专利名称：蜕皮甾酮作为诱导哺乳动物神经干细胞向神经元分化的诱导剂的新应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及化合物的治疗活性领域，具体涉及蜕皮甾酮作为诱导哺乳动 物神经干细胞向神经元分化的诱导剂的新应用。
背景技术：
神经干细胞(neural stem cells, NSCs)存在于胚胎和成年哺乳动物的中 枢神经系统，具有自我更新和多向分化潜能，能分化为各种神经细胞，如神经 元、少突胶质细胞以及星形胶质细胞等，为中枢神经系统损伤、神经系统变性 病或遗传性代谢疾病、神经退行性疾病等提供了新的治疗策略。中枢神经系统 损伤后，大部分NSCs分化为胶质细胞，在损伤部位形成胶质瘢痕，阻碍了轴突 生长，使损伤不能修复。因此，提高NSCs向神经元的分化比例成为神经科学研 究的热点。目前，国内外通用的体外诱导NSCs增殖分化的方法是给予丝裂原，如碱性 成纤维细月包生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF )及表皮生长 因子(epidermal growth factor, EGF)等，干预维持培养的神经干细胞，j吏 其处于增殖状态，除去丝裂原并添加含胎牛血清的培养基后，诱导NSCs进行分 化，但这种方法所得到的分化细胞主要是胶质细胞，神经元比例较低。蜕皮甾酮(Ecdysterone， EDS)是活血化瘀中药牛膝、漏,、露水草等的 有效单体成分，在动植物界均有分布。研究发现，EDS生物学功能广泛，具有促 进蛋白核酸的合成、调节免疫应答、影响神经递质代谢等多种作用；并能促进 血管内皮细胞的增殖，对多种因素如缺血缺氧、内毒素、肿瘤坏死因子等造成 的内皮细胞损伤具有保护作用；整体动物给药后，蜕皮甾酮对外伤或缺血引起 的脑损伤也有一定的保护作用，能促进大鼠海马学习记忆障碍的改善。研究还指出，作为内源性甾体激素，EDS在昆虫类生物大脑神经发育中起重要的调控作 用，在不同的分泌浓度下，它能诱导昆虫类神经前体细胞的增殖、分化甚至凋 亡。但迄今为止，EDS对哺乳动物NSCs的增殖与分化是否也有调控作用尚未见 报道。发明内容有鉴于此，本发明的目的之一在于提供EDS作为诱导哺乳动物NSCs向神经 元分化的诱导剂的新应用，从而为NSCs移植治疗神经系统疾病和损伤修复研究 提供新的思路和方法。本发明的目的之二在于提供一种诱导哺乳动物NSCs向神经元分化的细胞培 养基，含有诱导剂EDS。进一步，所述细胞培养基中含有浓度为100-400 mg/L的诱导剂EDS;进一步，所述细胞培养基中含有浓度为200 mg/L的诱导剂EDS;进一步，所述细胞培养基中还含有胎牛血清；进一步，所述细胞培养基中还含有体积百分浓度为5-20%的胎牛血清； 进一步，所述细胞培养基中还含有体积百分浓度为10%的胎牛血清。 本发明的目的之三在于提供一种诱导哺乳动物NSCs向神经元分化的细胞培 养基的制备方法，包括以下步骤a. DMEM/F12基础培养液的制备取制备DMEM/F12基础培养液1L用量的 DMEM/F12 (1:1)干粉1袋、谷氨酰胺2. 5 g，用浓度为0. 1 mol/L、 pH值为 7. 35的磷酸盐緩冲液即PBS溶解并稀释至1L,调节pH值为7. 5，用0. 2 pin微 孔滤膜过滤除菌，即得；b. 细胞培养基的制备按照制备100 ml细胞培养基计，取诱导剂蜕皮甾 酮10-40 mg，加入步骤a制得的DMEM/F12基础培养液70 ml使溶解，用0, 2 微孔滤膜过滤除菌后，加入胎牛血清5-20ml、青霉素与链霉素的混合液(由浓 度为4万U/ml的青霉素溶液、浓度为4万U/ml的链霉素溶液按1: 1混合而成) 1 ml，最后用DMEM/F12基础培养液定容至100 ml，即得。进一步，所述步骤b中诱导剂蜕皮甾酮的用量为20 mg; 进一步，所述步骤b中诱导剂蜕皮甾酮的用量为20mg,胎牛血清的加入量 为10 ml。本发明的有益效果在于在哺乳动物NSCs分化培养基中加入诱导剂EDS， NSCs向神经元分化的比例明显提高，特别是当EDS浓度为200 mg/L时，免疫荧 光染色后激光共聚焦显微镜检测显示NSCs分化为神经元的比例为22. 6±4. 7 %,而对照组II为12.4±3. 3%, 二者相比有显著性差异(P<0. 05);同时， 流式细胞仪3次;险测NSCs向神经元分化比例，分别为24. 