专利名称：一种编码糖基水解酶家族32的蔗糖酶的基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的编码蔗糖酶的基因，特别是涉及克隆自环境宏基因组的种新的编 码蔗糖酶的基冈，该基因编码的蛋白质可用丁蔗糖的降解。
背景技术：
蔗糖是由a-D-葡萄糖和P-D-果糖通过1， 2糖苷键组成的二糖。蔗糖作为植物中通过光 合作用产生的糖类物质，是一种含量丰富的生物质。全球庶糖的年产量超过了 1亿吨。蔗糖 分解而成的单糖长期以来作为发酵工业中的碳源而被利用。
蔗糖酶能催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖。葡萄糖和果糖可作为重要的工业原料生产有机 醇、氨基酸及生物聚合物等高附加值的化工产品。同时蔗糖分解成的葡萄糖也是生产乙醇的 重要原材料。微生物蔗糖发酵的代谢过程是首先由蔗糖酶将蔗糖分解成葡萄糖和果糖，然后 葡萄糖和果糖才能进入糖酵解发酵途径得到有机醇、氨基酸及生物聚合物等化工产品。蔗糖 酶是微生物蔗糖代谢途径中的关键酶之一，也是降解蔗糖的第一个酶，也是决定蔗糖发酵时 间的最主要的因素之一。因此寻找新的蔗糖酶基因用于构建新的更适合工业化生产各种化工 产品的基因工程菌，提高微生物水解蔗糖的转化效率和水解速度，从而缩短发酵生产时间， 对于降低直接发酵甘蔗汁生产各种化工产品的生产成本具有十分重要的意义。
蔗糖酶属于糖基水解酶类(glycosyl hydrolases)，许多糖基水解酶由一个催化功能
域和一个或更多个其它的功能域组成，根据催化功能域的氨基酸序列相似性，糖基水解酶类 被划分成不同的家族(families) (Davies G. ， Henrissat B. 1995. Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases. Structure 3:853-859; Henrissat B. ， Bairoch A. 1996. Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases. Biochem. J. 316:695-696)。 根据碳水化合物活性酶数据库(http:〃www. cazy. org/fam/acc_GH. html)上所列糖基水解酶 类的最新清单，目前糖基水解酶类有112个家族，蔗糖酶属于糖基水解酶类家族32。
目前国内外对蔗糖酶基因研究主要集中于已知的几种蔗糖酶含量高的肠道细菌(克雷伯 氏菌、大肠杆菌、沙门氏杆菌)上，对这些菌的蔗糖酶基因进行遗传学的研究(Sharon J. Reid，Valerie R. Abratt，2005. Sucrose utolosation in bacteria:genetic organisation and regulation. Appl Microbiol Biotechnol. 67:312-321)。上海医药工业研究院的张洪 斌构建了右旋糖酐蔗糖酶工程菌株同时对其培养条件进行了研究(微生物学 报.2008， 48(4). 492-497);广西大学的苏龙和农万庭分别克隆了来Q嗜热菌XZ2K2和肠膜明 串珠菌的葡聚糖蔗糖酶基因，并在大肠杆菌中进行表达(化学与生物工 程.2006， 23(7). 42-44， 47。工业微生物.2007, 37(3). 29-32);华中农业大学食品科技学院的邵彦春筛选到一株肠膜明串珠菌菌株，同时克隆了其中的右旋糖苷蔗糖酶基因并对其进行了 序列分析(微生物学通报.2005, 32(3). 20-23)。人类所克隆的蔗糖酶基因都是从人类所培养的微生物中来的，但并不足自然界中所有微 生物都是可以被分离、培养的， 一般认为可培养的微生物种类只占自然界中微生物种类的1 % (Rapp6 MS, Giovannoni SJ. 2003. The uncultured microbial majority. Annu Rev Microbiol. 57:369-94.)，而其余的99%的微生物是用目前的实验条件所无法培养的。这些 不可培养的微生物中蕴藏着大量的基因资源。