专利名称：菜豆荚斑驳病毒的检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及一种菜豆荚斑驳病毒的检测试剂盒及其检测方法，它属于生物技术领域， 专用于口岸检验检疫和农业植检部门等对大豆上菜豆荚斑驳病毒的快速检测。
背景技术：
菜豆荚斑驳病毒(BPMV)属于豇豆花叶病毒科(a)历oWn'flfee)、豇豆花叶病毒属 (Co/w w'/YA9)成员，病毒基因组为二分体线形正义单链RNA， RNA-l长约6kb， RNA-2长约 3.6kb。 BPMV最早是1948年报道于美国査尔斯顿的菜豆Tendergreen品种上，现主要分布于 北美地区，在美国的阿肯色州、北卡罗来纳州、维吉尼亚州、肯塔基州、密西西比州、路 易斯安那州、爱荷华州、伊利诺斯州和印地安那州等大豆种植地区分布广泛。除美国外， 近年来加拿大、巴西、秘鲁也己有BPMV在大豆上发生的报道。菜豆荚斑驳病毒侵染大豆引 起的菜豆荚斑驳病，不仅影响大豆的正常生长，引起产量损失，还使大豆种子质量明显下 降。据统计，BPMV侵染大豆造成的产量损失范围为3y。一52y。，侵染时间越早，损失越严重， 若与大豆花叶病毒(6bj^e朋ifos&'c SMV)复合侵染，则大豆产量损失可高达85%，
给大豆生产带来严重威胁。此外，BPMV侵染大豆后，还可导致大豆更易受到拟茎点霉属 (州OT叩w's)真菌的危害，致使大豆种子品质进一步降低。BPMV作为危险性有害生物，已 被正式列入我国新增进境植物检疫性病毒名录。迄今为止，我国尚未见BPMV发生的报道， 但随着我国对外贸易和大豆加工业的的迅速发展，每年从国外(特别是美国)进口大量大 豆，BPMV随进口大豆传入的风险越来越大。为避免BPMV传入我国，给我国农业生产，特别 是大豆种植业带来巨大危险，迫切需要加强对BPMV的口岸检疫，因此提高该病毒检测技术 具有极其重要的现实意义。
当前，用于植物病毒检测的方法主要包括生物学检测、电镜检测、血清学检测和分子 生物学检测。通过接种指示植物可以检测BPMV，该病毒接种大豆、菜豆Tendergreen后产 生斑驳症状，而接种菜豆Pinto和Bountiful品种后产生局部枯斑，但该方法检测时间长， 并且结果易受人为因素和环境条件的影响。电镜观察由于需要昂贵的仪器和专门的操作人 员，并且材料前处理较为复杂，因此在BPMV的快速检测上具有较大局限性。血清学检测具 有所需设备简单、操作简便、成本低廉和反应灵敏的优点，目前已成为BPMV最常用的检测 方法，但该方法的使用前提是需要有价格昂贵、特异性强的抗血清。与血清学检测方法相比，基于核酸水平的RT-PCR分子检测方法具有灵敏度更高、特异性更强、结果更可靠等优 点，国内外已有多篇关于利用RT-PCR方法检测BPMV的研究报道，包括普通RT-PCR、免疫 捕获巢式RT-PCR和半巢式RT-PCR等(Gu等，Phytopathology, 2002, 92 (4): 446 452; 于翠等，植物检疫，2006， 20 (4): 201 204;闻伟刚等，植物病理学报，2006， 36 (4): 296 300)。但是，至今尚未见应用TC-RT-PCR (试管捕捉RT-PCR)技术检测BPMV的报道， 更未见专门用于检测BPMV的TC-RT-PCR检测试剂盒。
发明内容
本发明的目的是提供一种菜豆荚斑驳病毒的检测试剂盒及其检测方法，它可对口岸进 境大豆种子及田间大豆上菜豆荚斑驳病毒进行快速、准确、有效的检疫鉴定。 本发明技术方案由以下两部分构成 (一) 一种菜豆荚斑驳病毒的检测试剂盒，其特征在于其组成为
(1) 1#液，含有病毒抽提试剂PBS缓冲液，浓度1X， pH7.4;
(2) 2*液，含有菜豆荚斑驳病毒上游引物5， -GGCAATTTTAGAGCAAGTGTTG-3，， 浓度10timol/L;
