一种由木质纤维原料生产乙醇和2,3-丁二醇的方法

专利名称：：一种由木质纤维原料生产乙醇和2,3-丁二醇的方法
技术领域：
：本发明属于生物化工
技术领域：
，特别是提供了一种由木质纤维原料同时生产乙醇和2，3-丁二醇的方法。
背景技术：
：乙醇广泛应用于饮料、食品、香精、调味品、医药和能源工业，在国民经济中占有较重要的地位，随着国民经济的发展，世界石油储量的锐减、环境保护工作的加强和车用燃料乙醇需求量的增加，乙醇的用途将更加广泛，对乙醇的需求量将与日俱增，乙醇工业的前途将日趋灿烂。2,3-丁二醇(2，3-butanediol)也是一种重要的化工原料。它是一种无色无味液体，可作为燃料，可用来制备聚合物、油墨、香水、防冻剂、熏蒸剂、增湿剂、软化剂、增塑剂、炸药以及药物的手性载体等。2，3-丁二醇还可作为一个很有价值的化工原料来合成其他化学品，如2，3-丁二醇脱水可产生甲乙酮，甲乙酮的应用相当广泛，再进一步脱水可形成1，3-丁二烯。2,3-丁二醇可通过Diels-Aider反应聚合生成苯乙烯。2，3-丁二醇与甲乙酮缩合并进行加氢反应生成辛烷，辛烷可用来产生高质量的飞行原料。植物纤维原料是地球上最丰富、最廉价的可再生资源。有资料表明，全世界每年的植物体生成量高达1.55X10'1吨干物质，其中纤维素、半纤维素的总量约为8.5X10'"吨。我国是一个农业大国，若能把大量的农业纤维原料及工业纤维废料中的纤维素、半纤维素经济有效地水解成葡萄糖，并进一步用于乙醇和其它化工原料的生产，这将有利于改善目前资源紧张，环境恶化的状况，对人类社会实现可持续发展具有重要的经济和社会意义。当前，利用单糖(主要为葡萄糖和木糖)或木质纤维原料生产乙醇已有一定报道的生产方法，但目前，由木质纤维原料生产乙醇主要有以下几条途径1.利用半纤维素水解液生产乙醇(VanZC，etal.Productionofethanolfromsugarcanebagassehemicellulosehydrolysateby/Vc/ias"》jYj's.ApplBiochemBiotechnol.,1988，17:357-369.2.同时利用纤维素与半纤维素生产乙醇(KarinOhgren，etal，Fuelethanoiproductionfromsteam—pretreatedcornstoverusingSSFathigherdrymattercontentBiomassandBioenergy，2006，30:863-869。上述方法中均是利用木质纤维原料为底物发酵产单一的乙醇，文献1主要利用半纤维素，文献2主要同时利用纤维素与半纤维素，由于酵母对半纤维素降解所得五碳糖利用率不高，因此底物利用率较低，所得乙醇浓度也较低。而对于2，3—丁二醇生产，目前也有一定程度报道，如下列文献1.利用葡萄糖生产2，3-丁二醇(Ramachandran，K.B.，Goma,G.，"2，3-ButanediolproductionfromglucosebyKlebsiellapneumoniaeinacellrecyclesystem",.]".Biotechnol.，1988，9,39-46.2.利用木糖生产2，3-丁二醇。(B.Marwoto，etal.Enhancementof(R，R)-2，3-butanediolproductionfromxylosebyPaenibacilluspolymyxaatelevatedtemperatures.BiotechnologyLetters2002，24:丄09-114)3.利用甘油发酵生产2，3-丁二醇(Biebletal.Fermentationofglycerolto1，3-propanedioland2，3-butanedio1.ApplMicrobiolBiotechnol,1998，50:24-29).4.利用木材水解液生产2，3-丁二醇(Grover，B.S.，Garg，S.K.，Verma，J.，Rodutionof2，3-butanecliolfromwoodhydrolysatebyKlebsiellapneumoniae,WorldJ.Microbiol.Biotechnol.，1990，6，328-332.)上述方法中l一3是采用葡萄糖、木糖或甘油为底物发酵生产2，3-丁二醇产品，因此生产成本很高。方法4提出了利用木材水解液生产2，3-丁二醇，但由于工艺条件限制，其发酵水平很低。
