专利名称：一种干细胞体外衍生化肝细胞模型的应用的制作方法
技术领域：
本发明属发育生物学和药理学领域，涉及一种模型的用途，具体涉及干细 胞体外衍生化肝细胞模型在肝脏发育能量代谢研究中的应用，可用于以过氧化 物酶体增殖激活受体为靶点的促细胞分化剂筛选。
背景技术：
小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell, ES cell)体外定向分化为肝细胞体 系能模拟体内肝细胞形成和发育，富含大量肝脏发育依赖性生物信息。该系统 中肝细胞多种关键基因表达高于原代成熟肝细胞；具有白蛋白合成和氨降解功 能；代谢功能也比原代肝细胞强，维持时间长，因此无论结构还是功能均高度 模拟整体环境，该模型可用于肝脏发育学和组织工程研究，在药学研究领域非 常适用于药物调控各种基因、蛋白表达谱和与药物代谢作用的研究。
过氧〈七物酶体增生物、激、活受体(peroxisome proliferators-activated receptors, PPARs)是由独立基因编码的一类孤儿核受体，属于II型核受体超家族成员， 可调节众多靶基因的转录过程，参与糖类、脂类代谢以及细胞增殖分化、炎症 等多种病理生理过程。在低等脊椎动物和哺乳动物中存在3种亚型PPAR-a、 PPAR-j3 (又称PPAR-S) 、 PPAR-y。这三个成员在表达模式，组织分布以及对 应的配体上都存在差异。PPAR-a主要在棕色脂肪组织、肝脏、肾脏、十二指 肠、心脏、骨骼肌和血管内皮细胞中表达，与控制脂蛋白代谢、脂肪酸氧化、 细胞摄入脂肪酸有关。PPAR-P组织分布广泛，与脂质代谢和皮肤的平衡态有 关，还与动物的生殖发育，胚胎着床与发育等有关。PPAR-y在棕色和白色脂肪 组织中高度表达，与脂质代谢、血管炎症和促成动脉粥样硬化等有关，并在脂 肪分化和脂肪蓄积方面发挥着重要作用。上述大量研究表明调节脂质代谢和储 存的大量相关基因都是受PPARs家族调控，除此之外，PPARs对某些细胞分 化的调节也有一定作用，如心肌细胞，神经细胞，脂肪细胞以及一些肿瘤细胞。 但对PPAR家族在肝脏生理和分化发育过程中的表达模式和作用所知甚少。
肝脏是能量需求旺盛的器官，肝细胞是线粒体数目丰富的一类细胞。随着 肝脏组织不断发育成熟，必然伴随着线粒体数目上调和能量需求增加，任何干 扰线粒体形成的因素将会影响肝脏细胞的最终分化。线粒体的形成包括氧化磷酸化酶系表达，TCA循环形成以及脂肪p氧化酶系表达，而调控线粒体形成相 关基因转录和蛋白表达的主要是几类核转录因子及其辅激活因子，其中包括 PPARs。 PPARs可以调节细胞的分化、增殖和生存。PPARs在肝脏脂质代谢功 能方面发挥重要调节作用，其功能改变与一些肝脏疾病的发生发展存在某种相 关性。小鼠ES细胞体外分化为肝细胞真实地重现了体内肝细胞分化过程，已 作为一个替代模型广泛用于各种研究，迄今未见干细胞衍生化肝细胞模型在肝 脏发育能量代谢研究中的应用。
发明内容
本发明的一个目的是提供小鼠胚胎干细胞衍生化肝细胞模型在肝脏发育 能量代谢研究中的应用，是在利用肝脏发育能量代谢相关的PPARs家族表达谱 和功能揭示胚胎肝脏发育的生命现象本质中应用。即是利用干细胞衍生化肝细 胞模型阐明肝脏发育能量代谢相关的PPARs家族表达谱和功能，用于揭示胚胎 肝脏发育的生命现象本质。
所述应用是在筛选与评价调节肝脏能量供应的能量代谢诱导剂药物中的 应用。可在以过氧化物酶体增殖激活受体为耙点的促细胞分化剂筛选中应用， 是用于构建以PPARs家族为靶点的高效率药效筛选模型，进行调节肝脏能量供 应药效初步筛选与评价，发现新一类促进干细胞分化为肝细胞的能量代谢诱导 剂。
本发明所述小鼠胚胎干细胞体外衍生肝细胞模型通过以下步骤构建采用 悬滴培养法，将ES细胞以600个细胞/30 ^滴的密度接种于培养皿盖子内表面 上，然后翻转盖子，使盖子上的小滴倒挂成悬滴，培养5天形成拟胚体 (embryoid body, EB)，再将EB转移到放有用明胶包被的24孔板内进行贴壁 培养，此时开始用倒置显微镜每天观察细胞，以捕捉肝细胞定向分化的形态变 化。同时采用免疫荧光法检测肝细胞特异性蛋白表达，以白蛋白特异性染色确 定ES细胞分化而来的是肝细胞。
本发明在细胞层面上对干细胞衍生化肝细胞模型在肝脏发育能量代谢研 究中的应用做了论证，对其中蕴藏的大量生物学信息进行了初步探讨，具体有 以下优点
