专利名称：附着型硫酸盐还原菌定量检测方法及所用生物膜取样装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种硫酸盐还原菌定量检测方法及该方法中专用的生物膜取 样装置。
背景技术：
目前，硫酸盐还原菌(SRB)的检测方法主要集中在三个层面 一是传统
的检测方法，包括培养法以及显微镜直接计数法，前者是通过选择性培养基， 在适宜的培养条件下对样品中的细菌进行培养进行活细菌的计数，主要包括平
板菌落计数法、最可几率计数法(most probable number (MPN)，亦称为倍比 稀释法)等；而显微镜直接计数法是适时、快速、准确地测定细菌总量，主要 包括光学显微镜、荧光显微镜等技术，混浊度(比浊)计数法、电阻抗法以及 流式细胞仪测定法等；二是基因层面，基于SRB种属的16S rDNA序列的定性 检测，如基因芯片以及FISH技术对SRB的定量和定性检测，APS还原酶基因 和异化型亚硫酸盐还原酶基因进行定性检测；三是蛋白层面，主要是通过免疫 吸附的原理得以实现，如基于APS还原酶的SRB的快速检测试剂盒。上述现有 的检测方法不适于附着型硫酸盐还原菌的定量检测。
油田系统中硫酸盐还原菌的计数主要是针对的污水流动相中的硫酸盐还 原菌一非附着型硫酸盐还原菌。目前对于非附着型的油田系统内硫酸盐还原菌 (SRB)的计数主要执行中国石油天然气行业标准"油田注入水细菌分析方法 ——绝迹稀释法"(部颁标准)、SY-T0532-93。上述方法存在的问题是检测 需要十四天的时间，由于检测周期较长，不能有效、即时地指导生产实践，在 实际操作过程中有些严格的厌氧SRB菌无法生存，导致SRB菌的记数结果不准 确，不能真实的反映生产实际情况，同时检测费用较高。
授权公告号为CN 100348731C、授权公告日为2007年11月4日的发明专 利提出了一种油田水质硫酸盐还原菌的定量检测方法;授权公告号为CN 1003了2943C、授权公告日为2008年3月5日的发明专利$#出了一种硫酸盐还 原菌直接倍比稀释PCR快速定量检测方法；上述现有技术中均没有提到附着型硫酸盐还原菌的定量检测方法。因非附着型的油田系统内硫酸盐还原菌(SRB) 的定量检测方法存在检测周期较长致使记数结果不准确等问题而无法适于附 着型硫酸盐还原菌的定量检测，现有技术中又没有专门提出对附着型硫酸盐还 原菌的定量检测方法，因此针对罐壁和管壁上的硫酸盐还原菌一附着型硫酸盐 还原菌的检测还没有开展。然而在实际的生产中附着型的硫酸盐还原菌是造成 油田腐蚀和硫化物产生的重要原因。因此，对附着型硫酸盐还原菌的检测更加 具有重要的意义。
发明内容
本发明为了解决现有的硫酸盐还原菌检测方法无法实现附着型硫酸盐还 原菌的快速、较准确的定量检测，且现有的硫酸盐还原菌检测方法费用较高的 问题；而提供了一种附着型硫酸盐还原菌定量检测方法及所用生物膜取样装 置。
本发明解决技术问题所采用的技术方案是附着型硫酸盐还原菌定量检测 方法是按照以下步骤实现的步骤一、用生物膜取样装置取下罐体或管体内壁 上附着的含有硫酸盐还原菌的生物膜先在罐体或管体的侧壁上打通 L，再将 生物膜取样装置安装在所述通孔处，并使生物膜取样装置上的探头与罐体或管 体的内侧壁平齐，并保持在线安装10-20天，待硫酸盐还原菌在所述探头上充 分成膜后即可取下生物膜；步骤二、硫酸盐还原菌的菌体制备将所述探头上 的生物膜剥离至配制的溶液中制成菌体；步骤三、将步骤二中制备好的菌体进 行倍比稀释；步骤四、进行冰上的PCR操作；步骤五、PCR在扩增仪上的扩增； 步骤六、扩增产物于质量浓度为1.0%的琼脂糖电泳检测；步骤七、结果观察， 查表记数。
