专利名称：一种重组减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生物疫苗的开发，尤其涉及一种重组减毒鼠伤寒沙门氏菌 载体疫苗及制备方法。
背景技术：
肠出血性大肠杆菌(EHEC) 0157:H7是肠出血性大肠杆菌的一个主要血清 型，感染该菌可使人患腹泻、出血性结肠炎、也可引发溶血性尿毒综合征及血 小板减少性紫癜等并发症，严重者可导致死亡。自1982年被确定为致病菌的20 多年间，世界各地已发生了多起0157的暴发流行，表明0157: H7的感染已成为 一个全球性的公共卫生问题。然而目前缺乏有效的防治方法，研究证实抗生素 可促使0157菌释放致死性志贺毒素(Stx)，从而使患者并发溶血性尿毒综合症的 危险性增加，因此，研制0157疫苗对预防和控制0157感染有着极其重大的意义。EHEC 0157:H7的致病性主要体现于细菌在宿主体内的粘附定植和产生毒 素两个方面。粘附与定植是细菌感染的第一步。紧密粘附素(Intimin)是一种分子 量约为96KD的跨膜蛋白，也是0157菌重要而特异的粘附分子。细菌主要通过 Intimin及其受体(转位紧密粘附素受体，Tir)的相互作用粘附于肠上皮细胞，引起 擦拭性(A/E : attaching/effacing)损伤。Intimin的膜外区(C端片段IntiminC)是与 Tir受体结合的功能区。有实验指出Intimin及IntiminC的特异性抗体均可以阻断细 菌的粘附进而使其丧失致病力，具有较强的免疫保护性 (Aleksic.S,H.Karch，J.BockemuhI，et al.A biotyping scheme for Shia-like(Vero) toxin-producing Escherichia coli 0157 and a list of serological cross-reactions between 0157 and other Gramnegative bacteria.Int.J.Med.Microbiol.1992: 276: 221-230)。而引起和介导O157细菌粘附定植的主要结构单元EHEC III型分泌系统 (type-Ill secretion system,TTSS)的分泌蛋白EspA(Esp为E. coli secreted protein缩写)可以在细菌表面形成管状结构，是多种效应蛋白及Tir进入宿主细胞的通道， 同时也参与A/E损伤形成时信号的传递。有研究表明EspA具有良好的免疫原性和 免疫保护性。此外，EHEC 0157:H7主要产生两种毒素，分别称为志贺毒素I(Stxl) 和志贺毒素11(Stx2) ( Paola Marcato ， George Mulvey ， Randy J.Read ， et al.Imm皿oprophylactic Potential of Cloned Shiga Toxin 2B Subunit.J Infect Dis.2001; 183: 435-443)。在细菌体内，Stx2为分泌型表达，Stxl为胞内表达。 两种毒素均由1个A亚单位和5个B亚单位组成，A亚单位具有细胞内毒性，能与 28S rRNA作用导致蛋白质合成停止，是大肠杆菌0157:H7引起临床表现的病理 基础；B亚单位具有细胞结合特性，能与特定受体(Gb3)的细胞结合，从而引导A 亚单位发挥作用。志贺毒素(Stx)—方面直接杀死肠绒毛表面的上皮细胞，另一 方面由Stx引起的肠上皮损伤以LPS、炎性因子能促进Stx穿越肠上皮细胞进入血 液循环造成肠道、中枢神经系统及Gb3受体含量较高的器官的损伤。多数 0157:H7细菌产生Stx2，其毒性强于Stxl，与溶血性尿毒综合征(HUS)及血栓形 成性血小板减少性紫癜(TTP;i等严重并发症的相关性更为密切，因此Stx2是该菌 致病性的重要物质基础。Paola Marcato等克隆表达了志贺样毒素II结合亚单位 (Stx2B)并探索了其免疫保护性，发现Stx2B无毒，且具有良好的免疫保护性，针 对Stx2B的单克隆抗体具有阻断毒素的作用(Paola Marcato， George Mulvey， Randy J.Read， et al.Immunoprophy lactic Potential of Cloned Shiga Toxin 2B Subunit.J Infect Dis.2001; 183: 435-443)。减毒鼠伤寒沙门氏菌能通过粘附、侵袭、定居在肠道相关淋巴组织，并经 肠系膜淋巴结到达肝脏、脾脏，进一步有效地刺激机体产生粘膜、细胞和体液 免疫应答，是携带抗原的良好载体和天然粘膜免疫佐剂，已成为疫苗接种的新 途径。根据共同粘膜免疫理论，以减毒伤寒沙门氏菌为载体制成的口服疫苗可 在口腔、乳腺、生殖道、泪腺等粘膜部位诱发较强的粘膜免疫，且口服接种的 方式安全，可以避免因注射免疫而造成艾滋病毒及肝炎病毒等的感染。特别是 近来利用不以抗生素作为选择压力的载体-宿主平衡致死系统构建的减毒鼠伤寒 沙门氏菌载体疫苗已显示出良好的应用前景。