专利名称：一种块菌与菌根合成方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及印度块菌(中 华块菌)与华山松菌根的合成方法。
背景技术：
块菌(truffles)属于松、栎等林下土中生的外 生菌根食用真菌(edible ectomycorrhizal fungi)，由于富含有 蛋白质等营养物质及特殊催欲类化合物和人类免疫系统调节物 质，成为高蛋白、低脂肪、食疗兼顾的绿色生态功能性食品，在 欧洲乃至全球倍受青睐，被誉为厨房里的"黑钻石"，是世界上 迄今最为昂贵的天然食品。我国每年出口印度块菌(中华块菌) 360多吨，成为山地林区脱贫致富的新型野生菌根食用菌。并且越 来越受到人们的普遍欢迎，需求日益旺盛。由于所采集的块菌完 全依赖于林下自然资源，自然产量已供不应求；特别是商业化地 毯式的采集方式，自然生存状况受到极大的干扰和破坏，近些年 来已导致自然产量大幅度降低；若不采取相应措施，几年之后必 然成为濒危物种，乃至消失灭绝。如何实现块菌类菌根野生食用 菌持续利用已成为世界性难题和创新性研究的热焦点问题。因此， 首先用块菌菌种与无菌树苗在胁迫的条件下合成菌根苗，在人工 菌根合成的基础上，进行块菌人工栽培种植已成为块菌持续发展 的必然要求和必由之路。其中块菌苗菌根的合成成为块菌栽培的 关键技术。迄今，现有技术中未见有印度块菌(中华块菌)与华 山松菌根合成方法的报道和记载。
发明内容
本发明的目的在于提供一种印度块菌(中华块菌) 与华山松菌根合成方法。该方法涉及一系列程序步骤，即华山松 种子和块菌菌种子实体的筛选、无菌树苗的培育、菌剂制备、培 养基质的配置、优选及其接种，菌根苗的培养与菌根形态解剖及 分子的检测和确认，移植栽培，以最终实现人工栽培块菌。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案 中华块菌与华山松菌根合成方法，包括下述步骤
(1) 华山松播种和育苗，
A、 取4-8°C冰箱内保藏2-12个月的华山松种子，30%&02浸 泡2小时，无菌水冲洗数次，弃去漂浮的种子，再用无菌水浸泡 48小时，捞出，用机械方式使种子轻微破口 ，复用75%酒精棉纱 擦拭消毒，放培养皿中备用；
B、 基质备用，取未过筛蛭石与珍珠岩按体积比1/1混匀，加 入水使其含水量达30%， 121-126°C下高压蒸汽灭菌1小时；或者 取新生产的蛭石和珍珠岩；
C、 播种，将(1) A步骤中备好的种子，以开口端向下的方 向播入基质，播种深度为1.5-2 cm;
D、 育苗；
(2) 中华块菌菌剂制备和接种，
A、菌剂制备，选2-3月份产的成熟中华块菌，显微镜下观察 孢子形态，黑褐色孢子与未成熟黄褐色孢子的比例达95:5为成熟 子囊果，成熟子囊果用自来水清洗干净后，无菌水冲洗3遍，4-8°C冷藏10-20天后，再在-24。C冷冻保存不超过18个月备用；菌剂 制备前将冷冻子囊果取出，自然解冻，将每一子囊果切为数块，
放置于搅拌机中，加无菌水粉碎，显微镜下镜检，确定95%的子囊 游离，5%的孢子从子囊分离出为止，菌剂的浓度为每克子囊果/水 二 1/3-5;
B、 接种基质制备及pH值调整，腐殖质土过筛，适量拌入水， 使水分含量30%,高压灭菌3小时备用；腐殖质、水、蛭石以体积 比1/1/1的比例混合，加入石灰粉，混匀，调整pH为7，备用；
C、 接种，按每株接种5xl07个孢子的量折算出每株需接种的 菌剂的体积，取菌剂浇入基质，拌匀；将步骤(1)所得幼苗自育 苗基质中取出，去根末端，将菌的根系全部浸入步骤(2) A制备 的菌剂后取出，植入步骤(2) B的接种基质；
(3)菌根苗培育，苗置于自然通风大棚，自来水浇灌，干温 交替培养，培养温度10-30°C，太阳光照10-H小时。