前面所述方法的实现必须借助生物膜取样装置才能实现，该取样装置包括 主体、探头压紧总成、固定件和控制阀，所述取样装置还包括探头，所述探头 的上端设有台肩，压紧总成位于主体的上端，探头依次穿过探头压紧总成、主 体，探头通过固定件固装在主体的上端面上，探头上端的台肩搭接在探头压紧 总成的上端面上，探头压紧总成安装在主体上设有定位台肩上，控制阀安装在 主体的下端侧壁上。
本发明具有以下有益效果本发明实现了附着型硫酸盐还原菌的快速、较准确的定量检测。本发明的方法记数更加准确，可以精确到一个菌体，有效地 縮短了计数时间，整个发明从做样到出结果只需要四个小时，远远小于十四天
的记数时间，真实的表证了水样的实际的SRB菌的数量，准确的反应了当时生 产实际情况、可以直接有效的指导生产，同时还降低了检测费用。运用本发 明装置可有效取得罐壁和管壁的附着生物膜，本发明装置还具有结构简单的优 点。本发明适于油田水系统中常规污水、含聚污水、地面工艺的水处理过程中 管壁、罐壁等附着型硫酸盐还原菌(SRB)的快速定量检测，也可以用于各种 生物膜、结构物中等含有附着型硫酸盐还原菌的环境样本的检测。
图1为本发明所述生物膜取样装置的结构示意图，图2是本发明所述生物 膜取样装置的探头从管道取出后的结构示意图，图3是探头的结构示意图，图 4是本发明的具体实施例的现场工艺流程框图。
具体实施例方式
具体实施方式
一本实施方式所述的附着型硫酸盐还原菌定量检测方法是 按照以下步骤实现的步骤一、用生物膜取样装置取下罐体或管体内壁上附着 的含有硫酸盐还原菌的生物膜先在罐体或管体的侧壁上打通孔，再将生物膜 取样装置安装在所述通孔处，并使生物膜取样装置上的探头与罐体或管体的内 侧壁平齐，并保持在线安装10-20天，待硫酸盐还原菌在所述探头上充分成膜 后即可取下生物膜；步骤二、硫酸盐还原菌的菌体制备将所述探头上的生物 膜剥离至配制的溶液中制成菌体；步骤三、将步骤二中制备好的菌体进行倍比 稀释；步骤四、进行冰上的PCR操作；步骤五、PCR在扩增仪上的扩增；步骤 六、扩增产物于质量浓度为1.0%的琼脂糖电泳检测；步骤七、结果观察，查 表记数。本实施方式所述的步骤二至步骤七为现有技术，授权公告号为CN 100372943C、授权公告日为2008年3月5日的发明专利提出了一种"硫酸盐 还原菌直接倍比稀释PCR快速定量检测方法"，在该专利中对步骤二至步骤七 的内容均有披露。
具体实施方式
二本实施方式所述的附着型硫酸盐还原菌定量检测方法是
按照以下步骤实现的
步骤一、用生物膜取样装置取下罐体或管体内壁上附着的含有硫酸盐还原菌的生物膜先在罐体或管体的侧壁上打通孔，再将生物膜取样装置安装在所 述通孔处使生物膜取样装置上的探头与罐体或管体的内侧壁平齐，并保持在线 安装10-20天，待硫酸盐还原菌在所述探头上充分成膜后即可取下生物膜；
步骤二、硫酸盐还原菌的菌体制备将所述探头上的生物膜剥离至配制的 溶液中制成菌体；具体包括以下步骤a、将取下的生物膜放入装有lmL去离 子水且经灭菌的1.5mL的离心管中；b、将离心管在震荡器上充分震荡5min， 13000r/min离心lmin，从管中轻轻的弃上清液0. 9mL; c、在剩余的0. lmL中 加入"菌体前处理缓冲液"(DNA前处理缓冲液)0.9mL，在震荡器上充分震荡 5min; d、 13000r/min离心2min，弃上清液0. 98mL (剩余20 u 1)，充分震荡 2 min，制备完毕短时间内(0 1天)在4'C条件下保存即可，长时间(大于 1天)不用在-2(TC条件下保存；所述"菌体前处理缓冲液"的母液成分为 70gNaCi、 2gKci、 12g Na2HP04、 2g KH2P0" 1%。 SDS;将母液稀释10倍成为 菌体前处理缓冲液；控制工作液的pH为7.5，在12rC条件下灭菌15 30min 后即可。
步骤三、将步骤二中制备好的菌体进行倍比稀释吸取2ul步骤二中得 到的菌体加入用于倍比稀释的管中，加入18ul的去离子水，然后在从中取2 P1进行下一步的稀释，依次从上管中取样1加入下一个用于倍比稀释的 管中，加入18 y 1的去离子水，直到选择稀释的倍数(或最终水样被稀释十倍)；