发明内容本发明针对现有0157:H7基因工程疫苗存在保护效果不佳等不足之处，旨 在通过构建以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体的肠出血性大肠杆菌0157:H7疫苗和 口服与皮下或肌肉注射蛋白相结合的联合免疫策略提供了一种新型的0157:H7 疫苗，本发明的提供的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗，其包含抗原亚单位 EspA、 IntiminC300禾卩Stx2B,其中，上述的抗原亚单位EspA、 IntiminC300和 Stx2B来源于肠出血性大肠杆菌0157: H7。本发明的另外一个目的是提供上述重组减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗的制 备方法，其主要包括以下步骤1) 通过 PCR 方法获得融合基因 EspA-IntiminC300 、 EspA-IntiminC300-Stx2B;2) 融合基因分别与表达载体连接，得到重组表达质粒；3) 重组表达质粒转化第一中间宿主菌株，获得重组子；4) 重组子转化第二中间宿主菌株，鉴定阳性重组子；5) 步骤4)中鉴定正确的阳性重组子转化终宿主菌株；6) 诱导表达，得到重组减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗；7) 鉴定步骤6)中得到的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗中EspA、 IntiminC300、 Stx2B的表达；8) 检测步骤6)中得到的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗中EspA、 IntiminC300、 Stx2B的免疫原性；9) 重组减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗攻毒保护实验；10) 在有、无选择压力的情况下进行体外传代培养，鉴定重组减毒鼠伤寒 沙门氏菌载体疫苗稳定性。其中步骤1)中通过PCR方法获得EspA-IntiminC300时使用的PCR引物如 SEQ ID NO: 1-2所示，通过PCR方法获得EspA-IntiminC300-Stx2B时使用的PCR 引物如SEQIDNO:3-4所示；步骤2)中所述的表达载体优选为pYA3149;步骤 3)中所述的第一中间宿主菌株优选为大肠杆菌X6097;步骤4)中所述的第二 中间宿主菌株优选为减毒鼠伤寒沙门氏菌X3730;步骤5)中所述的终宿主菌株优选为减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550,其中所述的减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550优 选为asd基因缺陷型菌株；步骤8)中可以通过Western免疫印迹检测EspA、 IntiminC300、 Stx2B的免疫原性。本发明的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗可以用于免疫肠出血性大肠杆 菌，其可通过口服免疫或加强免疫，口服免疫具体可为约4xl08CFU/只/次， 每次间隔1 2周；加强免疫具体可为口服免疫2~4次后间隔一定时间通过皮 下或肌肉注射蛋白的方式加强免疫一次，这里所述的一定时间视生物体的情况 而定，可以为一周或一个月等。本发明采用平衡一致死系统构建了表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)0157:H7 EspA、 IntiminC300、 Stx2B融合蛋白的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗株， 并且构建的疫苗株无论有无选择压力均能稳定地在体外传代培养，通过口服疫 苗菌株和皮下或肌肉注射重组蛋白相结合的免疫方案免疫小鼠后证明该疫苗具 有良好的免疫原性和免疫保护效果。本发明的优点主要在于1)成功构建了重 组减毒鼠伤寒沙门氏菌载体，并且有效表达了肠出血性大肠杆菌(EHEC) 0157:H7 EspA、 IntiminC300、 Stx2B融合蛋白；2)利用鼠伤寒沙门氏菌同肠 出血性大肠杆菌一样都是肠道菌，容易粘附、定植到粘膜系统的特性有效地激 发粘膜免疫；3) 口服载体疫苗菌株与皮下或肌肉注射蛋白相结合的联合免疫策 略大大提高了对于高危人群(老人、小孩)、高发流行地区或季节的免疫效果， 有效预防和控制肠出血性大肠杆菌(EHEC) 0157:H7感染，降低感染率；4) 这种免疫策略对其他疫苗也有借鉴意义。本发明的口服载体疫苗菌株与皮下或肌肉注射蛋白相结合的联合免疫策略 大大提高了对于高危人群(老人、小孩)、高发流行地区或季节的免疫效果，有 效预防和控制肠出血性大肠杆菌(EHEC) 0157:H7感染，降低感染率。为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳 实施例，并配合附图，作详细说明如下。