1. 本发明开拓了干细胞衍生化肝细胞模型的一种新用途，即能作为肝脏发 育能量代谢研究的替代模型。
2. 本发明明确了肝脏线粒体能量系统发育相关的PPARs家族表达特征, 该模型可用于以PPARs为靶点的促肝细胞能量代谢分化剂筛选。
图1为ES细胞衍生化肝细胞形态观察。
图2为JC-1染色检测ES细胞向肝细胞分化过程中线粒体膜电位变化。 图3为RT-PCR法检测ES细胞分化过程中PPAR家族基因的表达。 图4为ES细胞衍生化肝细胞白蛋白和PPAR-oc的表达。 具体实例方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。此外应理解，下面的优选具体 实施方案仅仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例l: ES细胞体外衍生化肝细胞模型通过以下步骤构建
1. 悬滴培养
将ES细胞用胰蛋白酶消化制成细胞密度为2xl(^个/ml的单细胞悬液，以 30 pl接种于直径为10-cm的培养皿的盖子内表面上，培养皿内加入10ml D-Hanks液，然后小心盖上带有许多小滴的盖子，使盖子上的小滴倒挂成悬滴 (每个悬滴约含600个细胞)，置培养箱中培养5d。分化培养液为高糖DMEM， 含0.1mmol.L"p-巯基乙醇，非必需氨基酸和20 %胎牛血清，不含LIF因子。
2. 贴壁培养
在显微镜下用吸管将悬滴培养形成的拟胚体(embryoidbody,EB)，转移到 放有用明胶包被的24孔板内，使其吸附贴壁后，每孔中缓慢加入lml分化培 养液，此时开始用倒置显微镜每天观察细胞，以捕捉肝细胞定向分化的形态变 化。将EB转移至24孔板内记为dO。
3. 免疫荧光法检测肝细胞特异性蛋白表达
样本用纯冷甲醇固定15 min， PBS清洗3遍，每次10 min。再用含10 % 胎牛血清PBS封闭30 min， PBS清洗3遍，每次5 min。然后加入一抗 Monoclonal rabbit anti-Albumin， l:50稀释，4。C孵育过夜。PBS洗3次，每次 10min，吸干多余的液体，再力卩入二抗Rodamin画Conjugated F(ab)2 fragment of Affinity Purified goat anti-Rabbit IgG， 1:200稀释，37。C孵育1.5 h。再用PBS 洗3次，每次lOmin，吸干多余的液体，无荧光甘油封片后用荧光显微镜观察， 拍照记录。以白蛋白特异性染色确定ES细胞分化而来的是肝细胞。参见图l， 其中(A)低倍镜下的肝细胞，xlOO; (B)高倍镜下的肝细胞，x400; (C)肝 细胞特异性白蛋白呈阳性表达，箭头所指是典型的双核肝细胞，x400。实施例2: ES细胞体外衍生化为肝细胞线粒体膜电位变化
收集ES细胞，EB经消化成单个细胞，EB贴壁培养分化成肝细胞样本， 加入JC-1染料孵育15分钟，用PBS洗三次，在荧光倒置显微镜下观察。
结果显示，ES细胞几乎都呈现绿色荧光，提示线粒体膜电位低；EB经消 化后的细胞有红色荧光出现，而经贴壁分化培养成的肝细胞几乎都呈现红色荧 光，这提示随着肝细胞分化发育成熟，细胞膜电位随着肝细胞线粒体的成熟逐 渐增高。参见图2，其中(A)单个ES细胞，xl00; (B) EB经消化后单个 细胞，xl00; (C) EB贴壁培养分化第12天，x50; (D) EB贴壁培养分化 第12天，xl00; (E) EB贴壁培养分化第12天，x200。
实施例3: ES细胞体外衍生化为肝细胞时PPARs家族基因的表达
分别收集ES细胞，EB，贴壁分化第6， 12， 18天的肝细胞，按照Trizol reagent 说明书提取总mRNA。引物序列与实验条件参见表1: 表1.引物序列和PCR反应条件
基因引物序列分子量 (bp)退火温 度(°c)循环 轮数
GAPDH5，.陽TCC ATG CCA TGA CTG CCA CTC-3'2125835
5，'-TGA CCT TGC CCA CAG CCT TG-3'PPARa5，.-GGCTGTAAGGGCTTCTTT -3' 隱CAGGTAGGCTTCGTGGAT -3'13060.540
PPARp5，'-TTG AGC CCA AGT TCG AGT TTG-3'1005930