发明内容本发明的目的是提供一种由木质纤维原料生产乙醇和2，3-丁二醇的方法。主要利用木质纤维原料中半纤维素水解成五碳糖生产2,3-丁二醇，纤维素酶解成六碳糖生产乙醇，其具体工艺步骤如下1)生产2，3-丁二醇Al.将木质纤维素原料与浓度为0.25-7wt。/。的酸液按照重量比1:8-12的比例混合，在100-200。C的温度下经10分钟3小时时间的处理，处理后，使半纤维素水解成单糖溶入液相，纤维素与木质素保留在固相中。Bl固液分离，在半纤维素水解液经石灰脱毒处理后，添加培养成份配制2，3-丁二醇发酵用种子培养基和发酵培养基(如下表1)。使用前均于12rC灭菌15分钟.表1种子培养基和发酵培养基成份培养基组分种子培养基(g/L)发酵培养基(g微量元素溶液(呢/L)还原糖(w脱毒后滤液配制)20g20—80gZnCl270MPO,!3H204.45g2.225gMnCl2他O100麵2sa,2.Og2.0g60kh2po,,1.3g0.65gCoCL6I120200MgSft,7H200.2g0.2gNiCl26H2025酵母粉1.Og1.5gNiCLH2027.64微量元素溶液2mL2mL師0[)42H2035CaCO:i2.OgCuCl2H2020消泡剂0.lmLCuSft,5H2029.2837wtW盐酸0.9mLCI.将产酸克雷伯氏菌或克雷伯氏肺炎杆菌一环接入种子培养基，3037°C培养1218小时，得到种子液，以lwtX3wtX的接种量将种子液接入含半纤维素水解液的发酵培养基中，发酵温度3537°C，由碱溶液或氨水控制pH为6.08.0，生产2,3-丁二醇产品。2)生产乙醇，A2.取上述A1的保留在固相中的纤维素与木质素，按常规的同步糖化发酵工艺酶解成六碳糖生产乙醇相；B2.分别配制乙醇发酵种子培养基和发酵培养基种子培养基(g/L):葡萄糖20;酵母粉5;硫酸铵2;MgS047H20:0.2，KH2P04:5;发酵培养基(g/L):固体纤维取上述B1固液分离中的固体部份50—120,酵母粉5;硫酸铵2;MgSCW貼:0.2，KH2P0"5。以上培养基pH均调为4.5，使用前均于12rC灭菌15分钟。C2将酵母一环接入种子培养基中，3035。C培养1520小时，得到种子液;将种子液以510wt%的接种量接入发酵培养基中，加入纤维素酶，发酵温度3545°C，pH由碱溶液或氨水控制在4.55，生产乙醇。所述木质纤维原料为秸秆、玉米芯或甘蔗渣。所述酸为为硫酸、盐酸或醋酸。所述纤维素酶为20FPU/g固体纤维。所述还原糖是半纤维素酸水解所得，包括木糖、阿拉伯糖和葡萄糖。所述酵母为酿酒酵母或马克斯克鲁维酵母。本发明的优点在于采用该方法可有效提高原料利用率，同时得到高附加值的乙醇和2，3-丁二醇，从而降低生产成本。具体实施方式实施例1:由秸秆生产乙醇和2，3-丁二醇1.秸秆经切削、除尘、粉碎至40目，加入浓度为7wt。/。的硫酸溶液中，硫酸溶液与植物纤维原料的重量比为8:1;2.升温至10CTC，并保持该温度2小时。将以上所得液固混合物过滤，液相部分加入CaO至pH值等于8，搅拌，过滤去除沉淀，滤液中加入浓硫酸调pH为7，按表1分别用滤液配制种子培养基和发酵培养基，种子培养基中还原糖含量控制为20g/l，发酵培养基中还原糖含量控制为20g/l。3.将克雷伯氏肺炎杆菌U7e&ieWsp/e脂o"i站10011，购自中国工业微生物菌种管理保藏中心)一环接入种子培养基，3(TC培养18小时，得到种子液。以lwt^的接种量将种子液接入发酵培养基中，发酵温度35'C，pH由碱溶液或氨水控制在6，生产2，3-丁二醇9.8g/1。4.配制乙醇发酵种子培养基和发酵培养基，种子培养基(g/L):葡萄糖20;酵母粉5;硫酸铵2;MgS04'7H200.2，KH2P045。发酵培养基(g/L):固体纤维取上述B1固液分离中的固体部份50,酵母粉(商品名称为酵母浸粉)5;硫酸铵2;MgS0"7HA0.2，KHfO"5。以上培养基pH均调为4.5，使用前均于12rC灭菌15分钟。将酿酒酵母2.109(购自中科院微生物所)接入种子培养基中，3(TC培养20小时，得到种子液；将种子液以5%的接种量接入发酵培养基中，加入纤维素酶(20FPU/g固体纤维)发酵温度35°C，pH由3MNaOH溶液控制在4.5，发酵48小时得到乙醇14.7g/l。实施例2:由玉米芯生产乙醇和2，3-丁二醇1.玉米芯经切削、除尘、粉碎至40目，加入浓度为0.25%的硫酸溶液中，硫酸溶液与植物纤维原料的液固比为12:1;2.升温至20(TC，并保持该温度0.25小时。将以上所得液固混合物过滤，液相部分加入CaO至pH值等于10，搅拌，过滤去除沉淀，滤液中加入浓硫酸调pH为7，按表1分别用滤液配制种子培养基和发酵培养基，种子培养基中还原糖含量控制为20g./l，发酵培养基中还原糖含量控制为40g/l;3.将产酸克雷伯氏瞎(TOe^yeWsoxytoca10370，中国农业微生物菌种保藏中心)一环接入种子培养基，37'C培养12小时得到种子液。以3%的接种量将种子液接入发酵培养基中，发酵温度37°C，pH由碱溶液或氨水控制在8，发酵60小时，得到2，3-丁二醇32g/1。4.配制乙醇发酵种子培养基和发酵培养基，种子培养基(g/L):葡萄糖20;酵母粉5;硫酸铵2;MgS04*7H200.2，KH2P045。发酵培养基(g/L):固体纤维120(取上述B1固液分离中的固体部份)，酵母粉5;硫酸铵2;MgS0d7H200.2，KH2P045。以上培养基pH均调为4.5，使用前均于12rC灭菌15分钟。