专利名称：：辅助筛选籼稻和粳稻的方法
技术领域：
：本发明涉及一种辅助筛选籼稻和粳稻的方法。技术背景栽培稻是世界上最重要的粮食作物之一，在其11，500多年的栽培稻驯化历史中为适应不同的农业生态环境，栽培稻形成了丰富的遗传多样性和明显的遗传分化，产生了籼稻(众o7c3)和粳稻Opow'cs)两个不同的生态型(MorishimaH，OkaHI.Phylogeneticdifferentiationofcultivatedrice.XXII.NumerableevaluationoftheIndica-Japonicadifferentiation.JapaneseJournalofBreeding,1981，31:402-413;GlaszmannJ"C.IsozymesandclassificationofAsianricevarieties.TheoreticalandAppliedGenetics，1987，74:21-30;WangZY，TanksleySD.Restrictionfragmentlengthpolymorphisminasa^VaL.Ge画e，1989，32:1113-1118;BlairMW，Pa腿d0，McCouchSR.Inter-simplesequencerepeat(ISSR)amplificationforanalysisofmicrosatellitemotiffrequencyandfingerprintinginrice(Orwssa"raL.).TheoreticalandAppliedGenetics，1999,98(5):780-782.))。它们之间在许多形态和生理性状上存在着明显的差异(MorishimaH，OkaHI.Phylogeneticdifferentiationofcultivatedrice.Numericalevaluationsofthe_//7<y_z'c<g-j'spc/7iC3differentiation.J"pn.J".Breed,1981，31:402-413;WANGXiang-Kun,CHENGKan-Sheng,靈NNai-Wei，LU0un，LUYi-Xuan，LIUGuang-Rong.StudyontwoimportantricetypesconcerningtheoriginanddifferentiationofAsiancultivatedrice.ActaGeneticaSinica，1987，14(4):262-270.)。然而，水稻的籼粳分化是一个缓慢的进化过程，在许多水稻地方种中存在着典型的籼稻或粳稻，但也存在籼粳分化不明显的中间型，对于这些类型很难用传统的方法来鉴定，更难研究水稻的籼粳分化程度。因此，开发新型的Marker基因及其分子标记来准确鉴定秈稻和粳稻，并用其研究水稻的进化非常必要。过氧化物酶基因是一类与叶片衰老有关的基因(M.KarandD.Mishra，Catalase，Peroxidase,andPolyphenoloxidaseActivitiesduringRiceLeafSenescence,PlantPhysiology.57(1976)315-319.)，在植物抵御生物胁迫过程中起着重要作用(J.M.Chittoor，丄E.LeachandF.F.White,DifferentialinductionofaperoxidasegenefamilyduringinfectionofricebyXanthomonasoryzaepv.oryzae.MolecularPlantMicrobeInteractions.10(1997)861-871.)。
发明内容本发明的目的是提供一种辅助筛选秈稻和粳稻的方法。本发明所提供的辅助筛选籼稻和粳稻的方法，是检测待测水稻中是否缺失GenBankaccessionAP003771中自5'末端第71046-72062位核苷酸序列，若缺失，则待测水稻为候选籼稻，若不缺失则待测水稻为候选粳稻。其中，所述缺失具体可通过PCR扩增进行检测。所述PCR扩增具体可扩增包含GenBankaccessionAP003771中自5，末端第71046-72062位核苷酸序列的片段。所述PCR扩增检测中所用的上游或下游引物可与GenBankaccessionAP003771中自5，末端第71046-72062位核苷酸序列相同或互补。所述PCR扩增中所用的引物，还可为如下的引物:其中一条引物序列如序列表中序列1所示，另一条引物序列如序列表中序列2所示。实际应用中，可采用的一种具体辅助筛选籼稻和粳稻的方法如下以待测水稻的基因组DNA为模板，用核苷酸序列分别是序列表中序列1和序列2的一对引物进行PCR扩增，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，若所述扩增产物在琼脂糖凝胶上显示为1200-2000bp之间的一条带，则待测水稻为候选粳稻，若所述扩增产物在琼脂糖凝胶上显示为100-250bp之间的一条带，则待测水稻为候选籼稻。本发明的另一个目的是提供一种辅助筛选籼稻和粳稻的引物。本发明所提供的辅助筛选籼稻和粳稻的引物，具体可为在所述PCR扩增中扩增包含GenBankaccessionAP003771中自5，末端第71046-72062位核苷酸序列片段的引物。