专利名称：新型单纯疱疹病毒ⅱ型dna疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种单纯疱疹病毒II型DNA疫苗，它包括含全长的糖蛋白D基因的真核表达质粒pgD和含CpG基序的真核表达质粒pCpG。
真核表达质粒pgD由真核表达载体pKan和插入其中的单纯疱疹病毒II型糖蛋白D基因组成。真核表达载体pKan为pcDNA3中的Amp+基因片断被Kan基因片段所取代后构建的载体。真核表达载体pCpG由真核表达载体pKan和插入其中的3-10个CpG基序组成。全长的糖蛋白D基因来源于单纯疱疹病毒II型毒株。
本发明首先构建了具有卡那霉素抗性基因的真核表达载体。本发明设计的载体具有以下几个特点(1)采用卡那霉素抗性基因，避免使用氨卞青霉素抗性基因带来的对过敏人群的潜在危害性；(2)含有质粒复制子、多克隆位点和真核表达调控必需元件(包括启动子、增强子、转录终止信号)。本发明设计一对引物从质粒pET-28a(+)上通过PCR扩增获取kan+基因片断，设计第二对引物从质粒pcDNA3上通过高保真PCR获取除Amp+基因片断以外的全部质粒片断。将得到的两个PCR产物连接重组获得新型真核表达质粒载体pkan。
本发明插入的外源基因来源于单纯疱疹病毒II型sav株糖蛋白D基因，其结构描述如下所示 (1)序列特征 长度1314bp 类型核酸 链数双链 几何结构线性 (2)分子类型DNA (3)来源单纯疱疹病毒II型sav株，购自中国科学院病毒听。
(4)序列描述如序列表所示。
本发明合成了含有3-10个CpG基序的片断，通过多克隆位点插入到自己构建的新型真核表达载体pkan中，获得pCpG。
本发明从单纯疱疹病毒II型sav株糖蛋白D基因中获取全长的gD基因克隆自己构建的新型真核表达载体pkan中，获得pgD；由真核表达载体pkan和插入其中的3-10个CpG基序获得pCpG；按不同比例混合组成DNA疫苗。该疫苗可诱导机体产生有效的体液免疫和细胞免疫，预防和治疗单纯疱疹病毒II型感染，解决单纯疱疹病毒II型感染反复复发的严重问题。
本发明的有益效果本发明具有预防和治疗作用的单纯疱疹病毒II型DNA疫苗，DNA疫苗由于具有多肽疫苗的安全性和减毒活疫苗诱导全面免疫应答的高效性，DNA疫苗具有诸多传统疫苗没有的优越性，它能激发机体同时产生持久的体液和细胞免疫，制备简单且纯度很高，进入体内后既不插入染色体，DNA也不复制，因而比较安全。
图1真核表达质粒载体pKan的构建图谱 图2真核表达质粒载体pKan酶切鉴定结果 1.100bp DNA Ladder Plus 2.pKan/Ssp I 3.pKan/Bgl II and Xho I 4.pKan 5.PCR得到的kan+基因片断 6.PCR得到的质粒长片断 图3Balb/c小鼠第三次免疫后血清ELISA检测IgG结果 图4Balb/c小鼠经免疫接种后流式细胞仪检测CD4+、CD8+结果 图5Balb/c小鼠经免疫后攻毒结果
具体实施例方式 实施例1新型真核表达载体pkan的构建 1.引物设计 (1)设计第一对引物从质粒pET-28a(+)上通过PCR扩增获取kan+基因片断上游引物P1 5’GCCCTTAAGATGAGCCATATTCAACGG 3’(下划线处为Af1 II酶切位点)； 下游引物P2 5’AGTCCGCGGTTAGAAAAACTCATCGAG3’(下划线处为Sac II酶切位点)； (2)设计第二对引物从质粒pcDNA3上通过高保真PCR获取除Amp+基因片断以外的全部质粒片断 上游引物P3 5’GCGGCTTAAGACTCTTCCTTTTTCAAT 3’(下划线处为Af1 II酶切位点)； 下游引物P4 5’ATACCGCGGCTGTCAGACCAAGTTTAC 3’(下划线处为Sac II酶切位点)；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
2.PCR扩增 (1)以质粒pET-28a(+)为模板进行PCR扩增，获得两端分别具有Af1 II和Sac II酶切位点的kan+基因片断(约810bp)。反应体系及条件如下 反应体系 10×PCR Buffer for Taq10μl Mgcl2 8μl 10mM dNTP 8μl 20μM P1 Primer 2μl 20μM P2 Primer 2μl pET-28a(+)(1∶100稀释)3μl Taq酶 1μl 无菌双蒸水66μl 100ul 反应条件 94℃30s，54℃40s，72℃1min，30次循环后，72℃延伸10min。