(3) 3*液，含有菜豆荚斑驳病毒下游引物5， -GCATTTGGCATATTCATGAGAAT-3，， 浓度10umol/L;
(4) 4*液，含有RT Buffer,浓度5X;
(5) 5*液，含有RNA酶抑制因子，浓度40U/PL;
(6) 6#液，含有反转录酶，浓度200U/iiL;
(7) 7*液，含有dNTPs，浓度10咖ol/L:
(8) 8"液，含有PCR Buffer,浓度10X;
(9) 9*液，含有Mgcl2，浓度25mmol/L;
(10) l(f液，含有Taq DNA聚合酶，浓度5U/uL;
(11) ir液，含有菜豆荚斑驳病毒阳性对照；
(12) 12#液，含有菜豆荚斑驳病毒阴性对照；
(13) 13#液，含有PBST缓冲液，浓度1X;
(14) 14*液，含有RNase-free ddH20。
上述1#液-14#液分别为1管，其中r液的含量为10mL， 2-液的含量为100nL， 3*液的含量 为100yL， 4"液的含量为150nL， 5^液的含量为25uL， 6#液的含量为25 ix L, 7#液的含量为 100uL， 8"液的含量为100uL, 9"液的含量为100uL， l(f液的含量为lOii L， 11#液的含量为 2mL， l"液的含量为2mL， lY液的含量为10mL, 14-液的含量为10mU(二)方案(一)所述菜豆荚斑驳病毒的检测试剂盒的检测方法，其特征在于包括如 下步骤
(1) 病毒提取液的制备
① 如果待测样品为大豆叶片，则称取一定量叶片组织，按样品与抽提缓冲液的重 量体积比为l: 10 (克/毫升)的比例加入病毒抽提试剂r液，充分研磨后，4'C下10000g离 心10min,取上清液作为病毒提取液；
② 或者如果待测样品为大豆种子，则先将大豆种子用水浸泡2h后，剥取其种皮作 为样品，再按样品与抽提缓冲液的重量体积比为l: 10 (克/毫升)的比例加入病毒抽提试 剂1#液，充分研磨后，4'C下10000g离心10min，取上清液作为病毒提取液；
(2) 反转录反应取步骤(1)制备的病毒提取液50uL包被PCR管，并以50wL 11#液 和50uL 1Y液分别作为阳性对照和阴性对照包被PCR管，每管37'C下孵育3h、 13#液洗管3次 和14#液洗管2次后，接着进行反转录反应；反转录反应程序为按每管加luL3-液和9uL14' 液，7(TC水浴10min后立即置于冰上冷却3min，再按每管加5uL 4#液、luL 5#液、1 u L 6# 液、2uL 7*液，经42。C lh， 70°C 10min合成cDNA;
(3) PCR反应以病毒提取液、lr液及12"液分别通过反转录反应得到的各5yL cDNA 为模板，按每管加2. 5P L 8*液、2uL9"液、0.5uL7-液、2uL2'液、2uL3"液、10.75uL 14，和0.25uL l(f液，然后进行PCR反应；PCR反应程序为94。C变性3min后进入以下循环 94。C变性30s、 52匸退火45s、 72。C延伸lmin，共35个循环，最后一轮循环结束后72。C延伸 10miru
(4) PCR扩增产物电泳检测PCR反应结束后，取产物10iiL，用1.5%琼脂糖凝胶电泳 进行检测，溴化乙锭染色后在凝胶成像系统上观察并记录实验结果。
含有菜豆荚斑驳病毒样品的电泳检测结果为在542bp处出现明亮的DNA条带。 本发明根据菜豆荚斑驳病毒基因的保守区域设计特异性引物，利用TC-RT-PCR (试管捕
捉RT-PCR)技术对菜豆荚斑驳病毒进行检测，与现有技术相比，本发明所提供的菜豆荚斑
驳病毒的检测试剂盒及其检测方法具有如下优点