其中，所述引物扩增粳稻时，扩增产物在琼脂糖凝胶上显示为1200-2000bp之间的一条带，所述引物扩增籼稻时，扩增产物在琼脂糖凝胶上显示为100-250bp之间的一条带。所述引物具体可为如下的引物其中的一条序列如序列表中序列l所示，另一条序列如序列表中序列2所示。本发明发明人通过芯片数据挖掘、RT-PCR验证和基因组测序分析发现，过氧化物酶基因LOC—0s06g48030不仅在籼粳稻间存在基因组水平上的差异，而且由于这种差异，此基因在籼粳稻间还存在可变剪切现象。LOC—0s06g48030基因的发现和解析可能为籼粳亚种间不同表达模式的机理研究提供重要的理论基础。另外，对此基因进一步的功能分析和验证，将为研究籼粳亚种间抗逆性的差异和逆境响应机理提供重要的基础。本发明辅助筛选水稻籼粳亚种的方法可在发育早期筛选籼稻和粳稻品种或地方种，了解籼稻和粳稻的遗传分化程度，对籼、粳稻杂种优势的利用和培育高产、优质的杂交稻具有重要指导作用，从而优化杂交组合，加快育种速度，降低育种成本，具有操作简单，成本低廉，周期短的优点，适于推广应用，为水稻籼粳亚种种质的鉴定提供了一种快捷的选择方法。图1为Marker基因LOC—0s06g48030在芯片中所对应的3组探针在粳稻日本晴和籼稻IR64中的表达谱。图2为基因L0C—0s06g48030所在区域的基因组信息。A为过氧化物酶基因LOC—0s06g48030的3个不同剪切模式；B为RT-PCR引物在基因组上的相对位置；C为引物CS—1和CS—2在低温处理0h，12h，24h和48h的93-11和日本晴中的RT-PCR分析图；D为FS引物引导下分别以93-11和日本晴的cDNA为模板的RT-PCR分析图；E为籼稻93-11和粳稻日本晴的全长cDNA比对示意图。图3为基因L0C—0s06g48030在籼粳稻间的InDel分析。A为日本晴与93-11的基因组比对结果(来自TIGR);B为InDel引物在基因组上的位置；C为用GS引物扩增8个水稻品种的基因组DNA的结果。图4为籼粳稻间的InDel差异引起的基因L0C一0s06g48030可能存在的剪切模式。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。下述实施例中的水稻品种和地方种均来自国家种质资源库。实施例1、基因LOC—Os06g48030在籼粳亚种中不同表达模式的发现和验证通过对籼粳稻在不同发育阶段和不同组织部位的芯片数据的挖掘分析，发现基因LOC—Os06g48030在GengChip数据中对应有3组探针Os.11547.1.SI—s—at(PS1)，OsAffx.28164.1.SI—at(PS2)和OsAffx.28164.2.Sl一at(PS3)，其中探针组PS1在籼粳稻中均有较高的表达量，没有明显差异，而探针组PS2和PS3在籼粳稻中的表达模式却相反，PS2仅在籼稻中有较高的表达量，在粳稻中几乎不表达，而PS3仅在粳稻组织中表达量极高，而在籼稻中表达量却很低，甚至不表达(图l，其中，A为0s.ll547.1.Sl一s—at(PS1)在籼粳稻不同组织部位的表达谱分析图；B为OsAffx.28164.l.Sl—at(PS2)在籼粳稻不同组织部位的表达谱分析图；C为0sAffx.28164.2.S1—at(PS3)在籼粳稻不同组织部位的表达谱分析图。)。根据前人的研究结果，造成基因表达量差异的主要原因可能是碱基序列的差异(InDel)，或受其它基因的调控。利用比较基因组学的方法，对籼稻93-11和粳稻日本晴的序列进行了核苷酸序列比对(Blast)分析，结果发现在93-11中，此基因存在一段序列的缺失。与此同时，将3组探针所在的基因组序列与基因的基因组序列进行了Blast分析，结果发现探针组PS1存在于基因LOC—Os06g48030的3个isoform的共有区域(图2A，其中，L0C—0s06g48030.1为isoform1，L0C—0s06g48030.2为isoform2，L0C—0s06g48030.3为isoform3)，PS3存在于InDel区域，横跨isoforml和isoform2的末端，而PS2被定位在isoform2的末端序列区域。为进一步验证基因LOC一Os06g48030在籼粳稻中表达模式的不同，依据日本晴的序列信息，分别在探针所在的区域设计引物CS—1(包括CS一F和CS—Rl，对应探针PS3)，CS—2(包括FS—F和CS—R2，对应探针PS2)，引物位置如图2B所示，引物序列见表l。以低温处理后的籼粳水稻材料的cDNA为模板，进行RT-PCR扩增，结果CS一1仅在日本晴材料中有扩增条带，大小300bp左右，而93-11中却无表达，而CS—2仅在93-ll材料中有扩增条带(图2C，其中，1-4分别为93-110h、93-1112h、93-1124h、93-1148h;5-8分别为日本晴0h、日本晴12h、日本晴24h、日本晴48h;Actin为内参照。)，此结果与芯片数据的分析结果相同，从而说明此基因在籼粳稻间确实存在不同的表达模式。表l、RT-PCR所用引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例2、基因LOC—Os06g48030在籼粳亚种中不同表达模式的机理探索及用于辅助筛选籼稻和粳稻的引物的设计为探索基因L0C一0s06g48030在籼粳稻间不同表达模式的机理，对此基因的结构进行分析。