不同区域普洱茶晒青毛茶的分子鉴别方法

专利名称：：不同区域普洱茶晒青毛茶的分子鉴别方法
技术领域：
：本发明涉及分子标记
技术领域：
，具体涉及AFLP-毛细管电泳技术对不同区域普洱茶晒青毛茶的分子鉴别技术。
背景技术：
：普洱茶以其独特品质风格和保健功效而举世注目，"普洱茶"已作为证明商标(地理标志)正式启用。普洱茶的原料必须是云南大叶种阿萨姆茶(0^//&^^朋";w:aMaw/cfl)的晒青毛茶。普洱茶是指中国云南省西部、南部和中部等地用云南大叶种阿萨姆茶的晒青毛茶经精制整理或蒸压成形后储存陈化后获得的茶品(称为生茶、茶饼)，以及20世纪70年代以来经技术改革创新，采用云南大叶种晒青毛茶经过增湿渥堆及后熟陈化后获得的茶品(称为熟茶)。普洱茶的原产地是云南省临沧地区、普洱市和西双版纳州三个地区，因此，其他地区生产的茶品均不能称之为"普洱茶"。普洱茶的原料即云南大叶种阿萨姆茶的晒青毛茶是决定普洱茶品质的主要因素之一。由于普洱茶的驰名和价格的优势，市场上假冒产品较多，并且由于原料的产地不同，使得普洱茶在口感等有较大差异，在价格上也有较大的差异。由来自古茶园的云南大叶种阿萨姆茶的晒青毛茶生产的普洱茶的价格要比来自台地茶园的云南大叶种阿萨姆茶的晒青毛茶生产的普洱茶的价格要高得多(老树茶均价为100￥/，2007年;台地茶均价为10￥/kg,2007年)；来自于不同区域的古茶园的晒青毛茶生产的普洱茶在价格上也有较大差异，如原料来自勐海班章区域的古茶园的晒青毛茶(1000Y/kg，2007年)比原料来自临沧等区域的古茶园的晒青毛茶(100Y/kg，2007年)的普洱茶价格高得多。因此，科学地鉴别普洱茶原料来源，鉴别不同区域普洱茶晒青毛茶，对鉴别普洱茶原料的真伪、鉴别普洱茶生茶(茶饼)的真伪，打击假冒古茶园原料的大量出现，保护广大消费者的利益，保证普洱茶商誉和普洱茶产业健康持续发展具有重要价值。晒青毛茶是茶叶经过最初加工后的称谓，云南晒青毛茶是大叶种茶树鲜叶经杀青、揉捻后，采用太阳光晒干而成的。古茶园(山)茶叶也称老树茶，它制于百年以上的古老茶园，云南省现有古老茶园60万亩，在古老茶园中林茶草构成一个和谐的生态系统，造就"远看是森林、走近是茶园"的美妙景像，古老茶园中的茶树病虫不会发生灾害性、突发性的危害，不需用药防治，也不需进行修剪及中耕施肥等管理，是一种地道的天然产品。台地茶园茶叶(即台地茶园生产)也称台地茶，是指采制于新中国成立后发展建立的密植条栽茶园，云南省现有该类茶园近200多万亩，该类茶园突出的是"集中连片、高产"，事先未考虑搭建"和谐的林茶草生态系统"，伴随的是"喷药施肥、中耕修剪"，今后的目标是"改造"，提高转换将之建设成为"有机茶园"、"无公害茶园"。用古茶园茶叶即老树茶所制作的普洱茶，品质优良，价格居高不下；不同古茶园茶叶制作的普洱茶，品质风格和价格也不同。而古茶园产量有限，这就导致了假冒古树茶的大量出现。目前，分子生物学技术在食品的真伪鉴别上的应用发展迅速，为打击伪劣造假食品开辟了新途径。以DNA水平为基础的分子检测鉴别技术，包括PCR技术、RFLP技术、RAPD技术、AFLP技术、SSR和ISSR技术、多位点小卫星DNA指纹技术和微卫星标记技术、基因芯片技术以及SNP技术等。由于晒青毛茶在加工过程中，经历日晒、杀青、揉捻和蒸煮等过程，DNA的提取相对来说较为困难。Singh(SinghMetal.IsolationandPCRamplificationofgenomicDNAfrommarketsamplesofdrytea.PlantMol.Biol.Rep.199917:171-178)报道，成功提取了绿茶DNA，并能成功用于RAPD分析，而晒青毛茶实际上属于绿茶。周杨(周杨等，不同年代云南普洱茶DNA提取分离方法初探.云南农业大学学报,2006，21(3):396-398)曾报道采用的改进的CTAB微量提取法,可以得到高质量的不同年代的云南普洱茶DNA，其中包含晒青毛茶。本文作者通过摸索，已经成功地提取到晒青毛茶的总DNA，能满足AFLP扩增的需要。