1) 本发明应用TC-RT-PCR技术，省去了常规RT-PCR中繁琐的RNA提取步骤，可直接对 病毒提取液进行RT-PCR，不仅简化操作程序、降低操作要求，而且避免了使用有机溶剂， 减少环境污染；与IC-RT-PCR (免疫捕获RT-PCR)相比，本发明不需要价格昂贵的抗血清， 而是用PCR管直接去吸附病毒，大大节约了检测成本。
2) 本发明提供的检测方法检测菜豆荚斑驳病毒，样品用量少、特异性强、灵敏度高、 准确度好、操作简便、结果稳定，不仅能检测单粒大豆种子，同时适于大量样品的快速检测。
3)本发明设计的检测试剂盒制作方法简单、使用经济，具有重要实际应用价值。
图l为带病大豆叶片的检测结果。其中M: DNA分子量标准(100bp); 1:检测样品(带 病大豆叶片)；2: BPMV阳性对照；3: BPMV阴性对照；
图2为带病大豆种子的检测结果。其中M: DNA分子量标准(100bp); 1:检测样品(带 病大豆种子)；2: BPMV阳性对照；3: BPMV阴性对照。
图3为带病大豆幼苗的检测结果。其中M: DNA分子量标准(100bp); 1:检测样品I (带 病大豆幼苗)；2:检测样品II (带病大豆幼苗)；3:检测样品III (带病大豆幼苗)；4: BPMV 阳性对照；5: BPMV阴性对照。
具体实施例方式
以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。 实施例1:菜豆荚斑驳病毒的检测试剂盒
一种菜豆荚斑驳病毒的检测试剂盒，其特征在于其组成为
(1) r液，含有病毒抽提试剂PBS缓冲液，浓度1X, pH7.4;
(2) 28液，含有菜豆荚斑驳病毒上游引物5， -GGCAATTTTAGAGCAAGTGTTG-3，， 浓度10umol/L;
(3) 3*液，含有菜豆荚斑驳病毒下游引物5' -GCATTTGGCATATTCATGAGAAT-3，， 浓度10pmol/L;
(4) 4*液，含有RT Buffer,浓度5X;
(5) 5"液，含有RNA酶抑制因子，浓度40U/uL;
(6) 6*液，含有反转录酶，浓度200U/uL;
(7) 7*液，含有dNTPs，浓度10咖ol/L;
(8) 8*液，含有PCR Buffer,浓度10X;
(9) 9*液，含有Mgcl"浓度25ranol/L;
(10) 10#液，含有Taq DNA聚合酶，浓度5U/uL;
(11) 11#液，含有菜豆荚斑驳病毒阳性对照；
(12) 12#液，含有菜豆荚斑驳病毒阴性对照；
(13) 13#液，含有PBST缓冲液，浓度1X;
(14) 14*液，含有RNase-free ddH20。
所述1"液_14#液分别为1管，其中f液的含量为10mL， 2"液的含量为100uL， 3'液的含量为100uL， ^液的含量为150uL， 5，的含量为25uL， 6"液的含量为25uL， 7"液的含量为 100 uL， 8'液的含量为10(^L，萨液的含量为lOOiiL, 10#液的含量为10 ix L, ll'液的含量为 2mL， 12，的含量为2mL， 13'液的含量为10mL， K液的含量为10mL。 实施例2对菜豆荚斑驳病毒的检测方法
上述菜豆荚斑驳病毒的检测试剂盒用于检测菜豆荚斑驳病毒(BPMV)的检测方法，包
括
1) 称取0.05g大豆病叶，按样品与抽提缓冲液的重量体积比为1: 10 (克/毫升)加 入病毒抽提试剂1"液，充分研磨后，4。C下10000g离心10min,取上清液作为病毒提取液；
2) 取50uL大豆病叶上清液(病毒提取液)包被PCR管，并以50uLll、液、50uL12# 液分别作为阳性对照和阴性对照包被PCR管。每管37'C下孵育3h、 13#液洗管3次和14#液 洗管2次后进行反转录反应；反转录反应程序为按每管加luL 3"液和9uL 14#液，70°C 水浴10min后立即置于冰上冷却3min，再按每管加5 u L 4*液、1 u L 5*液、luL6"液、2wL 7#液。经42。C lh， 70°C 10min合成cDNA;