鉴于此基因缺少籼稻中的全长cDNA序列，首先利用Primer3软件设计引物FS(FS的引物序列为FS—F:5，-ATGGGGCAGAGGAGGAGGTC-3，;FS—R:5'-CAAAAAGGAATGGCATATGTATGGGA-3，)，分别以籼稻93-11和粳稻日本晴的cDNA为模板进行PCR扩增，结果仅在籼稻93-11中检测到一条1300bp左右的条带(图2D)。随后，对此产物进行克隆测序，序列如序列表中序列3所示，并将测得的序列与日本公布的日本晴中的全长cDNA序列进行Blast分析，结果表明秈粳亚种在此基因的3'末端存在差异(图2E)。进一步验证93-ll与日本晴间是否存在基因组水平上的差异，依据日本晴序列，在二者可能存在基因组差异的区域设计引物GS(如图3A所示，引物序列如序列表中序列1和序列2所示)，弓I物GS在基因组中的位置如图3B所示。利用引物GS分别以日本晴和93-11的基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增的反应体系为水稻基因组DNA模板20ng，TaqPlusDNA聚合酶0.5U，2.OWlOXPCR缓冲液(lOOmMTris'HClpH9,0，500mMKC1，15mMMg2+，1%TritonX-100)，IOOMMdNTPs，正向引物4MM，反向引物4PM，用DEPC水补充反应体系至20W。PCR反应条件为先94°C3min;随后94°Clmin，58°Clmin30sec，72°C2min，共35个循环；再72°C10min。通过浓度为1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物中是否有目的条带。检测结果表明引物GS扩增日本晴得到的产物在琼脂糖凝胶上显示为1200-2000bp之间的一条带，但扩增93-11得到的产物在琼脂糖凝胶上显示为100-250bp之间的一条带(图3C，泳道1-5分别为日本晴亚种中一些变种的扩增产物，泳道6-IO分别为93-11亚种中一些变种的扩增产物，Marker为天根生化科技有限公司的DL2000，货号Cat共HT402-01)。进一步验证基因LOC—Os06g48030在秈粳稻间是否存在缺失现象，对93-11和日本晴中的扩增产物进行了克隆测序和BLAST分析(测序公司为北京奥科生物技术有限责任公司)。用GS引物扩增93-11获得的序列如序列表中序列4所示，用GS引物扩增日本晴获得的序列如序列表中序列5所示。BLAST分析结果表明93-11中存在1017bp，此缺失为GenBankaccessionAP003771中自5，末端第71046位至72062位核苷酸序列。进一步对GS引物扩增的序列进行分析发现，在这段序列中存在poly(A)信号。因此，推测籼粳稻间不同的剪切模式可能是由这段序列的插入/缺失引起的。由于曰本晴中存在这段序列，而这段序列中存在poly(A)信号，因此转录在此区域提前终止，前体mRNA转录成isoforml和isoform3，而籼稻中无此终止信号，转录可继续进行，转录到3'末端，从而包含3'末端的一段小的外显子序列，即形成isoform2(图4，A:粳稻中具有含有PolyA结构1017bp的片段，因此转录在此区域被阻止，使基因转录成L0C—0s06g48030.1和L0C—0s06g48030.3两种结构模式；B:籼稻中无此PolyA结构，而使转录继续进行，从而使基因转录成L0C—0s06g48030.2的结构模式)。实施例3、用引物GS辅助筛选水稻籼粳亚种的可行性验证用于验证的水稻品种均来自国家种质资源库93-11，IR24，03A-11,03A-9,中优13，日本晴，花l，746，云峰7号和香粳糯。首先利用形态指标及相关文献检索并随机挑选8个品种和地方种(4籼4粳)，如表2:表2、8个水稻水稻品种和地方种的籼粳亚种鉴定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>分别提取上述不同水稻品种的基因组DNA，在引物GS的引导下进行PCR扩增。反应体系如下水稻基因组DNA模板20ng，TaqPlusDNA聚合酶0.5U，2.OWlOXPCR缓冲液(100mMTrisHC1pH9.0，500mMKCl，15raMMg2+，1%TritonX-100)，IOO幽dNTPs，正向引物4MM，反向引物4幽，用DEPC水补充反应体系至20^1。反应结束，利用浓度为1.2%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。实验设3次重复。三次重复实验的结果一致，检测结果如图3C所示(泳道l-5分别为日本晴、花1、746、云峰7号、香粳糯的扩增产物电泳结果；泳道6-10分别为93-11、IR24、03A-11、03A-9、中优13的扩增产物电泳结果)。结果表明，引物GS在4个粳稻品种中，均扩增出与日本晴相同的带型，得到的产物在琼脂糖凝胶上显示为1200-2000bp之间的一条带；在4个籼稻品种中，均能扩增出与93-11相同的带型，得到的产物在琼脂糖凝胶上显示为100-250bp之间的一条带。以上结果表明，InDel引物GS鉴定籼稻和粳稻的准确性均达到了100%。因此，GS可用于水稻籼粳亚种辅助筛选标记。