图1:重组质粒pYA3149- EspA-IntiminC300构建策略图；图2: EspA-IntiminC300 PCR结果，其中泳道1为核酸(DNA)分子量标准 (Marker)，泳道2 EspA-IntiminC300 PCR结果(约1476bp);图3:重组质粒pMDl8-T-EspA-IntiminC300的酶切鉴定图，泳道1为核酸(DNA)分子量标准(Marker),泳道2为pMD18-T-EspA-IntiminC300 EcoRI和HindIII双酶切结果； 图4:重组质粒pYA3149-EspA-IntiminC300/x6097的酶切鉴定， 泳道1为核酸(DNA)分子量标准(Marker),泳道2为pYA3149-EspA-IntiminC300/x6097 EcoRI和HindIII双酶切结果；图 5 : PCR 鉴定 pYA3149-EspA-IntiminC300/X3730 及 pYA3149-EspA-IntiminC300/X4550结果，泳道1为核酸(DNA)分子量标准(Marker),泳道 2 、 3 分另U 为 pYA3149-EspA-IntiminC300/X3730 及 pYA3149-EspA-IntiminC300/X4550 PCR结果；图6:重组质粒pYA3149- EspA-IntiminC300-Stx2B构建策略图；图7: EspA-IntiminC300-Stx2B的PCR结果，泳道1为EspA-IntiminC300-Stx2B PCR结果，泳道2为核酸(DNA)分子量标准(Marker);图8 :重组质粒pYA3149—EspA-IntiminC300-Stx2B/X6097的酶切鉴定结果，泳道1、 3分别为重组质粒pYA3149 —EspA-IntiminC300-Stx2B /X6097 EcoRI和HindIII双酶切结果，泳道2为核酸(DNA)分子量标准(Marker);图 9 : PCR 鉴定 pYA3149-EspA-IntiminC300陽Stx2B/X3730 及 pYA3149-EspA-IntiminC300-Stx2B/X4550结果，泳道1为核酸(DNA)分子量标准(Marker),泳道 2 、 3 分另lj为 pYA3149-EspA-IntiminC300-Stx2B/X3730 及 pYA3149-EspA-IntiminC300-Stx2B/X4550 PCR结果；图 10 : 重组蛋白pYA3149-EspA-IntiminC300/x4550 、 pYA3149-EspA-IntiminC300-Stx2B/x4550的表达，泳道l， 2， 3， 4分别表示IPTG诱导48、 24、 12、 6小时的重组菌株，泳道5为诱导前的重组菌株，泳道6为IPTG诱导4小时的pYA3149/X4550，泳道7为蛋白分子量标准；图ll: west-blotting鉴定EspA-IntiminC300、 EspA-IntiminC300-Stx2B的免疫反应性，泳道l、 4、 7 分别为EspA、 IntiminC300和Stx2B的正对照，泳道2、 5、 8 分别为同EspA的单克隆抗体反应的EspA蛋白、同 IntiminC300多克隆抗体反应的IntiminC300蛋白和同Stx2B多克隆抗体反应的 Stx2B蛋白，泳道3、 6、 9为负对照；图12A-12F:小鼠脾脏、肠系膜淋巴结、回肠末端免疫荧光检测结果，其中12A为小鼠脾脏阴性对照(x400)， 12B为免疫后小鼠脾脏免疫荧光检测 (x400)， 12C为小鼠肠系膜淋巴结阴性对照(x400)， 12D为免疫后小鼠肠系膜淋巴 结免疫荧光检测(x400)， 12E为小鼠回肠末端阴性对照(x400)， 12F为免疫后小鼠 回肠末端免疫荧光检测0400)。
具体实施方式
本发明利用pYA3149的载体-宿主平衡致死系统表达EHEC0157:H7的EspA 及lntiminC300、 Stx2B的融合保护性抗原，构建以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体的 肠出血性大肠杆菌(EHEC) 0157:H7疫苗，并通过动物实验观察重组载体疫苗 的免疫原性及免疫保护性，为发展新型的0157疫苗提供实验依据。本发明首先釆用基因工程技术克隆了 EspA-IntiminC300和EspA-IntiminC300- Stx2B基因，并利用表达载体pYA3149成功地在终宿主菌-减毒鼠 伤寒沙门氏菌X4550中进行了表达。本发明所用的减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550 具有如下特征其为asd基因缺陷型细菌，由于asd基因是DAP(二氨基庚二酸， 革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分)生物合成途径中必需的酶，该基因的缺失可导 致该突变株在无外源性DAP存在的条件下溶菌死亡，从而高效减毒。减毒鼠伤 寒沙门氏菌能表达外源抗原,在哺乳动物中经口、鼻、直肠等粘膜途径免疫能诱 导强大而特异的免疫反应。能够定居在宿主小肠和肠相关淋巴组织，不致病并且 能稳定表达外源基因。所表达的靶抗原不需纯化，可直接用于免疫保护试验， 免去了蛋白质后处理的复杂工序。在融合蛋白的构建中，以本申请人的专利申请，
发明者抒 余, 刘艳青, 宁元元, 张卫军, 勇 易, 毛旭虎, 王庆旭, 程建平, 童文德, 肖大平, 邹全明, 颖 马 申请人:中国人民解放军第三军医大学