本发明技术方案的提出基于下述的块菌菌根合成原理印度 块菌(中华块菌)是一种与木本(主要为松科Pinaceae、壳斗科 Fagaceae、榛科Corylaceae、桦木科Betulaceae等)植物开；成夕卜 生菌根的共生性地下生真菌，其生长发育及子实体形成都必须与 这些植物的根系共生才能实现。因此采用人工合成的基质培育树 苗，用块菌的组织和孢子制成菌种菌剂接种，在人为控制的条件 下，满足块菌菌剂孢子萌发感染树苗幼根的需求，促成菌根的形 成，把合成的菌根树苗种植栽培在适宜的山地(PH值7-7.6、炭 氮比C/N二10)，以实现块菌的人工栽培，确保持续发展。本发明印度块菌(中华块菌)与华山松菌根合成的方法，优化 了菌根树苗的培育、培养基质和菌剂制作及菌根合成和菌根的检 测与确认。
本发明具体的合成步骤和技术方法如下
1. 基质制备与育苗
基质制备蛭石与珍珠岩按体积比1/1混匀，加入自来水使 其含水量达30%，121-126。C下高压蒸汽灭菌1小时后冷却备用(若 为新生产的蛭石和珍珠岩也可不必灭菌，可直接使用)。
播种与育苗挑选成熟饱满的种子，用75%酒精表面消毒灭菌， 以机械的方法使其开裂微口 ，开口端向下播入上述基质。播种深
度1.5-2 cm为宜；要适时浇灌；播种后第10日开始出芽，30日 后几乎全部种子出芽完成，萌发率的统计从第6日至第30日；苗 龄在1.5-3月时即可接种。
2. 菌剂及其制备
子实体筛选与保藏首先显微镜检鉴定印度块菌(中华块菌)， 确认块菌子实体准确无误，避免其他块菌混入；从中选取成熟的 印度块菌，以深黑褐色的孢子量比率达95%以上的为成熟子囊果； 冲刷清洗去除泥土后，用无菌水冲洗；4-8°C冷藏箱保藏10-20天 后，移入-24°C冷冻室保存备用。
菌剂制备冷冻子囊果自然解冻，用小刀将每一子囊果切为 数块；将小切块放置于搅拌机中，加无菌水粉碎，显微镜下镜检， 以确定无肉眼可见的组织块，使95%的子囊游离，约5%的孢子从 子囊分离出为止。菌剂的浓度以每克子囊果/水二 lg/3-5ml为宜。3. 接种
基质制备及PH值调整腐殖质土过筛，适量拌入水，水分含 量30%，高压灭菌3小时备用；灭菌后的腐殖质与蛭石以体积比
1/1的比例混均，加入石灰粉，充分混匀，调整pH值为7—7.6
时即可备用。
接种与培育根据每株接种含有5xl07个孢子菌剂的剂量要
求，取上述制成的菌剂原液稀释20倍，取5ml稀释菌液移入基质， 搅拌均匀；取上述培养的幼苗剪去根端，并将整个根系浸入稀释 菌剂之后移植基质培育。接种后的幼苗置于自然通风大棚培育。
4. 菌根形态及分子水平验证
外观特征菌根形成后菌根末级分枝棒状或近圆柱状，表面
光滑，有时具外延菌丝，最末端淡黄色至近白色，向基部颜色渐
深，常形成深浅相间的蛇纹样斑；菌套明显，有时表面覆盖外延
菌丝，菌套细胞不透明。抽样统计每株菌根数量均为700-800个， 单株根系感染率达95%以上。
解剖特征外菌套平面观非胶质化，拟薄壁组织 (pseudoparenchymatous tissue) M 型，表面具表皮样细胞 (epidermal cells )。内菌套平面观介于疏丝组织型 (pletenchymatous tissue)与拟薄壁组织型之间，近H型，多 数部位近哈蒂氏状(Hartig net-like),菌丝排列较紧密，粗2 - 4 pm，薄壁，无色；外延菌丝伸长，近等粗，圆柱状，薄壁，少分 枝，无色。
分子水平验证经过制菌剂子实体和截取华山松菌根树苗菌 根总DNA的提取，采用了改进的CTAB法和真菌DNA试剂盒、PCR扩增及ITS1/ITS4和ITS4/ITS5对比分析，分别都得到100%的一 致性，表明所培育获得的华山松幼苗菌根是由印度块菌菌丝侵入 形成的；确认华山松印度块菌菌根合成成功。
具体实施例方式为了更好地了解本发明，下面用本发明的实 施例证来进一步说明本发明的内容，但本发明的内容并不局限于 此。