序列表〈160>5<210>1<211〉22<212>腿<213〉人工序列〈220><223>〈400〉1catgttcacaagtccaccgcgc22<210〉2<211>26<212>膽<213>人工序列〈220〉〈223〉〈400>2caaaaaggaatggcatatgtatggga26〈210>3<211〉1347<212〉腿<213>稻属水稻籼稻C(9irzasubsp.j'/2力'ca)<400〉3atggggcagaggaggaggtcggggccgcggcgtcagagccagagcgtggtggtggtggtg60gtcgccgtgttgctggcgacggcgtcctgcgcggcggcgcagctgagccagagctactac120gcgtcgacgtgccccaacgtggagacgctcgtccgcggcgccgtcacgcagaagctcaag180gagaccttcaacgccgcgcctgggacgctccgcctcttcttccacgactgcttcgtcagg240gggtgcgacgcgtcggtgctga/tcgcggggccggacgacgagcacagcgcgggcgcggac300acgacgctgtcgccggacgcgctggacctcatcacccgcgccaaggccgccgtcgacgcc360gacgcccagtgcgccaacaaggtctcctgcgccgacatcctcgccctcgccgcccgcgac420gtcgtctcccaggcaggaggaccctactaccaggtggagctggggcggcttgacggcaag480gtcgggacgcgcgccgtggtgaagcacagcctccccggcgccgccttcgacctcgaccag540ctcaacaagctcttcgccaccaacggcctcacccagaccgacatgatcgccctctcagga600gggcacacgataggggtgacgcactgcgacaagttcgtgcggcggctgtaccagttcaag660ggggcggcgccgcagtacagcccgccgatgaacctggcgttcctgcggcagatgaggcag720acgtgcccgctcagctacagcccgaccaccgtcgccatgctcgacgccgtctcgcccaac780aagttcgacaatggctacttccaggcgctgcagcagctcaagggcctcctcgcctccgac840caggtgctcctcgccgaccgccgctcgcgcgccaccgtcaactacttcgccgccaaccag900accgccttcttcgacgccttcgtcgccgccatcaccaagctcggccgcgtcggcgtcaag960acggccgccggctccgacgccgagatccggcgagtctgcaccaaggtcaactaatagcgt1020agagcagtatagctcacatttgggtggtagagagggtaaattggtgaattcttctctgtg1080tctctcttcttcttcctcttcttctccatgatggtcttcgattctcactgtccaagttca1140caagtccaccacgcacagttgttgtatttgttcccgccaattcttttcttgattcttata1200atcataaaaagtgtcatacattaattaggatatattttcagggcccctacccatgtgata1260tgatagaaggtacacttacaatgatgtaaatgtttacagctggtccagttaatcaagtat1320atcccatacatatgccattcctttttg1347〈210〉4<211>215<212>DNA〈213〉稻属水稻籼稻(<2rj^safirasubsp.众o7ca)<400〉4catgttcacaagtccaccgcgcacagttgttgtatttgttcccgccaattcttttcttga60ttcttataatcataaaaagtgtcatacattaattaggatatattttcagggcccctaccc120atgtgatatgatagaaggtacacttacaatgatgtaaatgtttacagctggtccagttaa180tcaagtatatcccatacatatgccattcctttttg215<211>1232<212>DNA<213>稻属水稻粳稻(&丁zasaWrasubsp.yapo/7ica)<400〉5catgttcacaagtccaccgcgcacaigttgt:tgtatttgttcccgccaattcttttcttga60ttcttataatgtcatacatttattttcagggcccctaccc120atag犯ggtacacttacaatgatgtaa^ctsgcgtggtggcccacgcaga180ttgcgcggctaacattattatattttctctca^t83tagcatatatgttttctcattat240attat11aaatatattaaaaattttaa^ttttgtaataactttacaaaac300tatt犯tgtgtaatattcatattatattttatatacgtgttagttattaattatttttaa360tatca^ttttagttatttg