将马克斯克鲁维酵母2.1549(购自中科院微生物所)一环接入种子培养基中，35°C培养20小时得到种子液；将种子液以5%的接种量接入发酵培养基中，加入纤维素酶(20FPU/g固体纤维)发酵温度45。C，pH由3MNaOH溶液控制在4.5，发酵60小时得到乙醇35g/1。实施例3:由甘蔗渣生产乙醇和2，3-丁二醇1.甘蔗渣经切削、除尘、粉碎至40目，加入硫酸使溶液中酸浓度为2%，溶液与植物纤维原料的液固比为10:1;2.升温至160°C，并保持该温度40min。将以上所得液固混合物过滤，液相部分加入CaO至pH值等于9，搅拌，过滤去除沉淀，滤液中加入浓硫酸调pH为7，按表1分别用滤液配制种子培养基和发酵培养基，种子培养基中还原糖含量控制为20g/l，发酵培养基中还原糖含量控制为40g/l)3.将克雷伯氏肺炎杆菌(A7efeieWa/^e咖o/7iae10011，购自中国工业微生物菌种管理保藏中心)一环接入种子培养基，30"C培养18小时得到种了液。以l%的接种量将种子液接入发酵培养基巾，发酵温度37°C，pH由碱溶液或氨水控制在6，发酵开始20小时后，再补加脱毒水解液50g/1，共发酵72小时，得到2，3-丁二醇42.5gA。4.配制乙醇发酵种子培养基和发酵培养基，种子培养基(g/L):葡萄糖20;酵母粉5;硫酸铵2;MgS04'7H200.2，KH2P045。发酵培养基(g/L):固体纤维120(取上述B1固液分离中的固体部份)，酵母粉5;硫酸铵2;MgSO.,7FW)0.2，KH2P045。以上培养基pH均调为4.5，使用前均于121。C灭菌15分钟。将马克斯克鲁维酵母2.1549(购自中科院微生物所)一环接入种子培养基中，35°C培养20小时得到种子液；将种子液以5%的接种量接入发酵培养基中，加入纤维素酶(20FPU/g固体纤维)发酵温度45。C，pH由3MNaOH溶液控制在4.5，发酵开始20小时后再补加固体纤维40g/l,共发酵80小时得到乙醇58.5g/l。权利要求1.一种由木质纤维原料生产乙醇和2，3-丁二醇的方法，利用木质纤维原料中。半纤维素水解成五碳糖生产2，3-丁二醇，纤维素酶解成六碳糖生产乙醇，其特征在于，具体工艺步骤如下1)生产2，3-丁二醇A1.将木质纤维素原料与浓度为0.25-7wt％的酸液按照重量比1∶8-12的比例混合，在100-200℃的温度下经10分钟～3小时时间的处理，处理后，使半纤维素水解成单糖溶入液相，纤维素与木质素保留在固相中；B1固液分离，在半纤维素水解液经石灰脱毒处理后，添加培养成份配制2，3-丁二醇发酵用种子培养基和发酵培养基，如下表1所示；使用前均于121℃灭菌15分钟；表1种子培养基和发酵培养基成份<table-cwuid="table1"><tablewidth="788"><tgroupcols="5"><thead></column></row><row><column><entrycolwidth="21%"morerows="1"morelines="1"><p>培养基组分</p></entry><entrycolwidth="17%"morerows="1"morelines="1"><p>种子培养基(g/L)</p></entry><entrycolwidth="18%"morerows="1"morelines="1"><p>发酵培养基(g/L)</p></entry><entrycolwidth="44%"morerows="1"morelines="2"><p>微量元素溶液(mg/L)</p></entry></column></row></thead><tbody></column></row><row><column><entrycolwidth="21%"morerows="1"morelines="1"><p>还原糖(用脱毒后滤液配制)</p></entry><entrycolwidth="17%"morerows="1"morelines="1"><p>20g</p></entry><entrycolwidth="18%"morerows="1"morelines="1"><p>20-80g</p></entry><entrycolwidth="25%"morerows="1"morelines="1"><p>ZnCl2</p></entry><entrycolwidth="19%"morerows="1"morelines="1"><p>70</p></entry></column></row></column></row><row><column><entrycolwidth="21%"morerows="1"morelines="1"><p>K2HPO4·3H2O</p></entry><entrycolwidth="17%"morerows="1"morelines="1"><p>4.45g</p></entry><entrycolwidth="18%"morerows="1"morelines="1"><p>2.225g</p></