步骤四、进行冰上的PCR操作所述进行冰上的PCR操作过程中的PCR 反应体系为20lil:包括Buffer (10X) 2ul、 0. 3咖o1 L-1的dNTP 2 u 1、 浓度为0. 1 " mol L/1的正向弓l物SRBF 1 u 1、浓度为0.1 u mol U1的反向引 物SRBR lul， rTaq酶0.3U，其余加去离子水11. 7 y 1 ，然后加2ul的样品 (步骤二中得到的菌体)；所述正向引物SRBF的硫酸盐还原菌特意性探针的碱 基组成为5， -CCTGACGCAGCGACGCCG-3，，共18bp;反向引物SRBR的硫酸盐 还原菌特意性探针的碱基组成为5， -CTACCAGGGTATCTAATCC-3，，共19bp;
步骤五、PCR在扩增仪上的扩增扩增程序为94。C预热5min， 94。C变性 30s， 58.8。C复性45s， 72。C延伸90s，循环30次，最后72。C延伸10min，整 个扩增程序需要2个小时16分钟；
步骤六、扩增产物于质量浓度为1.0%的琼脂糖电泳检测，需要一个小时;
步骤七、结果观察，查表记数。
具体实施方式
三本实施方式在步骤一中所述生物膜取样装置保持在线安 装在罐体或管体的侧壁上15天。其它步骤与具体实施方式
一或二相同。
具体实施方式
四本实施方式在进行冰上的PCR操作过程中采用三管或五
管平行法，每个梯度3个或5个样。本发明的方法试验结果表明，三管平行法
记录的结果无论在水样低浓度或高浓度的情况下，数量级上与五管平行法无差
别。重要在于五管平行法记录的结果更加准确，置信度大于99%。五管平行法 SRB-MPN-PCR法记数的结果与用硫酸盐还原菌细菌检测试剂瓶(北京华兴化学 试剂厂)14天的记数结果相比数量级上平均大102，更能反应水样中实际的SRB 菌的数量。其它步骤与具体实施方式
一、二或三相同。授权公告号为CN 100348731C、授权公告日为2007年11月4日的发明专利提出了一种"油田水 质硫酸盐还原菌的定量检测方法"；授权公告号为CN 100372943C、授权公告 日为2008年3月5日的发明专利提出了一种"硫酸盐^S原菌直接倍比稀释PCR 快速定量检测方法"；上述两件专利均披露了三管或五管平行法的技术方案。
具体实施方式
五如图1 3所示，本实施方式的生物膜取样装置包括主 体4、探头压紧总成5、固定件2和控制阀3 (带螺旋扣的水闸)，所述取样装 置还包括探头1，所述探头1的上端设有台肩1-1，压紧总成5位于主体4的 上端，探头1依次穿过探头压紧总成5、主体4，探头1通过固定件2固装在 主体4的上端面上，探头1上端的台肩1-1搭接在探头压紧总成5的上端面上， 探头压紧总成5安装在主体4上设有定位台肩4-1上，控制阀3安装在主体4 的下端侧壁上。探头压紧总成5的作用是防止探头1被罐体或管体6内的液体 的压力将探头l顶出。在使用时，先在罐体或管体6的侧壁上打通孔，再将生 物膜取样装置安装在所述通孔处使生物膜取样装置上的探头与罐体或管体的 内侧壁平齐，并保持在线安装10-20天，待硫酸盐还原菌在所述探头上充分成 膜后即可取下生物膜。把探头上的菌膜剥离至配制的溶液中，震荡后保存。生 物膜取样装置是附着型硫酸盐还原菌快速定量检测得以实现关键所在，它解决 了附着型硫酸盐还原菌无法取样的难题，是后续检测的前提条件。
具体实施例
试验以采油三厂北三三脱水站地面处理系统为测试点，开展了管壁和罐壁 附着型SRB含量测定研究。现场将测试组件(包括生物膜取样装置)分别安装在北三三脱水站沉降罐出口和入口、北三一三沉出口和入口、北三一外输水汇
管出口和入口上，现场工艺流程参见图4，测试结果见表l。采用改良后的SRB 培养基进行记数。