陈亮等(陈亮等，应用RAPD分子标记鉴定野生茶树种质资源研究，中国农业科学,2002，35(10):1186-1191)应用RAPD标记对原产于云南等地的24份野生茶树资源进行分子鉴定研究。结果表明,RAPD标记在鉴定茶树种质资源方面非常有效。有3种独立的方法可以用于茶树种质资源的分子鉴定:特殊的标记；特异的谱带类型；不同引物提供谱带类型的组合。16个特异标记的存在和3个特异标记的缺失可以鉴定14份资源；Singh用从市场上购来的10个不同品牌的红茶、绿茶，提取DNA，用RAPD鉴别，并认为该方法用来证明某著名品牌的茶叶的来源，有极大的应用性。Matsumoto(MatsumotoSetal.DifferentiationofJapanesegreenteacultivarsasrevealedbyRFLPanalysisofphenylalanineammonialyaseDNA.TheoreticalandAppliedGenetics2002，104:998-1002)用RFLP技术，以PAL基因为探针鉴别日本绿茶的遗传差异，集合2种限制性内切酶，2.3kb的探针能从阿萨姆种茶中鉴别出日本绿茶。Dhiman(DhimanB.etal.Moleculardetectionofcashewhusk(Anacardiumoccidentale)adulterationinmarketsamplesofdrytea(Camelliasinensis).Letter…PlantaMed2003,69:882-884)报道从5SrRNA基因片段设计了种间的特异PCR探针，并成功地检测到在茶叶样品中的掺杂的假货腰果壳。从上述报道可看出，分子标记在茶树种质和产品鉴别是可行的。普洱茶不同区域晒青毛茶的鉴别技术是非常复杂的，梁名志等(梁名志等，老树茶与台地茶品质比较研究.云南农业大学学报，2006,21(4):493-497)以云南省的普洱茶的蒸青茶、晒青茶为样品，从感官审评、内含品质化学成分和矿物质元素检测分析展开对比研究,得出:(l)老树茶口感要优于台地茶,与品质化学成分有关联。(2)从理化成分与矿物质含量来看，老树茶与台地茶各有千秋,不能简单、武断地讲谁优谁劣、谁好谁差。说明老树茶与台地茶确有差异，但很难用感官审评、内含品质化学成分和矿物质元素检测等方法来区分。AFLP分子标记技术(即扩增片段长度多态性，AmplifiedFragmentLengthPolymorphism,AFLP技术)与上述技术相比具有DNA需要量少、检测效率高、多态性高、可靠性好、重复性高等优点。AFLP分子标记技术己在动物学、植物学、医学研究上应用。在植物学研究中的应用主要在种质资源鉴定、指纹图谱构建等。目前，还没有应用AFLP分子标记技术对普洱茶晒青毛茶进行分子鉴别，也没有用AFLP-毛细管电泳技术对不同区域普洱茶晒青毛茶进行分子鉴别。本发明人特别通过引物的选择和开创性地利用AFLP-毛细管电泳技术对不同区域普洱茶晒青毛茶进行分子鉴别。通过2006年和2007年两次查新检索，目前在国内外未发现有对不同区域普洱茶晒青毛茶及其它茶类的AFLP-毛细管电泳分子鉴别的相关报道
发明内容本发明针对著名古茶园"普洱茶"原料的真伪、不同区域的老树茶(即古茶园生产的茶叶)晒青毛茶、老树茶与台地茶(台地茶园生产的茶叶)晒青毛茶难以用传统的感官审评或理化分析等方法鉴别的问题，提供了一种不同区域普洱茶晒青毛茶的分子鉴别方法。本发明目的旨在:①建立著名古茶园的晒青毛茶的AFLP-毛细管电泳标准图谱(以下简称古茶园的AFLP标准图谱)，据此区分不同区域的古茶园晒青毛茶；②建立著名古茶园的AFLP标准图谱，据此区分台地茶园晒青毛茶，为普洱茶原产地保护奠定科学数据，促进普洱茶的持续健康发展。本发明克服了现有技术中用感官审评或理化分析等方法难以鉴别古茶园"普洱茶"原料的真伪、不同区域的老树茶晒青毛茶、老树茶晒青毛茶与台地茶晒青毛茶的问题。本发明收集了普洱茶主要产区云南西双版纳州、普洱市和临沧地区以及云南周边国家缅甸、老挝和泰国的晒青毛茶，采用本发明"不同区域普洱茶晒青毛茶的分子鉴别方法"对其进行分析。