PCR产物经1.5％琼脂糖电泳分析鉴定确认后，进行NH4AC沉淀(1VOL PCR产物+1/4VOL 10M NH4AC+2.5VOL无水乙醇，室温沉淀15min，室温13000rpm5min离心，去上清70％酒精洗涤，室温13000rpm 3min离心，去上清65℃烘干)。沉淀溶于100μl双蒸水中，得到PCR1。
(2)以质粒pcDNA3为模板进行高保真PCR扩增，获得两端分别具有Af1 II和SacII酶切位点的除Amp+基因片断以外的全部质粒片断(约4580bp)。反应体系及条件如下 反应体系 10×PCR Buffer for Taq plus 10μl 10mM dNTP8μl 20μM P3 Primer 2μl 20μM P4 Primer 2μl pcDNA3(1∶100稀释) 3μl Taq plus酶 1μl 无菌双蒸水 74μl 100ul 反应条件 94℃45s，54℃45s，72℃6min，30次循环后，72℃延伸10min。
PCR产物经1.5％琼脂糖电泳分析鉴定确认后，进行NH4AC沉淀(1VOL PCR产物+1/4VOL 10M NH4AC+2.5VOL无水乙醇，室温沉淀15min，室温13000rpm5min离心，去上清70％酒精洗涤，室温13000rpm 3min离心，去上清65℃烘干)。沉淀溶于100μl双蒸水中，得到PCR2。
3.连接重组获得新型真核表达质粒载体pkan (1)用限制性内切酶Af1 II和Sac II分别对两个PCR产物进行双酶切，反应体系及条件如下 PCR1 60μl PCR260μl 10×酶切buffer8μl10×酶切buffer 8μl Af1 II2μlAf1 II 2μl SacII 2μlSacII 2μl H2O 8μlH2O 8μl 80ul80ul 37℃水浴酶切4hr。
(2)酶切产物进行NH4AC沉淀，然后分别溶于50μl双蒸水中。
(3)用T4DNA连接酶对酶切产物进行连接。
PCR1 5μl PCR2 10μl 10×buffer for T4 DNA ligase 3μl T4 DNA ligase 1μl H2O11μl 30ul 4℃连接过夜。
4.大肠杆菌感受态细胞的制备 (1)用无菌接种环蘸取大肠杆菌菌株培养液在基本培养基(LB)平板上划板，37℃培养12-16hr。
(2)挑取单菌落到3ml LB培养液中，37℃振荡培养过夜。
(3)取60μl过夜培养物入3ml新鲜的LB培养液中，37℃振荡培养2hr。
(4)菌液倒入1.5ml eppendorf管中，置冰上10min，冷却至0℃。
(5)4℃2400rpm 5min回收细胞。
(6)弃上清，用600μl 0.1M CaCl2重悬，放冰上10min。
(7)4℃2400rpm 5min回收细胞。
(8)用100μl 0.1M CaCl2重悬，感受态细胞即成。
5.大肠杆菌的转化实验 (1)5μl连接产物入100ul感受态细胞，混匀，置冰浴中30min。
(2)放入42℃水浴中90sec。
(3)冰浴2min，加新鲜LB培养液300μl。
(4)37℃水浴，温育1hr，每隔15min轻轻摇动。
(5)取150μl培养物涂于含50μg/ml卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜。
6.转化子筛选 选择在Kan平板上的白色菌落，用接种环挑至含Kan的LB液体培养液中，37℃培养过夜。
7.碱裂解法小量提取质粒DNA (1)将过夜培养的细菌，12000rpm 30sec收集菌体，去除上清。
(2)沉淀中加100μl冰预冷的Sol I，剧烈振荡。
(3)加200μl Sol II均匀混和内容物，将离心管置冰上5min (4)加150μl冰预冷Sol III，混匀，置冰上3~5min，室温12000rpm 5min离心，取上清至1.5ml eppendorf管中。
(5)加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇，振荡混匀，室温12000rpm 1min离心，取上层水相至另一新的1.5ml eppendorf管中。
(6)加入1ml无水乙醇，室温放置2min，室温12000rpm 5min离心。
(7)弃上清，用70％酒精洗，并于65℃干燥。
8.酶切鉴定 用Bgl II、Xho I对所提取的质粒DNA进行双酶切鉴定，Ssp I进行单酶切鉴定。
反应体系及条件如下 质粒DNA 10μl 质粒DNA 10μl 10×酶切Buffer3μl10×酶切Buffer3μl Bgl II1μlSsp I 2μl Xho I 1μlH2O 15μl H2O 15μl 30ul 30ul 37℃酶切2hr，并用1％琼脂糖电泳分析结果。