从这些无法培养的微生物中获取基因资源成为 微生物石if究的热点(Cowan D. et al， 2005. Metagenomic gene discovery: past, present and future. Trends Biotechnol. 23:321-9)。近年来从环境样品未培养微生物提取基因组 DNA然后构建混合基因组DNA文库以分离各种新基因已是成熟技术(Lorenz P， Schl印er C. 2002. Metagenonie- a challenging source of enzyme discovery. Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic 19-20:13-19)。糖厂废水中含有丰富的蔗糖，被糖厂废水污染浸润 的土壤中有大量的微生物在进行蔗糖的分解，而这个土壤环境中的未培养微生物中含有大量 的基因资源如蔗糖酶基因资源，其中很可能有些就是优于目前所发现的最好的蔗糖酶的高效 酶的基因。通过构建糖厂废水污染土壤微生物的混合基因组DNA文库，极有可能从中筛选得 到新的蔗糖酶基因。发明内容本发明的目的是通过构建自然界环境中不可培养的微生物的宏基因组DNA文库，从中 筛选得到新的蔗糖酶基因，用丁蔗糖的降解。本发明人从广西壮族自治区武鸣县糖厂废水污染土壤环境中取样，提取土壤中所有微生 物的DNA，构建宏基因组DNA文库，通过蔗糖酶活性平板检测筛选法，分离得到了新的编 码蔗糖酶的基因，它属于编码糖基水解酶家族32的蔗糖酶基因，可在宿主细胞中人量表达该 蔗糖酶，用于蔗糖的降解，命名为invGX (SEQIDNO: 1)，是由1458个碱基组成，含有完 整的蔗糖酶基因invGX的开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)， invGX基因的起始密码 为GTG，终止密码子为GTA。SEQ ID NO: 2的蛋白质是基因invGX编码的蔗糖酶产物InvGX，由486个氨基酸组成， 和InvGX催化功能域同源性最高的为热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter sp. X514)的 sucrose-6-phosphate hydrolase的催化功能域(e-值为e-97)，两者的相似性为38%、相同性为 56%。这种新的蔗糖酶基因invGX在大肠杆菌中表达的重组产物InvGX能降解蔗糖。所述的 蛋白质在蔗糖降解和对含蔗糖材料的处理中也具有广泛的应用。以下是本发明人对上述SEQ ID NO.l的基因进行核苷酸测序，该编码糖基水解酶家族 32的蔗糖酶基因序列表如下(SEQUENCE LISTING)1. SEQ ID NO.l(1)序列特征a. 长度1458碱基对b. 类型DNA/RNAc. 链型双链d. 儿何结构线形(2) 分子类型核苷酸(3) 序列描述gtgccgtctgcaccttccgtatccatcaacactgagtttcagggtcagttccacctctgcgctccggtgggctggctgaacgaccccaacgggctttcctggttcgccgggaggcttcatctgttctatcagtaccatccgtattccagcgtctggggtcccatgcactggggccacgcggtcaccgaggacttggtgcgctggacccatctccctatcgcgctgattcccggagagccctacgacgccgacgggtgtttctcgggcggcgccgtggccgacggggagcgtcacgctctgctctacaccggacacgtggaccccgatcccctggacccgtcgcgccgcgtcgagacccagtgtctggcctggggcgacgggacggtctaccacaaggctccccagaacccggtgatcggtcccgagctgctgccggagggggcttctcggggcgatttccgcgatccgaaggtgtggaaggagggcctccactggtactgtctggttgccagccgccacgctgacgggcacggccagatcctcctgttcaccgccgagaccccgactcagtggcgcctggtggggccggtgcttcaaagccgtggtcggctgggcggcatgtgggagtgcccggacctgttcgtgctcgatggtcgggaggtgctgctttggtcggtgatgggacagccccagcaggacggcggcttccagaatcccagcgcggtggtgtggtccgtcggcaccctcgaccgcactaccggcgccttcctccccgacgcgattcaggaggtcgatcagggacccgacttctacgcggcccagaccacgacgttgcccgatggccgcgtggtgctcgtcggttggatgcagatgtgggagaggagcatccccaccgatgagcttgggcacggctgggccggteggatgacgcttgtgcgcgaggtgtactggcaccg鄉gcgactggcccagaggccggtgcgagagctagaggcctaccggcgggaggaggteacgggcgcggcgaccttcgaagggcgtcacgagttctcaggcgtggaggggcaggcactggacctcgaggtcgaattccgaagctggaaagggcagtccgtcgggctcagcgtgtttgcctcggagacggaagagacccgcctcacctgggagccgcagtcgggatggttgaccctcgaccgctctcggagtggcgtccccatcgccagccgatcggcgacgcaccccgactgccaggtctatcgtgctcgcgtcgaggctcccgagggtgtgcttteccttcgtttggtcttggaccgctcggcggtcgaggtcttcgcgcagaacggcaccacgacgctgagcgccacggtctatccgcggccgacgagcgcgcgcgtggcgtttctgtccgagggcggcaccaccgaagtggtctgccgagcctggccgctggccctcgta本发明人对具有SEQ ID NO: 1的核苷酸进行表达的蛋白质，列表如下-2、 SEQIDNO.2(2)序列特征-a. 长度486氨基酸b. 类型多肽C.链型单链d.几何结构立体(2) 分子类型蛋白质(3) 序列描述Vpsapsvsintefqgqfhlcapvgwlndpnglswfagrlhlfyqyhpyssvwgpmhwghavtedlvrwthlpialipgepydadgcfs ggavadgerhallytghvdpdpldpsrrvetqclawgdgtvyhkapqnpvigpellpegasrgdfrdpkvwkeglhwyclvasrhadgh gqillftaetptqwrlvgpvlqsrgrlggmwecpdlfvldgrevllwsvmgqpqqdggfqnpsavvwsvgtldrUgaflpdaiqevdqg pdfyaaqtttlpdgrvvlvgwmqmwersiptdelghgwagrmtlvrevywhrgiiaqrpvreleayrreevtgaatfegrhefsgvegqaldlevefrswkgqsvglsvfaseteetrltwepqsgwltldrsrsgvpiasrsathpdcqvyrarveapegvlslrlvldrsavevfaqngUtls atvyprptsarvaflseggttewcrawplalv本发明所述的编码蔗糖酶的基因，其功能等同变异体的核苷酸序列的有突变形式，突变 形式包括缺失、无义、插入、错义。含有本发明所述的蔗糖酶基因的表达载体，及用于转化本发明基因的宿主，含有基因所 述表达载体转化的原核细胞或真核细胞。含有本发明所述的编码蔗糖酶基因的表达载体及用于转化本发明基因的宿i，含有基因 所述表达载体转化的原核细胞或真核细胞木发明所述的蔗糖酶基因采集以及测定的方法包括以下几个步骤 (1)微生物总DNA的提取；(2)构建微生物宏基因组文库；(3)蔗糖酶基因invGX序列 的测定；(4)蔗糖酶基因/md的核苷酸序列分析；(5)庶糖酶基因编码的产物氨基酸序列 分析；(6)蔗糖酶基因/wvGX的克隆和表达；(7)蔗糖酶InvGX酶活的测定。 