本发明的优点及有益效果是成功地建立了普洱茶产地的9个著名古茶园的AFLP标准图谱，能鉴别著名古茶园普洱茶的真伪，并成功区别不同古茶园晒青毛茶，打击假冒伪劣产品。(2)通过建立的上述古茶园的AFLP标准图谱，能把古茶园晒青毛茶与其它台地茶园晒青毛茶区分开来。(3)本发明所用的AFLP-毛细管电泳技术，一对引物可扩增出200多个位点，位点差异在lbp都能检测到，更容易检测出材料的细微差异。(4)本发明采用高效自动化技术，降低了人为操作带来的误差，易于对扩增样本进行标准化分析，提高了数据的可靠性。(5)本发明通过对39个晒青毛茶的AFLP-毛细管电泳，39个晒青毛茶的AFLP毛细管电泳图谱都有差异，可以通过以下途径来区分不同来源的普洱茶晒青毛茶。①从典型的主要特征峰和染色信号的最高值和次高值来区别；如产于普洱市的景迈茶的E-AAC/M-CTG216bp特征峰；产于临沧地区的勐库茶的E-AAC/M-CTG114bp特征峰，产于普洱市澜沧县澜沧大山的E-AAC/M-CTG210bp特征峰；产于老挝的老挝丰沙里的E-AAC/M-CTG210bp特征峰；②从峰形图的整个形状来区分；③与对照的峰形图比较来区分。本发明方法的技术方案如下本发明的主要仪器CEQ8000毛细管电泳系统(BeckmanCoulter);台式冷冻离心机(BeckmanCoulter);PCR仪(MJResearch(Waltham,MA，USA)PTC200-we11thermalcycler);紫外分光光度计(UV-2550型，SHIMADZU公司)、凝胶成像系统等。本发明技术方案除以下特殊说明外，均采用常规的AFLP-毛细管电泳技术。本发明的分子鉴别方法，由样本DNA的提取、选择接头和预扩引物、AFLP引物筛选、AFLP扩增、AFLP-毛细管电泳检测、数据处理和分析六个步骤组成，按以下步骤进行1、样本DNA的提取样本各l.Og，分别按照改进的CTAB法(DoyleJ.DNAprotocolsforplants-CTABtotalDNAisolation.In:HewittGM,JohnstonA,eds.Moleculartechniquesintaxonomy.Berlin:Springer,1991,283-293.)提取总DNA(见第二章)。提取的总DNA样本经RNA酶A纯化后，用紫外分光光度计测定260nm和280nm下的光密度值，以确定其纯度和浓度，并将总DNA浓度稀释到200ng/ul，用于PCR反应。2、选择接头和预扩引物RNA酶、限制性内切酶EcoRI酶、MseI酶、T4连接酶、Taq酶、dNTP、PCRreactionbuffer,均购自上海生工和宝生物公司；EcoRl接头、MseI接头和引物由贝克曼库尔特(BeckmanCoulter)公司购自TAKALA公司,见表1表1.EcoRI，Msel接头与预扩引物序列接头或引物序列EcoRI接头5'-CTCGTAGACTGCGTACC-3，3'-CTGACGCATGGTTAA-5'Msel接头5'-GACGATGAGTCCTGAG-3'3'-TACTCAGGACTCATS'EcoRI预扩引物5'-GACTGCGTACCAATTC-3'(EO)5'-GACTGCGTACCAATTCA-3'(El)Msel预扩引物5'-GATGAGTCCTGAGTAA-3'(MO)5'隱GATGAGTCCTGAGTAAA國3'(Ml)3、AFLP引物筛选选择性扩增引物参照黄意欢(黄意欢，2004.茶树分子遗传图谱构建及多酚氧化酶基因的SNP研究.湖南农业大学博士学位论文)，黄福平(黄福平，2005.茶树遗传多样性分析与遗传图谱构建.浙江大学博士学位论文)等文献报道从E37M32，E37M47,E41M42,E41MSS,E41M47，E-AACM-CAT,E-ACTM-CTC，E-ACTM-CTC等引物中筛选出了E-AAC/M-CTG和E-AAC/M-CTA两对扩增多态性最高的引物，用于AFLP分析。