根据新型真核表达质粒载体pKan质粒图谱显示，kan+基因片断插入点上游约20bp处和kan+基因片断内约360bp处各有一个Ssp I酶切位点，所以使用Ssp I对pKan进行单酶切，经琼脂糖凝胶电泳后可以观察到一条大小约为380bp的条带(图2)。与此同时在kan+基因片断插入点上游有一个Bgl II酶切位点，配合多克隆位点中的Xho I酶切位点，经双酶切后，琼脂糖凝胶电泳可以观察到一条大小约为960bp的条带(图2)。根据以上结果可以确定PCR1片断和PCR2片断已经正确连接，加上经pKan转化过的E.coli Tg1能够在含50μg/ml卡那霉素的培养基中正常生长，说明kan+基因已经有效表达，新型真核表达质粒载体pKan构建成功。
选择含有正确克隆结果的菌株继续培养，并制作甘油菌-30℃保存。
实施例2pgD的制备 1.HSV-2基因组DNA的提取 (1)HSV-2Sav株接种Vero细胞，待细胞出现+++病变后，收集细胞沉淀，用PBS洗涤，加入STE裂解液，混匀，加入20mg/ml的蛋白酶K至终浓度未100ug/ml混匀，50C°轻摇过夜。
(2)反应液加入等体积的酚∶氯仿，混匀。12000r/pm离心10min。
(3)吸取上层水相，加入等体积的氯仿，12000r/pm离心10min。
(4)吸取上层水相，加入2倍体积的冰乙醇沉淀过夜，12000r/pm离心10min。
(5)沉淀用70％的乙醇洗涤，12000r/pm离心10min，弃上清。
(6)沉淀在室温下干燥，TE溶解，-20C°保存，备用。
2.全长糖蛋白gD的PCR扩增 (5)根据HSV-2gD基因的编码序列以及质粒载体pKan的酶切位点设计引物上游引物P1 5’ATCGAATTCAACCACTAGTCGCCG 3’(下划线处为EcoRI酶切位点)；下游引物P25’CGCTCGAGACTCCCTTTATGC 3’(下划线处为XhoI酶切位点)； (6)PCR反应体系 10×PCR Buffer 10u1 HSV-2基因组模板DNA 5ul 10mmol/L dNTP Mix 8ul 上游引物P1 2ul 下游引物P2 2ul 无菌双蒸水 66.5ul Taq酶0.5ul 总体积 100ul (7)PCR扩增条件 第一步，94℃变性10min；第二步94℃30s，60℃40s，72℃1min 30s，30次循环；第三步94℃30s，60℃40s，72℃延伸10min。
PCR产物的纯化 PCR产物经1.5％琼脂糖电泳分析鉴定确认后，进行NH4AC沉淀(1VOLPCR产物+1/4VOL 10M NH4AC+2.5VOL无水乙醇，室温沉淀15min，室温12000rpm 5min离心，去上清70％酒精洗涤，室温12000rpm 5min离心，去上清65℃烘干)。沉淀溶于100μl双蒸水中。
3.PCR产物及载体pKan的酶切 (1)用限制性内切酶EcoR I和Xho I分别对真核表达质粒载体pKan、gD基因片断进行双酶切，反应体系及条件如下 PCR产物/pKan 20μl/15ul 10×酶切buffer 5μl EcoR I 1μl 8 Xho I 1μl H2O23μl/28ul 50ul 37℃水浴酶切2-4hr。琼脂糖电泳鉴定酶切结果。
(2)酶切产物进行NH4AC沉淀，然后分别溶于50μl双蒸水中。
4.酶切产物连接 pKan 10μl gD基因片断 10μl 10×buffer for T4DNA ligase3μl T4DNA ligase 1μl H2O6μl 30ul 4℃连接过夜。
5.大肠杆菌感受态细胞的制备 同实施例1。
6.大肠杆菌的转化实验 同实施例1 7.转化子筛选 选择在Kan平板上的白色菌落，用接种环挑至含Kan的LB液体培养液中，37℃培养过夜。
8.碱裂解法小量提取质粒DNA 同实施例1。
9.阳性克隆的鉴定 用EcoR I和Xho I对所提取的质粒DNA进行双酶切鉴定。
反应体系及条件如下 质粒DNA 10μl 10×酶切Buffer 3μl EcoRI 1μl、Xho I1μl H2O 15μl 30ul 37℃酶切2hr，并用1％琼脂糖电泳分析结果。
选择含有正确克隆结果的菌株继续培养，并制作甘油菌-30℃保存，同时送上海生工生物工程技术服务有限公司测序鉴定。