以下是详细方法1) 微生物总DNA的提取取200克糖厂废水污染的土壤，悬浮在100ml的0. 18M磷酸钾缓冲液(pH7. 2)中，然后 在600g离心力下离心10分钟收集上清液。上清中加入40ml PVPP(聚乙烯聚吡咯烷酮， polyvinylpolypyrrolidone (购自Sigma公司，目录号P-6755))溶液(PVPP溶液每100mg PVPP与lml 0. 18M磷酸钾缓冲液(pH7.2)混匀)，振荡30秒，再加入20(^1 3M CaCl2溶液， 振荡30秒后，在600g离心力离心5分钟，收集上清液于另一个离心管中并用8000g离心力 离心15分钟收集上清液中的细菌细胞。收集到的菌体沉淀块悬浮在lml TE (10mMTris/HCl， pH8.0, lmMEDTA， pH8.0)溶液中，并在37°C K加入10(^1溶菌酶(20mg/ml,溶于TE溶液) 作用30分钟，然后以10000g离心1分钟再次沉淀细胞，细胞沉淀块悬浮在600 pl PUREGENE 公司的基因组DNA纯化试剂盒(Genomic DNA Purification Kit,)的细胞裂解缓冲液(Cell Lysis Solution)中，置80"C水浴锅5分钟以裂解细胞，待样品冷却到室温后，加入200^1 上述试剂盒中的蛋白质沉淀溶液(Protein Precipitation Solution),充分混匀后13000g 离心3分钟，将上清液转移到个新的1.5 ml微量离心管中，加入600^1 100%异丙醇，充 分混匀后即见DNA絮状沉淀析出，挑出DNA絮状沉淀，用70%乙醇洗2次DNA，干燥后将DNA 溶于50(V1TE溶液即得DNA粗提物。将DNA粗提物加到含有S印hadex G200和2%PVPP的层析柱(200咖x 10mm)上，用 缓冲液洗脱，按每组分1ml分部收集洗脱液，每一组分加入lOOpl的3M醋酸钠溶液(pH4.8) 及lml异丙醇沉淀DNA，把沉淀物溶于TE中，合并所得DM溶液，0. 7%琼脂糖凝胶电泳后 切下含20kb以上的DNA的凝胶，用电洗脱法回收纯化DNA。2) 构建微生物宏基因组文库为了用这些纯化的DNA制做基因文库，首先对这些DNA进行末端修补以产生平头末端而 和文库制备试剂盒中已处理好的同样具平头末端的C叩yControl" pCClFOS 载体相连，依次 在冰上向一个新的灭过菌的微量离心管中加入8|al IOX末端修补缓冲液(330 mM Tris —醋酸[pH7.8]， 660福醋酸钾，lOOmM醋酸镁，5mM DTT)， 8|il 2. 5 mM dNTP混合物(每种2. 5 raM)， 8^1 10 mM ATP， 20 |ig DNA(O. 5 pg/Vl) ， 4^1末端修补酶混合物(T4 DNA聚合酶和 T4多聚核苷酸激酶)。室温下放置45分钟，再转移到7(TC水浴锅放置10分钟以终止酶反应， 1. 0%低熔点琼脂糖凝胶电泳后切K含25 kb—45 kb的DNA的凝胶进行DNA回收，为了使回 收片段与文库制备试剂盒中己处理好的具平头末端的载体在T4 DNA连接酶的作用下连接起 来，依次在冰上向一个新的灭过菌的微量离心管中加入2pl无菌水，lpllO倍快速连接缓 冲液(10X Fast-Link Ligation Buffer), 1 jxl 10 mM ATP, l^il CopyControl pCClFOS 载 体(0.5 pg)， 5^1低熔点琼脂糖凝胶回收的25 kb—45 kb的DNA (0.1吗/^1)， 1^1快速 连接DNA连接酶(Fast-Link DNA Ligase， 2单位/pl)，混匀后在室温下放置2个小时，再在 7CTC放置10分钟以终止酶反应。为了将连接反应产物用X包装提取物(属购自Epicentre公 司的文库制备试剂盒CopyControl Fosmid Library ProducL丄on Kit的一个组分)包装，将 在冰上刚刚溶化的入包装提取物25pl立即转移到一个新的灭过菌的微量离心管中并快速置于 冰上，再往其中加入IO )al连接反应产物，充分混匀后置于3(TC 90分钟后，再往其中加入 25 pl溶化的l包装提取物，充分混匀后置于30'C 90分钟，向其中加入935 jil噬菌体稀释 缓冲液(10 mM Tris-HCl[pH 8.3], 100 mM NaCl， 10 raM MgCl2)，再将该lmL包装反应产物 加入到10 mL的0Df,。。=1.0的宿主大肠杆菌EPI300培养液(培养基为LB[每升含胰蛋白胨