其序列如下E國AAC:5'-GACTGCGTACCAATTCAAC-3'M-CTG:5'-GATGAGTCCTGAGTAACTG-3'M-CTA:5'-GATGAGTCCTGAGTAACTA-3'4、AFLP扩增样本DNA经限制性内切酶EcoRI、MseI分别酶切；双酶切产物加入EcoRI和MseI接头序列和T4连接酶进行连接；连接产物加入EcoRl和MseI引物进行预扩增，反应热循环程序为94'C预变性2min，然后进入循环，每个循环94'C变性20sec，56'C退火30sec，72r延伸2min，共20个热循环，最后60。C延伸30min，4'C冷却后取出；预扩增产物稀释20倍后，加入选定的引物进行选择性扩增。选择性扩增为两段循环，94t:预变性2min后，第一段循环为94。C变性20sec，66-56。C退火30sec，72。C延伸2min，共10个热循环。其中，退火温度从66。C开始，每个循环降rC。第二段循环为94。C变性20sec，56。C退火30sec，72'C延伸2min，共20个循环，最后60"C延伸30min，冷却后取出检测。扩增反应在MJResearch(Waltham，MA，USA)PTC200-we11thermalcycler上，参照GIBCOBRL(GIBCOBRL.InstructionmanualAFLPTManalysissystem,AFLPstartprimerkit.VersionB,2003)进行。5、AFLP-毛细管电泳检测选择性扩增样本检测在贝克曼库尔特(BeckmanCoulter)公司CEQ8000遗传分析系统上完成。上样液甲酰胺10ul，Sizestandard-6000.2ul，Sample3ul(稀释10倍)；电压:6KV，电流:4Ma时间:50min。该系统采用荧光标记和毛细管电泳分离技术，扩增产物在高分辨率毛细管中电泳分离，激光激发荧光采集数据，电泳结果通过软件自动统计分析并转化为"o、l"原始数据矩阵备用。同时，导出电泳分离图谱。6、数据处理和分析得到的原始数据矩阵，用POPGENEversion1.32(YehFC.etal.,MicrosoftWindows-basedfreewareforpopulationgeneticanalysis.Release1.31.Edmonton:UniversityofAlberta.1999.)软件进行遗传多样性分析；居群遗传多样性以常规的多态位点百分率(P)、Nei's(NeiM.Analysisofgenediversityinsubdividedpopulations,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,1973,70:3321-3323.)基因多样性指数(期望杂合度)(He)、Shannon多样性指数(Ho)和基因多样度(Ht)度量，经POPGENEversion1.32分析得到上述数据。同时，进行电泳分离图谱的特征峰比对分析。图1样品佛香茶引物E-AAC/M-CTGAFLP选择性扩增电泳图谱图2样品佛香茶引物E-AAC/M-CTAAFLP选择性扩增电泳图谱图3样品紫娟引物E-AAC/M-CTGAFLP选择性扩增电泳图谱图4样品紫娟引物E-AAC/M-CTAAFLP选择性扩增电泳图谱图5样品普洱1引物E-AAC/M-CTGAFLP选择性扩增电泳图谱图6样品普洱1引物E-AAC/M-CTAAFLP选择性扩增电泳图谱图7样品勐混引物E-AAC/M-CTGAFLP选择性扩增电泳图谱(古茶园的AFLP标准图谱)图8样品勐混引物E-AAC/M-CTAAFLP选择性扩增电泳图谱(古茶园的AFLP标准图谱)图9样品布朗山引物E-AAC/M-CTGAFLP选择性扩增电泳图谱(古茶园的AFLP标准图谱)图10样品布朗山引物E-AAC/M-CTAAFLP选择性扩增电泳图谱(古茶园的AFLP标准图谱)图11样品曼迈引物E-AAC/M-CTGAFLP选择性扩增电泳图谱(古茶园的AFLP标准图谱)图12样品曼迈引物E-AAC/M-CTAAFLP选择性扩增电泳图谱(古茶园的AFLP标准图谱)图13样品南糯山竹林引物E-AAC/M-CTGAFLP选择性扩增电泳图谱(古茶园的AFLP标准图谱)图14样品南糯山引物E-AAC/M-CTAAFLP选择性扩增电泳图谱(古茶园的AFLP标准图谱)图15样品老班章引物E-AAC/M-CTGAFLP选择性扩增电泳图谱(古茶园的AFLP标准图谱)图16样品老班章引物E-AAC/M-CTAAFLP选择性扩增电泳图谱(古茶园的AFLP标准图谱)图17样品巴达引物E-AAC/M-CTGAFLP选择性扩增电泳图谱(古茶园的AFLP标准图谱)图18样品巴达引物E-AAC/M-CTAAFLP选择性扩增电泳图谱(古茶园的AFLP标准图谱)图19样品勐库茶引物E-AAC/M-CTGAFLP选择性扩增电泳图谱(古茶园的AFLP标准图谱)图20样品勐库茶引物E-AAC/M-CTAAFLP选择性扩增电泳图谱(古茶园的AFLP标准图谱)图21样品白莺山引物E-AAC/M-CTGAFLP选择性扩增电泳图谱(古茶园的AFLP标准图谱)图22样品白莺山引物E-AAC/M-CTAAFLP选择性扩增电泳图谱(古茶园的AFLP标准图谱)图23样品景迈引物E-AAC/M-CTGAFLP选择性扩增电泳图谱(古茶园的AFLP标准图谱)图24样品景迈引物E-AAC/M-CTAAFLP选择性扩增电泳图谱(古茶园的AFLP标准图谱)图25样品1引物的E-AAC/M-CTAAFLP选择性扩增电泳图谱图26样品1引物的E-AAC/M-CTA重复实验的AFLP选择性扩增电泳图谱实施例本发明的主要实验仪器CEQ8000毛细管电泳系统(BeckmanCoulter);台式冷冻离心机(BeckmanCoulter);PCR仪(MJResearch(Waltham,MA,USA)PTC200-wellthermalcycler);紫外分光光度计(UV-2550型，SHIMADZU公司)、凝胶成像系统。1、样本的收集总共收集了样本39个，分别来自普洱茶的原产地西双版纳州、普洱市、临沧地区、以及国外老挝、缅甸和泰国39个不同的区域等。西双版纳州的茶样有19个，其中台地茶4个、老树茶6个；普洱市的茶样有6个，其中台地茶5个、老树茶l个；临沧地区的茶样7个，其中台地茶3个、老树茶4个；老挝的茶样2个；缅甸的茶样2个，泰国的茶样3个。详见表3-l、表3-2和表3-3。序号l-8(即样品l-9)，序号18-19(即临沧l-2)，序号23(即老茶树)的茶样为从勐海市场上收购，不知其明确的来源；序号30(即二嘎子)的茶样为为大理茶种C.序号10(即佛香茶)的茶样是云抗10号与福鼎白毛茶的杂交后代，为中小叶种；其余样本，都是云南大叶种(aw^〃z'flW"e"w'svar.a^o脂'ca阿萨姆茶)所制晒青毛茶。即序号9-20的茶样都是台地茶(台地茶园生产)，序号21-22、序号24-32的茶样都是老树茶(古茶园生产)。为了保证结果的重复性，进行了部分样品的重复试验，见图25-图26。2、选择接头和预扩引物RNA酶、限制性内切酶EcoRI酶、MseI酶、T4连接酶、Taq酶、dNTP、PCRreactionbuffer,均购自上海生工和宝生物公司；EcoRl接头、MseI接头和引物由贝克曼库尔特(BeckmanCoulter)公司购自TAKALA公司，见表1。3、样本DNA的提取样本各l.Og，分别按照改进的CTAB法(DoyleJ.DNAprotocolsforplants-CTABtotalDNAisolation.In:HewittGM,JohnstonA,eds.Moleculartechniquesintaxonomy.Berlin:Springer,1991，283-293.)提取总DNA(见第二章)。提取的总DNA样本经RNA酶A纯化后，用紫外分光光度计测定260nm和280nm下的光密度值，以确定其纯度和浓度，并将总DNA浓度稀释到200ng/ul，用于PCR反应。4、AFLP引物筛选选择性扩增引物参照黄意欢(黄意欢，2004.茶树分子遗传图谱构建及多酚氧化酶基因的SNP研究.湖南农业大学博士学位论文)，黄福平(黄福平，2005.茶树遗传多样性分析与遗传图谱构建.浙江大学博士学位论文)等文献报道从E37M32，E37M47,E41M42，E41MSS，E41M47，E-AACM-CAT,E-ACTM-CTC，E-ACTM-CTC等引物中筛选出了E-AACM-CTC和E-AACM-CTG两对扩增多态性最高的引物，用于AFLP分析。