entry><entrycolwidth="25%"morerows="1"morelines="1"><p>MnCl2·4H2O</p></entry><entrycolwidth="19%"morerows="1"morelines="1"><p>100</p></entry></column></row></column></row><row><column><entrycolwidth="21%"morerows="1"morelines="1"><p>(NH4)2SO4</p></entry><entrycolwidth="17%"morerows="1"morelines="1"><p>2.0g</p></entry><entrycolwidth="18%"morerows="1"morelines="1"><p>2.0g</p></entry><entrycolwidth="25%"morerows="1"morelines="1"><p>H3BO3</p></entry><entrycolwidth="19%"morerows="1"morelines="1"><p>60</p></entry></column></row></column></row><row><column><entrycolwidth="21%"morerows="1"morelines="1"><p>KH2PO4</p></entry><entrycolwidth="17%"morerows="1"morelines="1"><p>1.3g</p></entry><entrycolwidth="18%"morerows="1"morelines="1"><p>0.65g</p></entry><entrycolwidth="25%"morerows="1"morelines="1"><p>CoCl2·6H2O</p></entry><entrycolwidth="19%"morerows="1"morelines="1"><p>200</p></entry></column></row></column></row><row><column><entrycolwidth="21%"morerows="1"morelines="1"><p>MgSO4·7H2O</p></entry><entrycolwidth="17%"morerows="1"morelines="1"><p>0.2g</p></entry><entrycolwidth="18%"morerows="1"morelines="1"><p>0.2g</p></entry><entrycolwidth="25%"morerows="1"morelines="1"><p>NiCl2·6H2O</p></entry><entrycolwidth="19%"morerows="1"morelines="1"><p>25</p></entry></column></row></column></row><row><column><entrycolwidth="21%"morerows="1"morelines="1"><p>酵母粉</p></entry><entrycolwidth="17%"morerows="1"morelines="1"><p>1.0g</p></entry><entrycolwidth="18%"morerows="1"morelines="1"><p>1.5g</p></entry><entrycolwidth="25%"morerows="1"morelines="1"><p>NiCl2·H2O</p></entry><entrycolwidth="19%"morerows="1"morelines="1"><p>27.64</p></entry></column></row></column></row><row><column><entrycolwidth="21%"morerows="1"morelines="1"><p>微量元素溶液</p></entry><entrycolwidth="17%"morerows="1"morelines="1"><p>2mL</p></entry><entrycolwidth="18%"morerows="1"morelines="1"><p>2mL</p></entry><entrycolwidth="25%"morerows="1"morelines="1"><p>Na2MoO4·2H2O</p></entry><entrycolwidth="19%"morerows="1"morelines="1"><p>35</p></entry></column></row></column></row><row><column><entrycolwidth="21%"morerows="1"morelines="1"><p>CaCO3</p></entry><entrycolwidth="17%"morerows="1"morelines="1"><p>2.0g</p></entry><entrycolwidth="18%"morerows="1"morelines="1"><p></p></entry><entrycolwidth="25%"morerows="1"morelines="1"><p>CuCl2·H2O</p></entry><entrycolwidth="19%"morerows="1"morelines="1"><p>20</p></entry></column></row></column></row><row><column><entrycolwidth="21%"morerows="1"morelines="1"><p>消泡剂</p></entry><entrycolwidth="17%"morerows="1"morelines="1"><p></p></entry><entrycolwidth="18%"morerows="1"morelines="1"><p>0.1mL</p></entry><entrycolwidth="25%"morerows="1"morelines="1"><p>CuSO4·5H2O</p></entry><entrycolwidth="19%"morerows="1"morelines="1"><p>29.28</p></entry></column></row></column></row><row><column><entrycolwidth="21%"morerows="1"morelines="1"><p></p></entry><entrycolwidth="17%"morerows="1"morelines="1"><p></p></entry><entrycolwidth="18%"morerows="1"morelines="1"><p></p></entry><entrycolwidth="25%"morerows="1"morelines="1"><p>37wt％盐酸</p></entry><entrycolwidth="19%"morerows="1"morelines="1"><p>0.9mL</p></entry></column></row></tbody></tgroup></column></row><table></table-cwu>C1.将产酸克雷伯氏菌或克雷伯氏肺炎杆菌一环接入种子培养基，30～37℃培养12～18小时，得到种子液，以1wt％～3wt％的接种量将种子液接入含半纤维素水解液的发酵培养基中，发酵温度35～37℃，由碱溶液或氨水控制pH为6.0～8.0，生产2，3-丁二醇产品；2)生产乙醇，A2.取上述A1的保留在固相中的纤维素与木质素，按常规的同步糖化发酵工艺酶解成六碳糖生产乙醇相；B2.分别配制乙醇发酵种子培养基和发酵培养基种子培养基(g/L)葡萄糖20；酵母粉5；硫酸铵2；MgSO4·7H2O0.2，KH2PO45；发酵培养基(g/L)固体纤维取上述B1固液分离中的固体部份50-120，酵母粉5；硫酸铵2；MgSO4·7H2O0.2，KH2PO45；以上培养基pH均调为4.5，使用前均于121℃灭菌15分钟；C2将酵母一环接入种子培养基中，30～35℃培养15～20小时，得到种子液；将种子液以5～10wt％的接种量接入发酵培养基中，加入纤维素酶，发酵温度35～45℃，pH由碱溶液或氨水控制在4.5～5，生产乙醇。2.根据权利要求1所述由木质纤维原料生产乙醇和2，3-丁二醇的方法，其特征在于，所述还原糖是半纤维素酸水解所得，包括木糖、阿拉伯糖和葡萄糖。3.根据权利要求1所述由木质纤维原料生产乙醇和2，3-丁二醇的方法，其特征在于，所述木质纤维原料为秸秆、玉米芯和甘蔗渣中至少一种。4.根据权利要求1所述由木质纤维原料生产乙醇和2，3-丁二醇的方法，其特征在于，所述酸为为硫酸、盐酸或醋酸。5.根据权利要求1所述由木质纤维原料生产乙醇和2,3-」'二醇的方法，其特征在于，所述纤维素酶为20FPU/g固体纤维。6.根据权利要求1所述由木质纤维原料生产乙醇和2,3-丁二醇的方法，其特征在于，所述酵母为酿酒酵母或马克斯克鲁维酵母。全文摘要本发明公开了属于生物化工
技术领域：
的一种由木质纤维原料生产乙醇和2，3-丁二醇的方法，主要利用木质纤维原料中半纤维素酸水解成五碳糖生产2，3-丁二醇，纤维素酶解成六碳糖生产乙醇，同时得到乙醇和2，3-丁二醇两种高附加值的产品，并通过补料等工艺提高了发酵液中乙醇和2，3-丁二醇的浓度。其优点在于采用该方法可有效提高原料利用率，同时得到高浓度的乙醇和2，3-丁二醇，从而降低生产成本，因此具有很好的工业化前景。文档编号C12P7/06GK101225408SQ20081005704公开日2008年7月23日申请日期2008年1月29日优先权日2008年1月29日发明者刘宏娟,周玉杰,张建安,程可可申请人:清华大学