6%、 18. 5%、 21. 9%, 均值为21.7%，而对照组II分别为10. 4°/。、 9.5%、 11.9%,均值为IO. 6%, 二者有 统计学差异(户〈0. 05),与免疫荧光染色鉴定结果一致；以上实验结果证实EDS 具有促进NSCs向神经元分化的作用，含有EDS的细胞培养基可诱导哺乳动物 NSCs向神经元分化，具有良好的应用价值。本发明的其他优点、目标，和特征在某种程度上将在随后的说明书中进 行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言 将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其 他优点可以通过下面的说明书和权利要求书来实现和获得。
图1为克隆球Nestin免疫荧光染色鉴定图； 图2为对照组II分化细胞免疫荧光染色鉴定图；图3为浓度为200 mg/L的EDS诱导NSCs向神经元分化的免疫荧光染色鉴 定图。
具体实施方式
下面将参照附图，通过实验例来进一步阐述EDS作为诱导哺乳动物NSCs 向神经元分化的诱导剂的新应用的有益效果。一、材料与试剂1、 实验动物新生48小时内的SD乳大鼠5只，由中国人民解》文军第三军医大学实验动 物中心提供。2、 实验试剂细胞培养基DMEM/F12 (1: 1 )， B27添加剂为Gibco公司产品，胎牛血清购 自杭州四季青生物工程材料有限公司，bFGF及EGF为Sigma公司产品；EDS购 自中国科学院昆明植物研究所； 一抗小鼠抗大鼠巢蛋白(Nestin)单克隆抗 体、小鼠抗大鼠胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)多克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司，兔抗大鼠m型p-微管蛋白(Class III p-Tubulin, Tujl)单克隆抗体购自碧云天生物:技术研究所；二抗 异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate， FITC )标记的羊抗小鼠IgG、 Cy3标记的羊抗小鼠IgG、 Cy3标记的羊抗兔IgG购自碧云天生物技术研究所； 4'， 6-二脒基-2-苯p引-朵(4'， 6-diamidino —2-phenyl indole, DAPI )购自碧云 天生物技术研究所。3、 细胞培养基DMEM/F12基础培养液取制备DMEM/F12基础培养液1L用量的DMEM/F12 (1:1)干粉l袋、谷氨酰胺2. 5 g,用浓度为0. 1 mol/L、 pH值为7. 35的璘 酸盐緩冲液(PBS)溶解并稀释至1L，调节pH值为7. 5,用0. 2 )im微孔滤膜过 滤除菌，即得。DMEM/F12无血清培养基在DMEM/F12基础培养液中加入B27、 bFGF、 EGF 至B27最终体积百分浓度为2y。、bFGF终浓度为20 ng/ml 、EGF终浓度为20ng/ml, 即得。EDS诱导培养基分别取EDS 5、 10、 20、 40、 80 mg,加入DMEM/F12基础 培养液70 ml使溶解，用0.2 iom微孔滤膜过滤除菌后，加入胎牛血清10 ml、 青霉素与链霉素的混合液(由浓度为4万U/ml的青霉素溶液、浓度为4万U/ml的链霉素溶液按l: 1混合而成)l ml，最后用DMEM/F12基础培养液定容至100 ml ， 即得含有浓度分别为50、 100、 200、 400、 800 mg/L的EDS、体积百分浓度为 10 %的胎牛血清的EDS诱导培养基。二、实验方法与结果1、 NSCs的分离、培养与鉴定方法将新生48小时内的SD乳大鼠用体积百分浓度为75%的乙醇溶液消毒， 脱颈推处死后，无菌条件下打开颅腔，于解剖显微镜下剥离脑膜分离出海马， 置D-Hank's溶液中剪切成大小约为0.5 mm'的细小组织块，滴管反复吹打，再 经200目铜网过滤后离心，细胞沉淀重悬于DMEM/F12无血清培养基，台盼蓝染 色后进行活细胞计数；按细胞密度为1 x 10'细胞/ml将细胞接种于75 ml培养瓶中，置温度37°C, 体积浓度为5%的C02培养箱中悬浮培养，当原代克隆球形成后用机械分离法制作 单细胞悬液，再按细胞密度为5 x lV细胞/ml进行传代培养，每隔3天半量更换 培养液1次，每隔7-8天机械分离克隆球并传代培养1次；将经过传代所形成的NSCs克隆球接种于预先涂布有多聚赖氨酸的载玻片 上，继续培养4小时使其贴壁后进行Nestin免疫荧光染色，观察NSCs特异性 抗原Nestin的表达情况。