其序列如下E-AAC:5'-GACTGCGTACCAATTCAAC-3，M-CTG:5'-GATGAGTCCTGAGTAACTG-3'M國CTA:5'-GATGAGTCCTGAGTAACTA-3'5、AFLP扩增样本DNA经限制性内切酶EcoRI、MseI分别酶切；双酶切产物加入EcoRI和MseI接头序列和T4连接酶进行连接；连接产物加入EcoRI和MseI引物进行预扩增，反应热循环程序为94'C预变性2min，然后进入循环，每个循环94。C变性20sec，56"C退火30sec，72'C延伸2min，共20个热循环，最后60。C延伸30min，4"冷却后取出；预扩增产物稀释20倍后，加入选定的引物进行选择性扩增。选择性扩增为两段循环，94'C预变性2min后，第一段循环为94r变性20sec，66-56t:退火30sec，72。C延伸2min，共10个热循环。其中，退火温度从66。C开始，每个循环降rC。第二段循环为94。C变性20sec，56t退火30sec，72。C延伸2min，共20个循环，最后60'C延伸30min，冷却后取出检测。扩增反应在MJResearch(Waltham,MA,USA)PTC200-wellthermalcycler上，参照GIBCOBRL(GIBCOBRL.InstructionmanualAFLPTManalysissystem,AFLPstartprimerkit.VersionB，2003)进行。6、AFLP-毛细管电泳检测选择性扩增样本检测在贝克曼库尔特(BeckmanCoulter)公司CEQ8000遗传分析系统上完成。上样液甲酰胺10ul，Sizestandard-6000.2ul，Sample3ul(稀释10倍)；电压:6KV，电流:4Ma时间:50min。该系统釆用荧光标记和毛细管电泳分离技术，扩增产物在高分辨率毛细管中电泳分离，激光激发荧光采集数据，电泳结果通过软件自动统计分析并转化为"O、l"原始数据矩阵备用。同时，导出电泳分离图谱。7、数据处理和分析得到的原始数据矩阵，用POPGENEversion1.32(YehFC.etal.，MicrosoftWindows-basedfreewareforpopulationgeneticanalysis.Release1.31.Edmonton:UniversityofAlberta.1999.)软件进行遗传多样性分析；居群遗传多样性以常规的多态位点百分率(P)，Nei's(NeiM.Analysisofgenediversityinsubdividedpopulations,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,1973,70:3321-3323.)基因多样性指数(期望杂合度)(He)，Shannon多样性指数(Ho)和基因多样度(Ht)度量，经POPGENEversion1.32分析得到上述数据。同时，进行电泳分离图谱的特征峰比对分析。8、结果与分析(1)DNA提取与AFLP引物组合的扩增结果两对选中的AFLP弓I物共扩增出可重复的426条带，检测出420个多态性(P=98.58%)，平均每对引物扩增的总带数为213条，多态性条带210。引物E-AAC/M-CTG的P=98.21%，引物E-AAC/M-CTA的P=99.01%，见表2。表2所用引物组合及其检测效率引物组合扩增位点多态性位多态性比_^__E隱AAC/M-CTG22321998.21E隱AAC/M-CTA20320199.01总计Total42642098.58平均Average_^_^12_(2)AFLP-毛细管电泳图谱分析从图1-图26，表明传统的DNA电泳图谱通过AFLP-毛细管电泳技术转化为容易鉴别的峰形图，不同的样品的峰形图，整个峰形图轮廓、最高峰、次高峰、峰值大小等都有差别，据此峰形图，可以从典型的主要特征峰和染色信号的最高值和次高值；从峰形图的整个形状；与对照的峰形图比较将其与其他材料区别出来。