(Oxoid)， 10g;酵母浸出粉(Difco), 5g; NaCl， 5g; pH7. 0] + 10 mM MgS04)屮，37。C下 放置20分钟让上述得到的包装的人噬菌体吸附和侵染宿主细胞& cWi EPI300,在含氯霉素
(12. 5 w g/mL)的LA平板上筛选转化子。结果共获得约11万个转化子。
3) 蔗糖酶基因序列的测定
用平板影印法将含有氨卞青霉素的LA平板上得到的转化子(每平板约300个菌落)分别影 印到含有氨卞青霉素的以蔗糖为唯一碳源的M9基本培养基(M9基本培养基[每升含 Na2HP04 7H20， 12.8g; KH2P04， 3g; NaCl， 0.5g; NH4C1， lg])的平板上，将平板倒置 于37'C培养箱培养3天。结果筛选到两个能在以蔗糖为唯一碳源的基本培养基上生长的克隆， 本发明只涉及其中一个克隆，进一步提取该克隆的质粒DNA并将其命名为pINV，用限制性 内切酶feam酶切pINV后，将获得的DNA片段与去磷酸化的经酶切的pUC19质粒进 行连接。再将连接产物转化到大肠杆菌JM109中，在含氨苄青霉素(lOOiig/mL)的LA平板 上筛选转化子。结果共获得约200个转化子，用平板影印法将得到的转化子影印到含有氨卞 青霉素的以蔗糖为唯 -碳源的M9基本培养基的平板上，将平板倒置于37T:培养箱培养3天。 结果筛选到一个能在以蔗糖为唯一碳源的M9基本培养基上生长的亚克隆。进一歩提取该亚 克隆的质粒DNA并将其命名为pINV2，用限制性内切酶^mHI完全酶切pINV2后，进行0. 7 %琼脂糖凝胶电泳分析，结果pINV2除有一个2. 7kb的载体片段外，还给出另外一条DNA片 段，大小为6.4kb。于是，对pINV2进行测序。pINV2送交大连宝生物生物工程公司测定DNA 核苷酸序列。
4) 蔗糖酶基因的核苷酸序列分析
用软件对DNA序列进行分析。本发明基因/"vGX的开放阅读框由1458个核苷酸组成，序 列如SEQIDNO:l。其中，^vGZ基因的起始密码子为GTG，终止密码子为GTA。5) 蔗糖酶基因fwGX编码的产物InvGX的氨基酸序列分析蔗糖酶基因/"vGX编码一个含486个氨基酸的蛋白质，用DNAStar软件预测该蛋白质的 理论分子量大小为53460道尔顿。用简单组件结构研究工具分析糖厂废水污染土壤微生物中的蔗糖酶InvGX的组件结构， 结果是自N端的第18 — 448位氨基酸为家族32糖基水解酶(glycosyl hydrolase)功能域。6) 蔗糖酶基因的克隆和表达使用上游引物5，一ACCCATGGCACCACCACCACCACCACC GTCTGCACCTTCCGTATCC — 3，和下游引物5' — CACAAGCTTTCGGTCGGCGACAGGCTGAGCG—3'，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增蔗糖酶基因/wGX 用限制性内切酶脸ol和M"dIII酶切蔗糖酶基因i"vGZ后，与经7Vco1和历wdIII酶切的表达 载休pSE380进行连接。再将连接产物转化到大肠杆菌XL1-Blue中(转化方法为CaCl2法)， 涂布到含氨节青霉素(100吗/mL)的LA平板上筛选克隆。进一步提取该克隆的质粒DNA 并将其命名为pSE-/AV，用限制性内切酶TVcoI和///wdlll完全酶切pSE-/AV后，进行0.7%琼 脂糖凝胶电泳分析，结果？8￡-/^除有一个4.1]^的载体片段外，还有一条大小为1458bp的 目的DNA片段。将含有质粒pSE-/7VK的重组大肠杆菌XL1-Blue菌株接种到20mL含氨苄青霉素 (100吗/mL)的LB培养基中，37。C振荡培养，待OD6()Q为0.4时，加入IPTG使其终浓度为 l.OmM， 37。C诱导10hr。 