"taaattatatatattcctatatga^ctcteigactcgtctt420ttaatatttctttttttttaattttgaattttctgtaaattgtatttctatatagactct■atgctcttcttcta^tsttatttatttttatttxtgaatttttattatttataattgtat540ttctatgtgcactctaaactcatctttcaatattctttaatttttaatttcgaatttcag600ttacttctaaattgtattcatatattgaccttaaactcttcttcccatgtttttcttaat660ttcgaattttag"ttatttgtaaattgtatctttatatggactctaaactctacttttaat720tttattatgtttattccaaattttagttagttttaaattcctatatagattctatactct780acttctaatattccttattttttaattccgaatttctatttttttttaaattgtatttct840atacggactctagcctcctcttctaatatttcttattttttaattccgaatttcaattat900ttcttaatcgtatttctatacggactctagtatcctcttttaatattcctttttttttaa960ttccgaatttcagttatttcctaattgtatttctatatggactctagtctcctcttctaa1020tattctttattttttaattctgaatttcagctatttctaaattgtatttctatatggact1080ctgttttttctttttctccgattaatgtgag犯tttctatgccatgagagcgaacgtgga1140ggcttctttttctattcctttaataatataatagatgtttacagctggtccagttaatca1200agtatatcccatacatatgccattcctttttg123权利要求1、一种辅助筛选籼稻和粳稻的方法，是检测待测水稻中是否缺失GenBankaccessionAP003771中自5’末端第71046-72062位核苷酸序列，若缺失，则待测水稻为候选籼稻，若不缺失则待测水稻为候选粳稻。2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述缺失通过PCR扩增检测。3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述PCR扩增为扩增包含GenBankaccessionAP003771中自5，末端第71046-72062位核苷酸序列的片段。4、根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR扩增检测中所用的上游或下游引物与GenBankaccessionAP003771中自5，末端第71046-72062位核苷酸序列相同或互补。5、根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述PCR扩增中所用的引物，其中一条引物序列如序列表中序列l所示，另一条引物序列如序列表中序列2所示。6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述PCR扩增检测中，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，若所述扩增产物在琼脂糖凝胶上显示为1200-2000bp之间的一条带，则待测水稻为候选粳稻，若所述扩增产物在琼脂糖凝胶上显示为100-250bp之间的一条带，则待测水稻为候选籼稻。7、辅助筛选籼稻和粳稻的引物，是在所述PCR扩增中扩增包含GenBankaccessionAP003771中自5，末端第71046-72062位核苷酸序列片段的引物。8、根据权利要求7所述的引物，其特征在于所述引物扩增粳稻时，扩增产物在琼脂糖凝胶上显示为1200-2000bp之间的一条带，所述引物扩增籼稻时，扩增产物在琼脂糖凝胶上显示为100-250bp之间的一条带。9、根据权利要求8所述的引物，其特征在于所述引物中，其中的一条序列如序列表中序列1所示，另一条序列如序列表中序列2所示。全文摘要本发明公开了一种辅助筛选籼稻和粳稻的方法。本发明所提供的辅助筛选籼稻和粳稻的方法，是检测待测水稻中是否缺失GenBankaccessionAP003771中自5’末端第71046-72062位核苷酸序列，若缺失，则待测水稻为候选籼稻，若不缺失则待测水稻为候选粳稻。本发明辅助筛选水稻籼粳亚种的方法可在早期用于鉴定籼稻和粳稻品种或地方种，了解籼稻和粳稻的遗传分化程度，对籼、粳稻杂种优势的利用和培育高产、优质的杂交稻具有重要指导作用，从而优化杂交组合，加快育种速度，降低育种成本，具有操作简单，成本低廉，周期短的优点，适于推广应用，为水稻籼粳亚种种质的鉴定提供了一种快捷的选择方法。文档编号C12Q1/68GK101220394SQ20081005691公开日2008年7月16日申请日期2008年1月25日优先权日2008年1月25日发明者刘凤霞,孙传清,徐文英,震苏,薛勇彪,谭禄宾申请人:中国农业大学