两对引物39个样品AFLP-毛细管电泳图谱都有一定的差异，见图1图26，表3-l、表3-2、表3-3、表4-l、表4-2、表4-3。可用以下差异，进行鉴别:'①引物E-AAC/M-CTG的特征峰区别(见表3-l、表3-2、表3-3及相应AFLP电泳图谱)二嘎子茶(序号30)96bp特征峰；佛香茶(序号10)的234bp特征峰；紫娟(序号11)的83bp特征峰；景迈茶(序号32)的216bp特征峰；勐库茶(序号28)的132bp特征峰，澜沧大山(序号17)的210bp特征峰；老挝丰沙里(序号34)的l'71bp，210bp特征峰；缅甸2(序号36)的152bp、267bp特征峰。②引物E-AAC/M-CTA的特征峰区别(见表4-1、表4-2、表4-3及相应AFLP电泳图谱)缅甸2(序号36)的176bp和332bp特征峰，景迈茶(序号32)的177bp、219bp、283bp特征峰等。③对于图形比较类似的样品，可以依据染色信号的最高值和次高值来进行比较区别，如勐海格朗和(序号24)、老班章(序号25)、巴达(序号26)，他们的引物E-AAC/M-CTA最高值都是337bp，但次高值分别为176bp、132bp、169bp。因而可成功的将三者区分出来。表5是随机抽取的8个茶样的两对引物的特征峰区别简表，通过简表即可一目了然地鉴别出8个不同的茶样。表58个茶样的引物E-AAC/M-CTG和引物E-AAC/M-CTA特征峰区别<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>单位为碱基对bp;*代表染色信号最高值；#代表染色信号次高值。⑤建立了普洱茶原产地的9个著名古茶园的AFLP标准图谱(见图7-图24)根据39个样品的39张AFLP-毛细管电泳图谱，建立了西双版纳州的勐海老班章、勐海南糯山、勐海曼迈、勐海巴达、勐海布朗山、勐海勐混，临沧地区的勐库和白莺山，普洱市的景迈9个著名古茶园的AFLP标准图谱(见图7-图24)，据此可区分这9个不同区域的古茶园晒青毛茶；通过建立的上述9个著名古茶园的AFLP标准图谱，还可将这9个古茶园晒青毛茶与其它台地茶园晒青毛茶区分开来。通过对39个样品的AFLP-毛细管电泳图谱的认真分析，每一张图谱都有各自的特征，完全可以据此分辨出不同区域的样品。与牝同时，重复性试验表明，见图25~图26，AFLP-毛细管电泳图谱有非常高的重复性。因此，本发明成功地建立了不同区域普洱茶晒青毛茶的分子鉴别方法。为制定普洱茶晒青毛茶质量标准、打击普洱茶的假冒伪劣产品，普界茶原产地保护奠定了必备的科学数据和技术保障，促进了普洱茶的可持续健康发展。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表3-239个晒青毛茶引物E-MC/M-CTG的毛细管电泳图谱主要峰值<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表4-139个晒青毛茶引物E-MC/M-CTA的毛细管电泳图谱主要峰值<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表4-239个晒青毛茶引物E-MC/M-CTA的毛细管电泳图谱主要峰值<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表4-339个晒青毛茶引物E-MC/M-CTA的毛细管电泳图谱主要峰值<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>单位为碱基对bp;*代表染色信号最高值；tt代表染色信号次高值权利要求1、一种不同区域普洱茶晒青毛茶的分子鉴别方法，由样本DNA的提取、选择接头和预扩引物、AFLP引物筛选、AFLP扩增、AFLP-毛细管电泳检测、数据处理和分析六个步骤组成，其特征在于(1)在AFLP引物筛选中，筛选出E-AAC/M-CTG和E-AAC/M-CTA两对扩增多态性最高的引物，用于AFLP分析，其序列如下，E-AAC5’-GACTGCGTACCAATTCAAC-3’M-CTG5’-GATGAGTCCTGAGTAACTG-3’M-CTA5’-GATGAGTCCTGAGTAACTA-3’；(2)在AFLP-毛细管电泳检测中，选择性扩增样本检测在CEQ8000遗传分析系统上完成；其上样液甲酰胺10ul，Sizestandard-6000.2ul，稀释10倍的Sample3ul；电压6KV，电流4Ma，时间50min；其扩增产物在高分辨率毛细管中电泳分离，激光激发荧光采集数据，电泳结果通过软件自动统计分析并转化为“0、1”原始数据矩阵备用；同时，导出电泳分离图谱。