实施例1:
印度块菌(中华块菌)与华山松菌根苗合成方法 1、华山松育苗
(1) '备种
秋季采集成熟华山松种子，4-8。C冰箱内保藏，保藏期不超过 l年。用前取出，30%&02浸泡2小时，其间搅动数次一无菌水冲 洗数次一弃去漂浮的种子一无菌水浸泡48小时，捞出一用机械方 式，使种子轻微破口一复用75%酒精棉纱擦拭消毒，放培养皿中备 用。
(2) 基质
蛭石(未过筛)与珍珠岩按体积比1/1混匀，加入自来水使 其含水量达30%， 121-126°C下高压蒸汽灭菌1小时；若为新生产 的蛭石和珍珠岩也可不灭菌直接使用。
(3) 播种
将备好的种子，以开口端向下的方向播入基质。播种深度为 1.5-2 cm;容器为425 x 340x 200 mm透水塑料筐。(4)育苗
自来水浇灌；播种后第10日开始出芽，30日后几乎全部种子 出芽完成，萌发率的统计从第6日至第30日，发芽率约为80%;
苗龄1. 5-3月时即可接种。 2、菌剂
选2-3月份国产成熟印度块菌(中华块菌)，不分大小；显微
镜下镜检孢子形态等分类学特征以确定种的正确性；孢子成熟度， 即以黑褐色孢子(成熟)与黄褐色孢子(未成熟)的比例达95 : 5。 硬毛刷在自来水中洗刷去表面泥土并清洗至无泥土残留，无菌水 冲洗3遍；4-8。C冷藏10-20天后，-24。C冷冻保存；保存期不应 超过18个月。
菌剂制备前将冷冻子囊果从冰箱内取出，自然解冻。解冻后 用小刀将每一子囊果切为数块；将切块放置于PHILIPS HR2839型 二合一搅拌机中，每次放子囊果约200g，加无菌水粉碎，最初加 水少许，后逐渐增加水量，粉碎约3-4分钟，显微镜下镜检，以 确定无肉眼可见的组织块，95%的子囊彼此分离，约5%以上的孢子 从子囊内分离出为止。菌剂的浓度以每克子囊果/水=lg/3-5ml 为宜。
孢子计数菌剂原液充分搅匀，在容器上中下部位各取lml， 置于3个量筒内，量筒内lml稀释至10ml，搅匀；每一量筒上中 下部各取一滴，置血球计数板；算出单位体积原液折合的孢子数 目；同时，取原液10ml菌剂以无菌水稀释20倍后置烧杯中供接 种时蘸根。 '3、 接种
(1) 基质制备及PH值确定
腐殖质2目过筛，适量拌入自来水，使水分含量约30%， 121-126° C高压蒸汽灭菌3小时；以上高压灭菌后的腐殖质与蛭石
(灭菌或否)以体积比1/l的比例混合后备用；
以上基质取一定质量(如100g)，分为4等份，在各等份中分 别加入不同质量的熟石灰粉，充分混匀，每份各取30ml，加入150ml 蒸馏水，其间搅'动数次，l小时后，用精密pH试纸(5. 5-9. 0)测 得每份基质的PH值。计算或推算pH为7_7.6时基质与石灰的质 量比。按以上比例在基质中加入石灰，充分混匀后备用。
(2) 接种
方法按每株接种5xl()7个孢子的量折算出每株需接种的菌剂 原液的体积，如菌剂原液稀释20倍后，以量筒量取5 ml菌剂后 浇入基质，将菌剂与基质拌匀备用；幼苗自育苗基质中取出，用 剪刀剪去根的末端以促使生出更多的侧根；将根系全部浸没入步 骤2制备的稀释菌剂后取出，容器底部1/5放入接种基质后将幼 苗植入；基质占容器容积的4/5。
4、 菌根苗培育
接种苗置于自然通风大棚，自来水浇灌，干温交替，培养温 度10-30°C，每天光照10-14小时。
5、 菌根形态
接种后约需3-5个月，块菌菌丝侵入幼苗根系形成菌根。确 认菌根是否形成，需要从菌根形态及其解剖特征和分子水平(即亲子鉴定)予以确认。