根据生长结果计算菌膜中的SRB含量，现场附着型SRB含量测定结果， 由表1可见，管壁上有大量的SRB菌附着生长，在一定程度上表明，同一管道 中管壁SRB菌的数量相对大于污水中的数量，通过安装在管壁上的检测装置与 绝迹稀释法(MPN)联用，实现了管壁和罐壁上的附着型SRB菌的定量检测，该 技术在生产中已经得到应用。同行也是目前细菌记数中只监测污水中、流动相 中的附着型SRB，并没有监测附着型SRB，现场附着SRB含量测定结果显示， 系统的管壁上有大量的SRB附着生长，这一研究结果也证实了室内SRB菌群种 类及生长特性研究的结论，即油田地面系统中存在附着生长的SRB和非附着生 长的SRB。对于指定硫酸盐还原菌的系统控制方法，具有非常重要的意义，改 变了以往的"杀菌方案"治标不治本的问题。
_表l采油三厂附着型SRB含量测试结果_
测试部位 管壁 污水 测试部位 管壁 污水
_(个/cm2)(个/mL)_(个/cm2)(个/niL)
脱水站罐入口 1.0X 1061.5X 103脱水站罐出口2.5X106 2.0X103
沉降罐入口 4. 8X106 4. 5X 103 沉降罐出口 6.0X106 7.5X103 外输水汇管入口 1.0X 106 1.25X 103外输水汇管出口1.3X106 1.5X10权利要求
1、一种附着型硫酸盐还原菌定量检测方法，其特征在于它是按照以下步骤实现的步骤一、用生物膜取样装置取下罐体或管体内壁上附着的含有硫酸盐还原菌的生物膜先在罐体或管体的侧壁上打通孔，再将生物膜取样装置安装在所述通孔处，并使生物膜取样装置上的探头与罐体或管体的内侧壁平齐，并保持在线安装10-20天，待硫酸盐还原菌在所述探头上充分成膜后即可取下生物膜；步骤二、硫酸盐还原菌的菌体制备将所述探头上的生物膜剥离至配制的溶液中制成菌体；步骤三、将步骤二中制备好的菌体进行倍比稀释；步骤四、进行冰上的PCR操作；步骤五、PCR在扩增仪上的扩增；步骤六、扩增产物于质量浓度为1.0％的琼脂糖电泳检测；步骤七、结果观察，查表记数。
2、 根据权利要求1所述的附着型硫酸盐还原菌定量检测方法，其特征在 于在步骤一中所述生物膜取样装置保持在线安装在罐体或管体的侧壁上15天。
3、 实现权利要求1所述方法中的生物膜取样装置，其特征在于所述取样 装置包括主体(4)、探头压紧总成(5)、固定件(2)和控制阀(3)，其特征 在于所述取样装置还包括探头(1)，所述探头(1)的上端设有台肩(1-1)， 压紧总成(5)位于主体(4)的上端，探头(1)依次穿过探头压紧总成(5)、 主体(4)，探头(1)通过固定件(2)固装在主体(4)的上端面上，探头(1) 上端的台肩(1-1)搭接在探头压紧总成(5)的上端面上，探头压紧总成(5) 安装在主体(4)上设有定位台肩(4-1)上，控制阀(3)安装在主体(4)的 下端侧壁上。
全文摘要
附着型硫酸盐还原菌定量检测方法及所用生物膜取样装置，它涉及一种硫酸盐还原菌的定量检测方法及该方法中专用的生物膜取样装置。本发明解决了现有的检测方法无法实现附着型硫酸盐还原菌的快速、较准确的定量检测问题。本方法主要步骤为用生物膜取样装置取下生物膜、菌体制备、倍比稀释、PCR操作、扩增、电泳检测、查表记数。所述探头(1)依次穿过探头压紧总成(5)、主体(4)，探头(1)通过固定件(2)固装在主体(4)的上端面上，探头(1)上端的台肩(1-1)搭接在探头压紧总成(5)的上端面上，控制阀(3)安装在主体(4)的下端侧壁上。本发明方法记数更加准确、缩短计数时间，运用本发明装置可有效取得罐壁和管壁的附着生物膜。
文档编号C12Q1/06GK101302557SQ20081006490
公开日2008年11月12日 申请日期2008年7月11日 优先权日2008年7月11日
发明者宁 侯, 李大鹏, 杨基先, 珊 邱, 放 马, 利 魏 申请人:哈尔滨工业大学