瓶，装液量为20mL)，于40。C条件下150rpm(旋转半径12mm)连续培养5d，完成第一批次游离细胞培养。第一批次游离细胞培养完成后，吸取0.2mL第一批次游离细胞的发酵液加入到新鲜的上述液体培养基中(100mL三角瓶，装液量为20mL)，于40"C条件下150rpm(旋转半径12mm)连续培养5d，完成第二批次游离细胞培养。依次类推，在相同条件下重复培养，完成第三、四、五、六、七批次游离细胞培养。将发酵液10000rpm离心10min，取上清即得到粗酶液，采用DNS法测定上清液中甘露聚糖酶的活力，具体测定方法如下以0.5%(质量百分含量)的槐豆胶溶液为底物(将槐豆胶溶于0.05raol/LpH6.0的柠檬酸钠缓冲液中)，0.9mL0.5%(质量百分含量)的槐豆胶溶液中加入0.lmL上述得到的经适当稀释的酶液，60°〇条件下反应10min，DNS法测定反应液中的还原糖量；同时以D-甘露糖(美国Amresco公司，货号AmrescoJ443)为标准。在上述条件下，反应1min产生1Pmol甘露糖所需的酶量为一个酶活单位(U)。实验设三次重复，尼龙6膜固定化细胞与游离细胞的产酶情况如图4所示，图4中数值为三次重复的平均值士标准差。结果表明，尼龙6膜固定化细胞经六批次半连续培养，单批次平均产酶水平为2000—3000U/mL(图4中的纵坐标是相对酶活性，以第一批次游离细胞的酶活性为100%，第一批次游离细胞的酶活性为1766U/mL)，是游离细胞产酶水平的1.2—1.7倍。实施例3、醋酸纤维素膜固定化枯草芽孢杆菌产甘露聚糖酶下述步骤中所用的发酵培养基按照如下方法配制魔芋粉(武汉市清江魔芋制品有限公司，型号1A级魔芋精粉)20g、酵母提取物(英国0xoid公司，货号OX。IDCM0019B)5g、胰蛋白胨(英国0xoid公司，货号0X0IDLP0042B)9g、KH2P045g、MgS04.7H200.6g，加水到1000ml,自然pH。发酵培养温度为50°C、转速为200rpm(旋转半径12ram)。1、膜的活化将孔径为0.3nm，厚度为120um的醋酸纤维素膜(北京北化黎明膜分离技术有限公司，CA)在4(TC条件下浸泡于浓度为10%(体积百分含量)的甲醛溶液中，浸泡时间为4h。2、固定化细胞以枯草芽孢杆菌WY45(柴萍萍，韦赞，江正强，李里特，日下部功.芽孢杆菌(Bacillussubtilis)WY45产0-甘露聚糖酶发酵条件的优化.中国农业大学学报，2005,10(3):77-80.)作为酶源，将枯草芽孢杆菌WY45活化后接入装有20mL新鲜发酵培养基的100mL三角瓶中，于50。C条件下200rpm连续培养16-24h，加入活化后的醋酸纤维素膜，使膜单面的表面积与发酵液的体积比例为lcm2:2mL，于50""C条件下200rpm培养16-24h，直至膜吸附细胞的量为0.l—O.3mg/cm2(以菌体干重计)。得到固定了枯草芽孢杆菌WY45的醋酸纤维素膜。3、利用膜固定化细胞生产甘露聚糖酶将固定了枯草芽孢杆菌WY45的醋酸纤维素膜取出，用无菌水反复冲洗以去除膜表面吸附不牢的菌体及其他杂质，将清洗后的膜转入新鲜的上述发酵培养基中(100mL三角瓶，装液量为20mL)，于50。C条件下200rpm(旋转半径12mm)连续培养4d，完成第一批次固定化细胞培养。第一批次培养完成后，将醋酸纤维素膜取出用无菌水清洗，再将膜转移到新鲜的上述发酵培养基中(100mL三角瓶，装液量为20mL)，于50。C条件下200rpm(旋转半径12mm)连续培养4d，完成第二批次固定化细胞培养。依次类推，在相同条件下重复培养，完成第三、四、五、六批次固定化细胞培养。同时设置以下游离细胞对照将枯草芽孢杆菌WY45活化后接入装有20mL新鲜发酵培养基的IOOmL三角瓶中，于50。C条件下200rpm连续培养16-24h，准确吸取0.2mL发酵液加入到新鲜的上述液体培养基中(100mL三角瓶，装液量为20mL)，于50。C条件下200rpm(旋转半径12mm)连续培养4d，完成第一批次游离细胞培养。