3) 取以病毒提取液、lr液及12、液分别通过反转录反应得到的各5!iL cDNA为模板， 按每管加2. 5uL 8#液、2uL 9#液、0. 5uL 7"液、2uL 2'液、2uL 3#液、10. 75pL 14#液 和0. 25u L 10#液，然后进行PCR反应。PCR反应程序为94。C变性3min后进入以下循环 94X:变性30s、 52。C退火45s、 72'C延伸lmin，共35个循环，最后一轮循环结束后72。C延 伸10min;
4) PCR反应结束后，取产物10"L，用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，溴化乙锭染色 后在凝胶成像系统上观察并记录实验结果。
含有菜豆荚斑驳病毒(BPMV)样品的电泳检测结果为在542bp处出现明亮的DNA条带 (图1)，否则无。 实施例3 口岸截获美国进境带病大豆种子的检测
与实施例2区别在于检测对象是大豆的种子。先将大豆种子用水浸泡2h后，剥取其种皮
作为样品，再按样品与抽提缓冲液的重量体积比为l: 10 (克/毫升)加入病毒抽提试剂1#
液，充分研磨后，4'C下10000g离心10min，取上清；其余步骤同实施例2，含有菜豆荚斑驳 病毒(BPMV)样品的电泳检测结果为在542bp处出现明亮的DNA条带(图2)，否则无。 实施例4进境美国大豆幼苗的检测
在进境大豆隔离种植基地，随机选取具有斑驳症状的大豆幼苗，每5株幼苗的叶片作为 一份样品，共3份。其余步骤同实施例2，含有菜豆荚斑驳病毒(BPMV)样品的电泳检测结 果为在542bp处出现明亮的DNA条带(图3),否则无。序列表.SEQ.txt
2008-5-30
SEQUENCE LISTING
<110>
福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120>
菜豆莢斑驳病毒的检测试剂盒及其检测方法
<130> None
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<210> 1
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<223> 引物
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权利要求
1. 一种菜豆荚斑驳病毒的检测试剂盒，其特征在于其组成为(1)1#液，含有病毒抽提试剂PBS缓冲液，浓度1×，pH7.4；(2)2#液，含有菜豆荚斑驳病毒上游引物5’-GGCAATTTTAGAGCAAGTGTTG-3’，浓度10μmol/L；(3)3#液，含有菜豆荚斑驳病毒下游引物5’-GCATTTGGCATATTCATGAGAAT-3’，浓度10μmol/L；(4)4#液，含有RT Buffer，浓度5×；(5)5#液，含有RNA酶抑制因子，浓度40U/μL；(6)6#液，含有反转录酶，浓度200U/μ L；(7)7#液，含有dNTPs，浓度10mmol/L；(8)8#液，含有PCR Buffer，浓度10×；(9)9#液，含有Mgcl2，浓度25mmol/L；(10)10#液，含有Taq DNA聚合酶，浓度5U/μL；(11)11#液，含有菜豆荚斑驳病毒阳性对照；(12)12#液，含有菜豆荚斑驳病毒阴性对照；(13)13#液，含有PBST缓冲液，浓度1×；(14)14#液，含有RNase-free ddH2O。