实施例3pCpG的组建 (1)合成一段含8个CpG序列的DNA片断 正链5’AGCTT TCCAT GACGTT CCT GACGTT CCT GACGTT CCT GACGTT CCT GACGTTCCTC GTCGTT TT GTCGTT TT GTCGTT G 3’(下划线处为Hind III酶切位点粘性末端)； 负链5’AATTC AACGAC AA AACGAC AA AACGAC G AGG AACGTC AGG AACGTC AGGAACGTC AGG AACGTC AGG AACGTC ATGGA A 3’(下划线处为EcoR I酶切位点粘性末端)； DNA由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，合成的两条单链DNA用双蒸水溶解后，两管合成一管，加热到75℃，然后室温慢慢冷却，使两条单链DNA结合成双链DNA。
(2)合成的DNA片断克隆入质粒载体pKan的多克隆位点获得佐剂质粒PCpG ①用限制性内切酶EcoR I和Hind III对真核表达质粒载体pKan进行双酶切，反应体系及条件如下 pKan 25μl 10×酶切buffer 6μl EcoRI2μl Xho I2μl H2O 25μl 60μl ②酶切产物进行NH4AC沉淀，然后溶于50μl双蒸水中。
③用T4DNA连接酶对酶切产物和合成的DNA片断进行连接。
pKan 5μl 合成的DNA片断5μl 10×buffer for T4DNA ligase 3μl T4DNA ligase 1μl H2O 16μl30μl 4℃连接过夜。
④连接产物转化E.coli Tg1感受态细胞。
⑤碱裂解法小量提取质粒DNA。
⑥酶切鉴定 用EcoR I和Hind III对所提取的质粒DNA进行双酶切鉴定。
反应体系及条件如下 质粒DNA 10μl 10×酶切Buffer 3μl EcoR I 1μl Hind III 1μl H2O 15μl 30μl 37℃酶切2hr，并用1％琼脂糖电泳分析结果。
选择含有正确克隆结果的菌株继续培养，并制作甘油菌-30℃保存，同时送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。
⑦大量提取质粒DNA PCpG，生理盐水溶解备用。
实施例4DNA疫苗(pCpG+pKan)对小鼠的免疫实验 (1)免疫方法 Balb/c小鼠，雌性，18g-22g，随机分为4组，每组12只。分别在各组小鼠后腿肌肉注射空质粒(pKan)、pgD、pgD+pKan、pgD+PCpG，注射剂量为100μg/(只·次)，pgD及PCpG按1∶1混合，3周后加强免疫1次，共免疫注射3次。
(2)ELISA检测IgG，方法同实施例3。
(3)流式细胞仪检测CD4，CD8. 最后一次免疫后3周，每组取4只小鼠，眼球取血后处死。取血0.1mL肝素钠抗凝(500U/mL)，加入10μLCD4+，CD8+FITC标记单克隆抗体，避光放置15min，加入红细胞裂解液2mL混匀，待红细胞完全裂解后，1500r/min离心5min.弃上清液，加入PBS缓冲液洗2次，弃上清液加入PBS缓冲液恢复体积至500μL。流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群，每个标本记数淋巴细胞3000个. (3)攻毒实验同实施例3。
结果Balb/c小鼠经免疫接种三次后，血清ELISA检测IgG结果显示pgD+pCpG组最高，略高于pgD组，与空质粒对照组(pKan)相比较均具有显著性差异(P＜0.01)。
Balb/c小鼠经免疫接种第三次后第三周，血液淋巴细胞中CD4+T淋巴细胞百分含量检测结果显示pgD+pCpG组最高，与其他各组比较，经t检验，均有显著性差异(P＜0.05)，与空质粒(pKan)对照组比较有极显著差异(P＜0.01)。
HSV-2病毒攻毒两周后，pKan组小鼠全部死亡；pgD组、pgD+pCpG、pgD+pKan组存活率达100％。
SEQUENCE LISTING
<110>浙江省医学科学院
洪，艳
<120>新型单纯疱疹病毒II型疫苗
<130>新型单纯疱疹病毒II型疫苗
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1314
<212>DNA
<213>herpes simplex virus
<220>
<221>gene
<222>(1)..(1314)
<400>1
aaccactagt cgccgttttt cgtgtgcatc gcgtatcacg gcatggggcg tttgacctcc60
ggcgtcggga cggcggccct gctagttgtc gcggtgggac tccgcgtcgt ctgcgccaaa120
tacgccttag cagacccctc gcttaagatg gccgatccca atcgatttcg cgggaagaac180
cttccggttt tggaccagct gaccgacccc cccggggtga agcgtgttta ccacattcag240