夕卜观牛寺征菌根系统 (mycorrhizal systems ) 二叉状 (dichotomous)，有时近珊瑚状(coralloid)或介于以上两种类 型之间，偶简单不分枝(unramified)，总长2-4.6 mm，具1- 4 级次生分枝，有时数个具3-4级分枝的菌根沿根紧密排列形成近 簇状；末级分枝棒状或近圆柱状，顶端直，长0.8-3.9 min，顶端 直径(220) 350 - 500 Mm，基部粗250-350 jam,表面光滑，有时 具外延菌丝，最末端淡黄色至近白色，较小黄褐色或红褐色，向 基部颜色渐深，偶顶端与基部同色，常形成深浅相伺的蛇纹样； 菌套明显，有时表面覆外延菌丝，菌套细胞不透明；皮层细胞不 可见；外延菌丝缺或仅限于最末一级分枝，长，白色，明显。菌 索末见。菌核末见。
解剖特征外菌套平面观非胶质化，拟薄壁组织 (pseudoparenchymatous t issue) M型(依Agerer， 1987-2002)， 表面具表皮样细胞(epidermal cells),不具菌丝网(hyphal nets),细胞薄壁，黄褐色，常局部菌丝颜色较深，表面光滑无附 属物，长10 - 25 Mm，粗(5) 8 - 20 jim，每20 )umX 20 方块 内7- IO个细胞(包含完整的与仅部分位于样方的细胞)。内菌套 平面观介于疏丝组织型(pletenchymatous tissue)与拟薄壁组 织型之间，接近H型(依Agerer， 1987-2002)，多数部位近哈蒂 氏状(Hartig net-like),菌丝排列较紧密，粗2- 4 ^n，薄壁， 无色；外延菌丝伸长，近等粗，圆柱状，粗2-3pm，薄壁，少分 枝，无色。锁状联合缺。囊状体和厚垣孢子缺。
分子水平验证经过制菌剂子实体和截取华山松菌根树苗菌 根总DNA的提取，采用了改进的CTAB法和真菌DNA试剂盒、PCR扩增及ITS1/ITS4禾n ITS4/ITS5对比分析，分别都得到100%的一 致性，表明所培育获得的华山松幼苗菌根是由印度块菌菌丝侵入 形成的；确认华山松印度块菌菌根合成成功。
菌根数量抽样统计每株菌根数量为700-800个，单株根系 感染率(菌根数/ (不感染根尖数+菌根数)为95%。
注此处"一个菌根"的定义为由连续的可识别的菌套所 覆盖的区域所形成一个单元。多分枝的菌根，若由连续的菌套所 覆盖，视为一个菌根。
与现有技术相比，本发明具备的优益性在于
本发'明为实现国产印度块菌及其近缘种的人工栽培奠定了必 备的关键技术。通过本发明实现了国产块菌与华山松菌根的合成， 利用本方法可以大批量规模化合成培育菌根树苗，为下一步块菌 的人工种植产业化提供技术保障。本发明可应用于荒山土壤修复 与改良、植树造林及植被的修复与重建，对于开发利用石灰岩山 地区及偏僻山地林区具有巨大潜力和广阔的应用前景。本发明的 方法操作简易，容易广泛应用与推广。本发明为生物学(微生物 学、菌物学)与农学与林学(栽培学和林业)及其交叉学科菌根
学Mycorrhizology领域的技术交叉，汲取了多个学科的多重优点， 具有实用简便的优势。
权利要求
1、中华块菌与华山松菌根合成方法，包括下述步骤(1)华山松播种和育苗，A、取4-8℃冰箱内保藏2-12个月的华山松种子，30％H2O2浸泡2小时，无菌水冲洗数次，弃去漂浮的种子，再用无菌水浸泡48小时，捞出，用机械方式使种子轻微破口，复用75％酒精棉纱擦拭消毒，放培养皿中备用；B、基质备用，取未过筛蛭石与珍珠岩按体积比1/1混匀，加入水使其含水量达30％，121-126℃下高压蒸汽灭菌1小时；或者取新生产的蛭石和珍珠岩；C、播种，将(1)A步骤中备好的种子，以开口端向下的方向播入基质，播种深度为1.5-2cm；D、育苗；(2)中华块菌菌剂制备和接种，A、菌剂制备，选2-3月份产的成熟中华块菌，显微镜下观察孢子形态，黑褐色孢子与未成熟黄褐色孢子的比例达95∶5为成熟子囊果，成熟子囊果用自来水清洗干净后，无菌水冲洗3遍，4-8℃冷藏10-20天后，再在-24℃冷冻保存不超过18个月备用；菌剂制备前将冷冻子囊果取出，自然解冻，将每一子囊果