免疫荧光染色方法为取上述贴壁克隆球，用质量百 分浓度为4%的多聚曱醛溶液固定30分钟，用浓度为0. lmol/L的PBS洗涤3次， 加入一抗小鼠抗大鼠Nestin单克隆抗体(稀释度为1 : 100)，于室温下孵育 6小时，PBS洗涤3次，加入二抗Cy3标记的羊抗小鼠IgG(稀释度为1:150)， 于室温下孵育50分钟，PBS洗涤3次，甘油緩冲液(由甘油9份和浓度为0. 1 mol/L的PBS l份组成)封片，激光共聚焦显微镜进行检查。结果原代细胞取材之后，培养24小时可见克隆开始形成，3-4天克隆形 态已较为丰满规则，7-8天克隆球已需要传代。克隆球Nestin免疫荧光染色鉴 定结果见图1，其中A为原代克隆球，xl00; B为传代克隆球Nestin免疫荧光 染色，xl00;从图可见传代克隆球呈Nestin抗原强阳性。2、 EDS作为诱导剂诱导NSCs向神经元分化的能力方法取传代培养的NSCs克隆，用EDS浓度分别为50、 100、 200、 400、 800 mg/L的EDS诱导培养基，按细胞密度为5 x 1()S细胞/ml接种于预先置有多 聚赖氨酸涂层盖玻片的12孔板内，作为5个实验组，同时设对照组I (按照EDS 诱导培养基配制方法制备培养基，但不加入EDS)及对照组II (用体积百分浓度 为10。/。的胎牛血清溶液代替EDS诱导培养基)，每组设3个复孔，置温度37匸， 体积浓度为5%的C02培养箱中培养，于培养10天后釆用免疫荧光染色和流式细 胞术检测各组NSCs分化为神经元的比例。免疫荧光染色方法为前述常规方法，不同之处在于以兔抗大鼠Tujl单克 隆抗体(稀释度为1 : 200 )为一抗标记神经元，对应二抗为Cy3标记的羊抗兔 IgG (稀释度为1 : 200 );以小鼠抗大鼠GFAP多克隆抗体(稀释度为1 : 100) 为一抗标记星形胶质细胞，对应二抗为FITC标记的羊抗小鼠IgG (稀释度为1 :150);用DAPI标记细胞核；采用激光共聚焦显微镜进行检测，每组随机计数 5个视野下Tuj 1阳性和GFAP阳性细胞数，并计算其占总细胞数的比例。流式细胞术检测方法为每组收集5xl(T个细胞，用质量百分浓度为4%的 多聚曱醛溶液固定30分钟后，加入一抗兔抗大鼠Tujl单克隆抗体(稀释度 为1 : 150),于室温下孵育1小时，用浓度为0. 1 mol/L的PBS洗涤3次，加入 二抗FITC标记的羊抗兔IgG (稀释度为1 : 100)，于室温下孵育45分钟，PBS 洗涤3次后，釆用流式细胞仪检测；对照组I和对照组II用PBS代替一抗，其 余方法相同。.结果对照组II分化细胞免疫荧光染色鉴定结果见图2,其中A为NSCs分 化状态，x 400; B-D为NSCs分化后行免疫荧光染色，B为GFAP免疫荧光染色； C为Tujl免疫荧光染色；D为GFAP与Tujl双标免疫荧光染色。从图2可见， 分化条件下培养10天后，绝大部分细胞呈Tujl阳性或GFAP阳性。各组NSCs分化为Tujl阳性、GFAP阳性细胞的比例见表1,结果显示EDS 诱导组除浓度为50 mg/L组外，其余各浓度组Tujl阳性细胞比例均较对照组II有所提高，其中浓度为200 mg/L组与对照组II有显著差异(户<0.05)。表1、各组NSCs分化为Tujl阳性、GFAP阳性细胞的比例(％ ， 7 ± <y)EDS (mg/L)组别对照组I对照组II50100200400800Tujl阳性13. 5±4. 612. 4 ±3. 311. 9 ±3. 415. 1 ± 5. 122. 6 ±4. 716. 3 ±5. 513. 8 ± 3. 4GFAP阳性84. 5 ±7, 485. 3 ±7. 887. 9±8. 182. 3± 9. 275. 3 ±8. 482. 4 ±6. 985. 5 ±8. 7浓度为200 mg/L的EDS诱导NSCs向神经元分化的免疫荧光染色鉴定结果 见图3,其中A-D为对照组II, E-H为浓度为200 mg/L的EDS诱导组；A-H均 DAPI染色；同时，B与F行Tujl免疫荧光染色；C与G行GFAP免疫荧光染色； D与H行GFAP与Tujl双标免疫荧光染色。