2、 根据权利要求l所述的菜豆荚斑驳病毒的检测试剂盒，其特征在于所述r液-i4"液 分别为1管，其中r液的含量为10mL， 2"液的含量为100uL, 3#液的含量为100 P L， 4#液的含 量为150uL， 5"液的含量为25uL， 6"液的含量为25uL，"液的含量为IOO u L， 8#液的含量 为100uL， 9'液的含量为100nL， 1(^液的含量为10uL， lr液的含量为2mL， 12#液的含量为 2mL， 13"液的含量为10mL， K液的含量为10mL。
3、 权利要求l所述菜豆荚斑驳病毒的检测试剂盒的检测方法，其特征在于包括如下步骤(1)病毒提取液的制备① 如果待测样品为大豆叶片，则称取一定量叶片组织，按样品与抽提缓冲液的重量体积比为l: 10 (克/毫升)的比例加入病毒抽提试剂r液，充分研磨后，4-C下10000g离 心10min，取上清液作为病毒提取液；② 或者如果待测样品为大豆种子，则先将大豆种子用水浸泡2h后，剥取其种皮作为样品，再按样品与抽提缓冲液的重量体积比为l: 10 (克/毫升)的比例加入病毒抽提试 剂1"液，充分研磨后，4'C下10000g离心10min,取上清液作为病毒提取液；(2) 反转录反应取步骤(1)制备的病毒提取液50uL包被PCR管，并以50wL 11#液 和50uL lf液分别作为阳性对照和阴性对照包被PCR管，每管37。C下孵育3h、 13#液洗管3次 和14"液洗管2次后，接着进行反转录反应；反转录反应程序为按每管加lPL3"液和9uL14" 液，70。C水浴10min后立即置于冰上冷却3min,再按每管加5uL 4"液、luL 5'液、1 u L 6' 液、2uL 78液，经42。C lh， 70°C 10min合成cDNA;(3) PCR反应以病毒提取液、l"液及12"液分别通过反转录反应得到的各5uL cDNA 为模板，按每管加2.5uL亂2uL9"液、0.5uL7"液、2uL2'液、2"3#液、10.75" 14"液和0.25uL IO"液，然后进行PCR反应；PCR反应程序为94'C变性3min后进入以下循环 94'C变性30s、 52'C退火45s、 72'C延伸lmin,共35个循环，最后一轮循环结束后72i:延伸 10mins(4) PCR扩增产物电泳检测PCR反应结束后，取产物10uL，用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，溴化乙锭染色后在凝胶成像系统上观察并记录实验结果。
4、根据权利要求3所述菜豆荚斑驳病毒的检测试剂盒的检测方法，其特征在于含有 菜豆荚斑驳病毒样品的电泳检测结果为在542bp处出现明亮的DNA条带。
全文摘要
本发明涉及菜豆荚斑驳病毒的检测试剂盒及其检测方法，它专用于菜豆荚斑驳病毒的检测。该试剂盒包括引物、病毒抽提试剂、RT Buffer、RNA酶抑制因子、反转录酶、dNTPs、PCR Buffer、Mgcl<sub>2</sub>、Taq DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照、PBST缓冲液和RNase-free ddH<sub>2</sub>O。本发明根据菜豆荚斑驳病毒基因的保守区域设计特异性引物，利用TC-RT-PCR技术对菜豆荚斑驳病毒进行检测，无需繁琐的RNA提取步骤，直接对病毒提取液进行反转录和PCR，不仅操作简便、结果稳定、特异性强、灵敏度高，而且检测成本相对较低，因此具有较高的实用价值。
文档编号C12Q1/68GK101285104SQ20081007115
公开日2008年10月15日 申请日期2008年5月30日 优先权日2008年5月30日
发明者沈建国, 王念武, 赟 虞, 郭琼霞, 黄可辉 申请人:福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心