第一批次游离细胞培养完成后，吸取0.2mL第一批次游离细胞的发酵液加入到新鲜的上述液体培养基中(100mL三角瓶，装液量为20mL)，于50°C条件下200rpm(旋转半径12mm)连续培养4d，完成第二批次游离细胞培养。依次类推，在相同条件下重复培养，完成第三、四、五、六批次游离细胞培养。将发酵液10000rpm离心10min，取上清即得到粗酶液，采用DNS法测定上清液中甘露聚糖酶的活力，具体测定方法如下以0.5%(质量百分含量)的槐豆胶溶液为底物(将槐豆胶溶于0.05mol/LpH6.0的柠檬酸钠缓冲液中)，0.9mL0.5%(质量百分含量)的槐豆胶溶液中加入O.lraL上述得到的经适当稀释的酶液，60'C条件下反应10min，DNS法测定反应液中的还原糖量；同时以D-甘露糖(美国Amresco公司，货号AmrescoJ443)为标准。在上述条件下，反应1min产生1yraol甘露糖所需的酶量为一个酶活单位(U)。实验设三次重复，醋酸纤维素膜固定化细胞与游离细胞的产酶情况如图5所示，图5中数值为三次重复的平均值土标准差。结果表明，醋酸纤维素膜固定化细胞经五批次半连续培养，单批次平均产酶水平为3025—3850U/mL(图5中的纵坐标是相对酶活性，以第一批次游离细胞的酶活性为100%，第一批次游离细胞的酶活性为2750U/mL)，是游离细胞产酶水平的1.l一l.4倍。实施例4、聚丙烯膜固定化枯草芽孢杆菌产甘露聚糖酶下述步骤中所用的发酵培养基按照如下方法配制魔芋粉(武汉市清江魔芋制品有限公司，型号1A级魔芋精粉)30g、酵母提取物(英国Oxoid公司，货号OXOIDCM0019B)7g、胰蛋白胨(英国0xoid公司，货号OXOIDLP0042B)12g、歸047g、MgS04.7H200.8g，加水到1000mL，自然pH。发酵培养温度为45。C、转速为220rpm(旋转半径12mm)。1、膜的活化将孔径为0.4ym，厚度为140um的聚丙烯膜(北京北化黎明膜分离技术有限公司，PP)在5(TC条件下浸泡于浓度为12%(体积百分含量)的甲醛溶液中，浸泡时间为3h。2、固定化细胞以枯草芽孢杆菌WY45(柴萍萍，韦赞，江正强，李里特，日下部功.芽孢杆菌(Bacillussubtilis)WY45产e-甘露聚糖酶发酵条件的优化.中国农业大学学报，2005，10(3):77-80.)作为酶源，将枯草芽孢杆菌WY45活化后接入装有20mL新鲜发酵培养基的100mL三角瓶中，于45。C条件下220rpm连续培养16-24h，加入活化后的聚丙烯膜，使膜单面的表面积与发酵液的体积比例为1Cm2:4mL，于45'C条件下220rpm培养16-24h，直至膜吸附细胞的量为0.l—O.3mg/cm2(以菌体干重计)。得到固定了枯草芽孢杆菌WY45的聚丙烯膜。3、利用膜固定化细胞生产甘露聚糖酶将固定了枯草芽孢杆菌WY45的聚丙烯膜取出，用无菌水反复冲洗以去除膜表面吸附不牢的菌体及其他杂质，将清洗后的膜转入新鲜的上述发酵培养基中(100mL三角瓶，装液量为20mL)，于45。C条件下220rpm(旋转半径12mm)连续培养5d，完成第一批次固定化细胞培养。第一批次培养完成后，将聚丙烯膜取出用无菌水清洗，再将膜转移到新鲜的上述发酵培养基中(100mL三角瓶，装液量为20mL)，于45'C条件下220rpm(旋转半径12mm)连续培养5d，完成第二批次固定化细胞培养。依次类推，在相同条件下重复培养，完成第三、四、五批次固定化细胞培养。同时设置以下游离细胞对照将枯草芽孢杆菌WY45活化后接入装有20raL新鲜发酵培养基的100mL三角瓶中，于45。C条件下220rpm连续培养16-24h，准确吸取0.2mL发酵液加入到新鲜的上述液体培养基中(100rnL三角瓶，装液量为20mL)，于45。C条件下220rpm(旋转半径12mm)连续培养5d，完成第一批次游离细胞培养。第一批次游离细胞培养完成后，吸取0.2mL第一批次游离细胞的发酵液加入到新鲜的上述液体培养基中(lOOmL三角瓶，装液量为20mL)，于45'C条件下220rpm(旋转半径12ram)连续培养5d，完成第二批次游离细胞培养。依次类推，在相同条件下重复培养，完成第三、四、五批次游离细胞培养。