5，'-CGG TCT CCA CAC AGA ATG ATG國3'PPARy5，-AAT CAG CTC TGT GGA CCT CTC-3'4126135
5，-CTC CAA GAA TAC CAA AGT GCG A-3'PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统观察及拍照分析。
参见图3，实验结果显示，PPAR-a,PPAR-(3和PPAR-Y基因在ES细胞向肝 脏细胞分化过程中均有表达，且均有一定程度的上调趋势。
实施例4:免疫荧光实验检测ES细胞衍生化肝细胞中PPAR-ot的表达 收集贴壁分化d 18的ES细胞衍生化肝细胞样本，用纯冷甲醇固定10 min， 再用牛血清封闭处理30min，然后加入一抗(l)肝细胞特异性蛋白polyclonal goat anti-albumin, 1:50稀释，(2) polyclonal rabbit anti-PPAR-oc， 1:50稀释，4°C 孵育过夜。第二天加入二抗FITC- Conjugated mouse anti-goat IgG或 Rhodamine- Conjugated goat anti-Rabbit IgG， 1:200稀释，37。C孵育1.5 h。无荧 光甘油封片后用荧光显微镜观察，拍照记录。参见图4，结果显示，ES细胞衍生化肝细胞白蛋白呈阳性表达区域PPAR-a 也呈阳性表达。图4中(A)细胞核DAPI染色，x200; (B)肝细胞特异性白蛋白 (ALBUMIN)染色，阳性表达呈红色荧光，x200; (C)过氧化物酶体增生物激活受 体alpha(PPAR alpha)染色，阳性表达呈绿色荧光，x200; (D) B图和C图的叠加， x200 。
实施例5:实时荧光定量PCR检测PPARa激动剂对ES细胞体外衍生化 为肝细胞的影响
分别收集贴壁分化第12， 18天的肝细胞(溶剂对照组和PPAR(x激动剂 WY14643 1(^mol/L诱导组)，常规提取RNA，然后在0.2 ml PCR管中配制反 应溶液总RNA 3吗，Oligo-dT (15 pg/^il) 0.5^1， dNTP mix (10 mmol/L) 1 jxl， 双蒸水(DEPC) 10 pl，将反应管置于PCR仪中，65。C预变性5min。变性反 应结束后在PCR管中配制cDNA第一链合成反应体系，将PCR管子置于PCR 仪中进行42。C保温50min后，70。C变性15 min (灭活反转录酶)，4。C放置。 将cDNA稀释100倍作为模板,加入引物和SYBR Green进行PCR扩增和荧光 标记反应。反应条件为50。C孵育2min，然后95°C 2 min;接着进行40个循 环，95°C， 15 s; 63°C， lmin。引物序列与实验条件参见表2:
表2.引物序列和PCR反应条件
基因引物序列分子量 (bp)退火温 度(°c)循环 轮数
GAPDH5，'-TCC ATG CCA TGA CTG CCA CTC-352205835
5，'-TGA CCT TGC CCA CAG CCT TG-3'PPARa;::-GGCTGTAAGGGCTTCTTT -3' -CAGGTAGGCTTCGTGGAT -3，13060.540
Albumin5，-GACTTTGCACAGTTCCTGGATACA -3' -TTGTGGTTGTGATGTTTAGGCTA -3'1255835
PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统观察及拍照分析。
目的基因表达值的计算法通过一系列的参数设定分析，得到不同样本目
的基因的Ct值。Ct值的含义为每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经 历的循环数。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线 性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。因为比较的是目的基因转录水平的差异， 所以通过检测每个样品的内参照基因，将目的基因归一化。PCR产物的增长形 式为211， n就是循环数。先得到ACt (AC^目的基因Ct-内参照基因Ct)，再转换为原始模板浓度Rati(^2 'Aa。