从图3可见，用浓度为200 mg/L的 EDS诱导后显著提高了 NSCs向Tujl阳性细胞分化的比例。为进一步明确浓度为200 mg/L的EDS对NSCs分化能力的影响，采用流式 细胞术检测NSCs向Tujl阳性细胞分化比例，重复;f全测3次，结果分别为24. 6%、 18.5°/" 21.9%，均值为21.7%，而对照组II结果分别为10.4%、 9.5%、 11.9%, 均值为10. 6%, 二者有统计学差异(<0. 05 )，显示浓度为200 mg/L的EDS诱 导显著提高了 NSCs向Tujl阳性细胞的分化，与免疫荧光染色鉴定结果相符。尽管通过参照本发明的优选实施例，已经对本发明进行了描述，但本领 域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改 变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。10
权利要求
1. 蜕皮甾酮作为诱导哺乳动物神经干细胞向神经元分化的诱导剂的新应用。
2、 诱导哺乳动物神经干细胞向神经元分化的细胞培养基，其特征在于所述 细胞培养基中含有诱导剂蜕皮甾酮。
3、 根据权利要求2所述的诱导哺乳动物神经干细胞向神经元分化的细胞培养 基，其特征在于所述细胞培养基中含有浓度为100-400 mg/L的诱导剂蜕皮甾酮。
4、 根据权利要求3所述的诱导哺乳动物神经干细胞向神经元分化的细胞培养 基，其特征在于所述细胞培养基中含有浓度为200 mg/L的诱导剂蜕皮甾酮。
5、 根据权利要求2、 3、 4之任一权利要求所述的诱导哺乳动物神经干细胞向 神经元分化的细胞培养基，其特征在于所述细胞培养基中还含有胎牛血清。
6、 根据权利要求5所述的诱导哺乳动物神经干细胞向神经元分化的细胞培养 基，其特征在于所述细胞培养基中还含有体积百分浓度为5-20%的胎牛血 清。
7.根据权利要求5所述的诱导哺乳动物神经干细胞向神经元分化的细胞培养基，其特征在于所述细胞培养基中还含有体积百分浓度为10%的胎牛血清。
8、权利要求2所述的诱导哺乳动物神经干细胞向神经元分化的细胞培养基的 制备方法，包括以下步骤a. DMEM/F12基础培养液的制备取制备DMEM/F12基础培养液1L用量的 DMEM/F12 (1:1)干粉1袋、谷氨酰胺2. 5 g，用浓度为0. 1 mol/L、 pH值 为7. 35的磷酸盐緩冲液即PBS溶解并稀释至1L，调节pH值为7. 5，用0. 2 一 微孔滤膜过滤除菌，即得；b. 细胞培养基的制备按照制备100 ml细胞培养基计，取诱导剂蜕皮甾酮 10-40 mg，加入步骤a制得的DMEM/F12基础培养液70 ml使溶解，用0. 2 pm 微孔滤膜过滤除菌后，加入胎牛血清5-20 ml、青霉素与链霉素的混合液即由浓度为4万U/ml的青霉素溶液、浓度为4万U/ml的链霉素溶液按1: 1混 合而成的溶液l ml,最后用DMEM/F12基础培养液定容至100 ml,即得。
9、 根据权利要求8所述的诱导哺乳动物神经干细胞向神经元分化的细胞培养 基的制备方法，其特征在于步骤b中诱导剂蜕皮甾酮的用量为20 mg。
10、 根据权利要求9所述的诱导哺乳动物神经干细胞向神经元分化的细胞培 养基的制备方法，其特征在于步骤b中诱导剂蜕皮甾酮的用量为20 mg，胎 牛血清的加入量为10 ml。
全文摘要
本发明公开了蜕皮甾酮作为诱导哺乳动物神经干细胞向神经元分化的诱导剂的新应用，公开了一种诱导哺乳动物神经干细胞向神经元分化的细胞培养基，含有诱导剂蜕皮甾酮，并且提供了此种细胞培养基的制备方法；实验证实在哺乳动物神经干细胞分化培养基中加入诱导剂蜕皮甾酮，神经干细胞向神经元分化的比例明显提高，特别是当蜕皮甾酮浓度为200mg/L时效果最佳，含有蜕皮甾酮的细胞培养基可诱导哺乳动物神经干细胞向神经元分化，具有良好的应用价值。
文档编号C12N5/06GK101280291SQ200810069728
公开日2008年10月8日 申请日期2008年5月23日 优先权日2008年5月23日
发明者储卫华, 华 冯, 刚 朱, 林江凯, 詹梦熊, 志 陈 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院