切为数块，放置于搅拌机中，加无菌水粉碎，显微镜下镜检，确定95％的子囊游离，5％的孢子从子囊分离出为止，菌剂的浓度为每克子囊果/水＝1/3-5；B、接种基质制备及pH值调整，腐殖质土过筛，适量拌入水，使水分含量30％，高压灭菌3小时备用；腐殖质、水、蛭石以体积比1/1/1的比例混合，加入石灰粉，混匀，调整pH为7，备用；C、接种，按每株接种5×107个孢子的量折算出每株需接种的菌剂的体积，取菌剂浇入基质，拌匀；将步骤(1)所得幼苗自育苗基质中取出，去根末端，将菌的根系全部浸入步骤(2)A制备的菌剂后取出，植入步骤(2)B的接种基质；(3)菌根苗培育，苗置于自然通风大棚，自来水浇灌，干温交替培养，培养温度10-30℃，太阳光照10-14小时。
2、按照权利要求1所述的方法，其特征在于 (1)华山松种子筛选和育苗，A、种子的筛选与消毒杀菌选取保藏在4-8°C冰箱1年以内 的华山松种子，用30%&02浸泡2小时，期间每15分钟搅拌1次， 之后无菌水冲洗4-5次，弃去漂浮的种子，再用无菌水浸泡48小 时，捞出，用机械方式使种子轻微破口，反复用75%酒精棉纱擦拭 消毒，置于培养皿中备用；B、基质的制备取未过筛的蛭石与珍珠岩按体积比1/1的 比例混匀，加入水使其含水量达30%，在121-126°C下高压蒸汽灭菌锅内灭菌1个小时；将制备好的基质在无菌的条件下分装入容 器为425 x 340x 200 mm透水塑料容器备用；C、播种将(1) A步骤中备好的种子，以开口端向下的方向播入步骤(O B制备好的基质容器内，播种深度为1.5-2 cm， 覆盖培养；D、育苗无菌水浇灌；播种后通常第10日开始出芽，30 日种子出芽大部分完成；苗龄在1. 5-3月时开始接种。'(2)印度块菌菌剂制备和接种，A、 菌剂制备选取成熟的印度块菌即中华块菌子实体，显微镜下镜检确认子实体准确，并检查无其它块菌混入；镜检观察到 黑褐色孢子达到95%以上子实体为成熟的子囊果；成熟子囊果用毛 刷及自来水清洗干净后，无菌水冲洗3-4遍，置4-8。C冷藏冰箱 内冷藏10-20天后，移入-24。C冷冻保藏箱内保藏备用；保藏时间不超过18个月；菌剂制备前将冷冻子囊果取出，自然解冻，将每一子囊果切为数块，放置于搅拌机中，加无菌水粉碎；显微镜下镜检，确定 95%以上的子囊游离，5%的孢子从子囊中分离出为止；菌剂的浓度 为每克子囊果用水3-5 ml稀释为宜，制成菌剂原液备用；用时可 再稀释20倍；B、 接种基质制备及pH值调整腐殖质土过筛，适量拌入水， 使水分含量达30%，高压灭菌3小时；灭菌后的腐殖质与蛭石以体 积比1: 1的比例混均；加入适量石灰粉，混匀调整pH值为7—7.6 为宜，备用；C、接种，按每株需接种5"07个孢子的量折算出每株需接种的菌剂的体积，取菌剂原液稀释后浇入上述灭菌后的基质内，充 分拌匀；将步骤(1)所得无菌幼苗自育苗基质中取出，剪去根末 端，将幼苗根系全部浸入步骤(2) A制备的菌剂稀释夜中沾取孢子菌剂后取出，.植入步骤(2) B制备的接种基质中培养；(3)菌根幼苗的培育与管理接种幼苗置于自然通风的塑料大棚内，自来水浇灌，干湿交替培养，培养温度为10-26°C，每天 光照10-14小时；华山松印度菌根苗培育5-6个月后，移植。
全文摘要
中华块菌与华山松菌根合成方法，涉及一系列程序步骤，即华山松种子和块菌菌种子实体的筛选、无菌树苗的培育、菌剂制备、培养基质的配置、优选及其接种，菌根苗的培养与菌根形态解剖及分子的检测和确认，移植栽培，最终实现人工栽培块菌。
文档编号C12N1/14GK101328464SQ20081005844
公开日2008年12月24日 申请日期2008年5月27日 优先权日2008年5月27日
发明者于富强, 刘培贵, 王向华, 田霄飞, 耿丽英, 邓晓娟, 娟 陈 申请人:中国科学院昆明植物研究所