实验结果显示，根据上述公式计算出贴壁分化12天时溶剂组和PPARa激动 剂组的PPARa表达值分别为0.26士0.04, 0.43±0.09， Albumin表达值分别为 0.36±0.07， 0.58士0.09;而贴壁分化18天各样本的PPARa表达值分别为0.30士0.10, 0.53±0.04， Albumin表达值分别为0.46士0.12， 0.66±0.03。 PPARa激动剂WY14643 诱导组的表达值比溶剂对照组明显上调(尸<0.05)(参见表3)。以目的基因 和内参照基因浓度为横坐标，以Ct值为纵坐标，绘制目的基因和内参照基因 PCR扩增标准曲线，标准曲线相关性良好。
表3经GAPDH校正过的目的基因相对表达值(；士s)_
分化时间 S3 组别 ^ Z^i
29.36±0.15~~1.92±0.10~~0.26±0.04~ 22.11±0.131.23±0.09 0.43±0.09* 24.09±0.111.48±0.09 0.36±0.07
16.76±0.090.79±0.14 0.58+0.09*
26.08±0.15 1.73±0.12 0.30±0.10
18.09±0.05 0.93±0.06 0.53±0.04*
21.01±0.12 1.12±0.13 0.46±0.12
15.08士0.1Q 0.59士0.10 0.66士0.03*
*尸<0.05 vs溶剂组
无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最 大限度地应用本发明。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考， 就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的 上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等 价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
贴壁培养12天
贴壁培养18天
PPARa Albumin
PPARa Albumin
溶剂对照 PPARa激动剂 溶剂对照 PPARa激动剂
溶剂对照 PPARa激动剂 溶剂对照 PPARa激动剂
权利要求
1. 一种小鼠胚胎干细胞体外衍生化肝细胞模型的应用，所述小鼠胚胎干细胞体外定向分化为肝细胞模型通过以下步骤构建采用悬滴培养法，将小鼠胚胎干细胞以600个细胞/30μl滴的密度接种于培养皿盖子内表面上，然后翻转盖子，使盖子上的小滴倒挂成悬滴，培养5天形成拟胚体，再将拟胚体转移到放有用明胶包被的24孔板内进行常规贴壁培养，用倒置显微镜每天观察细胞，以捕捉肝细胞定向分化的形态变化，同时采用免疫荧光法检测肝细胞特异性蛋白表达，以白蛋白特异性染色确定小鼠胚胎干细胞分化而来的是肝细胞。
2. 根据权利要求1所述的一种小鼠胚胎干细胞体外衍生化肝细胞模型的 应用，其特征是在利用肝脏发育能量代谢相关的过氧化物酶体增生物激活受体 家族表达谱和功能揭示胚胎肝脏发育的生命现象本质中应用。
3. 根据权利要求1所述的一种小鼠胚胎干细胞体外衍生化肝细胞模型的 应用，其特征是在筛选与评价调节肝脏能量供应的能量代谢诱导剂药物中的应 用。
全文摘要
本发明提供一种小鼠胚胎干细胞体外衍生化肝细胞模型的应用，主要用于以过氧化物酶体增殖激活受体为靶点的促细胞分化剂筛选。也可利用干细胞衍生化肝细胞模型阐明肝脏发育能量代谢相关的PPARs家族表达谱和功能，揭示胚胎肝脏发育的生命现象本质。也可利用干细胞衍生化肝细胞模型，构建以PPARs家族为靶点的高效率药效筛选模型，进行调节肝脏能量供应药效初步筛选与评价，发现新一类促进干细胞分化为肝细胞的能量代谢诱导剂。本发明开拓了干细胞衍生化肝细胞模型的一种新用途，即能作为肝脏发育能量代谢研究的替代模型，明确肝脏线粒体能量系统发育相关的PPARs家族表达特征，可用于以PPARs为靶点的促肝细胞能量代谢分化剂筛选。
文档编号C12N5/06GK101285051SQ20081006077
公开日2008年10月15日 申请日期2008年4月18日 优先权日2008年4月18日
发明者严洁萍, 吴佳莹, 朱丹雁, 楼宜嘉, 沃燕波 申请人:浙江大学