ccgagcctgg aggacccgtt ccagcccccc agcatcccga tcactgtgta ctacgcagtg300
ctggaacgtg cctgccgcag cgtgctccta catgccccat cggaggcccc ccagatcgtg360
cgcggggctt cggacgaggc ccgaaagcac acgtacaacc tgaccatcgc ctggtatcgc420
atgggagaca attgcgctat ccccatcacg gttatggaat acaccgagtg cccctacaac480
aagtcgttgg gggtctgccc catccgaacg cagccccgct ggagctacta tgacagcttt540
agcgccgtca gcgaggataa cctgggattc ctgatgcacg cccccgcctt cgagaccgcg600
ggtacgtacc tgcggctagt gaagataaac gactggacgg agatcacaca atttatcctg660
gagcaccggg cccgcgcctc ctgcaagtac gctctccccc tgcgcatccc cccggcagcg720
tgcctcacct cgaaggccta ccaacagggc gtgacggtcg acagcatcgg gatgctaccc780
cgctttatcc ccgaaaacca gcgcaccgtc gccctataca gcttaaaaat cgccgggtgg840
cacggcccca agcccccgta caccagcacc ctgctgccgc cggagctgtc cgacaccacc900
aacgccacgc aacccgaact cgttccggaa gaccccgagg actcggccct cttagaggat 960
cccgccggga cggtgtcttc gcagatcccc ccaaactggc acatcccgtc gatccaggac1020
gtcgcgccgc accacgcccc cgccgccccc agcaacccgg gcctgatcat cggcgcgctg1080
gccggcagta ccctggcggt gctggtcatc ggcggtattg cgttttgggt acgccgccgc1140
gctcagatgg cccccaagcg cctacgtctc ccccacatcc gggatgacga cgcgcccccc1200
tcgcaccagc cattgtttta ctagaggagt ttccccgctc ccgtgtacct ctgggcccgt1260
gtgggagggt ggctggggta tttgggtggg acttggactc cgcataaagg gagt 131权利要求
1、一种新型单纯疱疹病毒II型DNA疫苗，其特征在于包括含全长的糖蛋白D基因的真核表达质粒pgD和含CpG基序的真核表达质粒pCpG。
2、根据权利要求1所述的新型单纯疱疹病毒II型DNA疫苗，其特征在于含全长的糖蛋白D基因的真核表达质粒pgD由真核表达载体pKan和插入其中的单纯疱疹病毒II型糖蛋白D基因组成。
3、根据权利要求2所述的新型单纯疱疹病毒II型DNA疫苗，其特征在于所述的真核表达载体pKan为pcDNA3中的Amp+基因片断被Kan基因片段所取代后构建的载体。
4、根据权利要求2所述的新型单纯疱疹病毒II型DNA疫苗，其特征在于所述的全长的糖蛋白D基因来源于单纯疱疹病毒II型毒株。
5、根据权利要求1所述的新型单纯疱疹病毒II型DNA疫苗，其特征在于含CpG基序的真核表达质粒pCpG由真核表达载体pKan和插入其中的3-10个CpG基序组成。
全文摘要
本发明涉及医药和基因技术领域，特别是用于预防和治疗单纯疱疹病毒II型感染疾病的一种单纯疱疹病毒II型DNA疫苗。本发明通过分子生物学手段，将单纯疱疹病毒II型的糖蛋白D基因组合到含卡那抗性的真核表达载体pKan中，构建包括含全长的糖蛋白D基因的真核表达质粒pgD和含CpG基序的真核表达质粒的DNA疫苗。这种DNA疫苗免疫机体可产生有效的体液免疫和细胞免疫，预防和治疗单纯疱疹病毒II型感染的疾病如生殖器疱疹等疾病。
文档编号C12N15/79GK101288770SQ20081006018
公开日2008年10月22日 申请日期2008年3月14日 优先权日2008年3月14日
发明者艳 洪, 勇 陈, 方 何, 杨连华 申请人:浙江省医学科学院