2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于在样本DNA的提取中，样本各取1.0g，分别按照改进的CTAB法提取总DNA，提取的总DNA样本经RNA酶A纯化后，用紫外分光光度计测定260nm和280nm下的光密度值，以确定其纯度和浓度，并将总DNA浓度稀释到200ng/ul，用于PCR反应。3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于EcoRI接头的核苷酸序列为5'-CTCGTAGACTGCGTACC-3，、3'-CTGACGCATGGTTAA-5';MseI接头的核苷酸序列为5'-GACGATGAGTCCTGAG-3'、3'-TACTCAGGACTCATS';EcoRI预扩引物的核苷酸序列为5'-GACTGCGTACCAATTC-3'(EO)、5'-GACTGCGTACCAATTCA國3'(El);MseI预扩引物的核苷酸序列为5'-GATGAGTCCTGAGTAA-3'(MO)、5'-GATGAGTCCTGAGTAAA-3'(Ml)。4、根据权利要求1所述的方法，其特征在于在AFLP扩增中，样本DNA经限制性内切酶EcoRI、MseI分别酶切；双酶切产物加入EcoRI和MseI接头序列和T4连接酶进行连接；连接产物加入EcoRl和MseI引物进行预扩增，反应热循环程序为94'C预变性2min，然后进入循环，每个循环94'C变性20sec，56'C退火30sec，72。C延伸2min，共20个热循环，最后6(TC延伸30min，4'C冷却后取出；预扩增产物稀释20倍后，加入选定的引物进行选择性扩增；选择性扩增为两段循环，94"C预变性2min后，第一段循环为94r变性20sec，66-56。C退火30sec，72。C延伸2min，共10个热循环；其中，退火温度从66'C开始，每个循环降TC;第二段循环为94'C变性20sec，56'C退火30sec，72。C延伸2min，共20个循环，最后6(TC延伸30min，冷却后取出检测；扩增反应在MJResearchPTC200-we11thermalcycler上05、根据权利要求1所述的方法，其特征在于得到的原始数据矩阵，用POPGENEversion1.32软件进行遗传多样性分析，获得居群遗传多样性以常规的多态位点百分率(P)，Nd's基因多样性指数He，Shannon多样性指数Ho，基因多样度Ht;同时，'进行电泳分离图谱的特征峰比对分析。全文摘要本发明公开一种不同区域普洱茶晒青毛茶的分子鉴别方法，属分子标记
技术领域：
。该方法由样本DNA的提取、选择接头和预扩引物、AFLP引物筛选、AFLP扩增、AFLP-毛细管电泳检测、数据处理和分析六个步骤组成。AFLP引物为E-AAC/M-CTG和E-AAC/M-CTA两对扩增多态性最高的引物。选择性扩增样本检测在CEQ8000遗传分析系统上完成，电压为6KV。本发明的一对引物可扩增出200多个位点，位点差异在1bp都能检测到；建立了西双版纳老班章、临沧勐库、普洱景迈等9个著名古茶园的AFLP标准图谱，据此能鉴别不同区域的普洱茶晒青毛茶、著名古茶园普洱茶的真伪，为普洱茶原产地保护提供了技术保障。文档编号C12Q1/68GK101353701SQ200810058670公开日2009年1月28日申请日期2008年7月11日优先权日2008年7月11日发明者季鹏章,俊张,黄兴奇申请人:云南省农业科学院茶叶研究所