将发酵液10000rpm离心10min，取上清即得到粗酶液，釆用DNS法测定上清液中甘露聚糖酶的活力，具体测定方法如下以0.5%(质量百分含量)的槐豆胶溶液为底物(将槐豆胶溶于0.05mol/LpH6.0的柠檬酸钠缓冲液中)，0.9mL0.5%(质量百分含量)的槐豆胶溶液中加入0.1mL上述得到的经适当稀释的酶液，60r条件下反应10min，DNS法测定反应液中的还原糖量；同时以D-甘露糖(美国Amresco公司，货号AmrescoJ443)为标准。在上述条件下，反应1min产生1umol甘露糖所需的酶量为一个酶活单位(U)。10实验设三次重复，聚丙烯膜固定化细胞与游离细胞的产酶情况如图6所示，图6中数值为三次重复的平均值士标准差。结果表明，聚丙烯膜固定化细胞经四批次半连续培养，单批次平均产酶水平为2970—3510U/mL(图6中的纵坐标是相对酶活性，以第一批次游离细胞的酶活性为100%,第一批次游离细胞的酶活性为2700U/mL)，是游离细胞产酶水平的1.1一1.3倍。权利要求1、一种固定化生物膜，是将产甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌固定在微孔滤膜上得到的。2、根据权利要求l所述的固定化生物膜，其特征在于所述产甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌WY34或WY45。3、根据权利要求l所述的固定化生物膜，其特征在于所述微孔滤膜为聚醚砜膜、尼龙6膜、醋酸纤维素膜或聚丙烯膜。4、根据权利要求3所述的固定化生物膜，其特征在于所述微孔滤膜的孔径为O.2—0.4um，厚度为100-160ym。5、根据权利要求1至4中任一所述的固定化生物膜，其特征在于所述微孔滤膜在固定所述产甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌前，进行如下活化将所述微孔滤膜在体积百分含量为8_12%的甲醛溶液中，在35—50。C浸泡3—5h。6、一种生产甘露聚糖酶的方法，是培养固定在所述固定化生物膜上的产甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌，得到甘露聚糖酶。7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述固定化生物膜的单面表面积与所述培养所用的培养基的体积的比例为1cm2:lmL—lcm2:8mL，优选为1cm2:4raL。8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述培养的培养基按照如下方法配制魔芋粉10—30g、酵母提取物3—7g、胰蛋白胨6—12g、K戰3—7g、MgSO.,.7H200.4—0.8g，加水到1000mL，自然pH。9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述培养为在40—50t:进行、旋转半径为12腿、转速为150—220rpm的振荡培养。全文摘要本发明公开了一种生产甘露聚糖酶的方法。本发明所提供的生产甘露聚糖酶的方法是将产甘露聚糖酶的微生物固定在微孔滤膜上，加入培养基，进行培养，得到甘露聚糖酶。本发明的固定化细胞可进行批次培养，单批次培养后的滤膜经无菌水清洗后，可进行4-8次连续使用，且产酶水平保持在游离细胞产酶水平之上。批次培养固定化WY34细胞平均产酶水平为1800-3500U/mL，是游离细胞产酶水平的1.1-2.0倍；批次培养固定化WY45细胞平均产酶水平为3025-3990U/mL，是游离细胞产酶水平的1.1-1.4倍。本发明方法具有操作简单、条件温和、固定效果良好的优点，且产物易分离，并能显著提高细胞的产酶水平，降低生产成本。文档编号C12N11/08GK101492667SQ20081005652公开日2009年7月29日申请日期2008年1月21日优先权日2008年1月21日发明者丛倩千,武爱民,江正强,闫巧娟,赟韦申请人:中国农业大学