11000rpm离心3min，收集菌体，用4mL pH7.0 100mM的磷酸缓冲 液重悬菌体，超声波破胞9min。 12000rpm离心10min，上清即为含有蔗糖酶InvGX的粗酶 液。7) 蔗糖酶酶活的测定取20nl蔗糖酶InvGX粗酶液，加入500WpH7.0值100mM的磷酸缓冲液，与480)al 1%蔗糖 (溶于水中)溶液混合，在37i:作用2小时后，加入80(V1 DNS溶液[DNS试剂配制称取l克 NaOH用约40mlddH2O溶解，再称取l克二硝基水杨酸、0.2克苯酚、0.05克无水亚硫酸钠、20 克四水酒石酸钾钠，将其溶解于约30mlddH2O中，两种溶液混合，定容到100ml。]，放置沸 水中反应5分钟，室温冷却，用分光光度计测吸光度OD530。吸光度测定值与不同含量的葡萄 糖吸光度标准曲线图作比较计算酶活。本发明的编码糖基水解酶家族32的蔗糖酶Im'GX的所述的蛋白质在蔗糖降解和对含蔗 糖材料的处理中的应用基因可以应用于水解成葡萄糖和果糖。用分光光度计测吸光度0D530 测量本发明的酶活，每毫升蔗糖酶粗酶液的酶活力为316个国际单位。
具体实施方式
下述实施方法是为了更好的解释本发明，而不应该被解释为限制本发明的目的。实施例1:在本发明的实施例中所用到的材料包括大肠杆菌(&c力eric/u's coh')株系EPI300 (属购自Epicentre公司的文库制备i式剂盒CopyControl Fosmid Library Production Kit (目录号CCFOS110)的一个组分)；载体为购自Epicentre公司的柯斯质粒载体C.opyControl pCC丄F0S";购自Epicentre公司的文库制备试剂盒(CopyContror Fosmid Library Production Kit,目录号CCF0S110)，购自TaKaRA、 MBI的限制性内切酶、修饰酶等试剂。
下面将通过实施例对本发明作详细描述
5) 广西武鸣县糖厂废水污染土壤微生物总DNA的提取
取200克糖〗废水污染的土壤，悬浮在lOOral的0. 18M磷酸钾缓冲液(pH7. 2)中，然后 在600g离心力下离心10分钟收集上清液。上清中加入40ml PVPP(聚乙烯聚吡咯垸酮， polyvinylpolypyrrolidone (购自Sigma公司，目录号P 6755))溶液(PVPP溶液每100mg PVPP与lml 0. 18M磷酸钾缓冲液(pH7. 2)混匀)，振荡30秒，再加入200(11 3M CaCl2溶液， 振荡30秒后，在600g离心力离心5分钟，收集上清液于另一个离心管中并用8000g离心力 离心15分钟收集上清液中的细菌细胞。收集到的菌体沉淀块悬浮在lml TE (10trMTris/HCl， pH8. 0， lmMEDTA, pH8. 0)溶液中，并在37。C下加入lOOpl溶菌酶(20mg/nil，溶于TE溶液) 作用30分钟，然后以lOOOOg离心1分钟再次沉淀细胞，细胞沉淀块悬浮在600 pl PUREGENE 公司的基因组DNA纯化试剂盒(Genomic DNA Purification Kit,目录号R-5500A)的细胞裂 解缓冲液(Cell Lysis Solution)中，置80'C水浴锅5分钟以裂解细胞，待样品冷却到室温 后，加入200(xl上述试剂盒中的蛋白质沉淀溶液(Protein Precipitation Solution),充分 混匀后13000g离心3分钟，将上清液转移到一个新的1. 5 ml微量离心管中，加入600^1 100 %异丙醇，充分混匀后即见DNA絮状沉淀析出，挑出DNA絮状沉淀，用70%乙醇洗2次DNA， 干燥后将DNA溶于50(V1TE溶液即得DNA粗提物。
将DNA粗提物加到含有S印hadex G200 (购自Pharmacia公司，目录号17-0080-01)和 2%PVPP的层析柱(200腿xl0腿)上，用TE缓冲液洗脱，按每组分1ml分部收集洗脱液， 每 -组分加入lOOpl的3M醋酸钠溶液(pH4. 8)及1ml异丙醇沉淀DNA，把沉淀物溶于TE中， 合并所得DNA溶液，0. 7%琼脂糖凝胶电泳后切下含20kb以上的DNA的凝胶，用电洗脱法回 收纯化DNA。
6) 构建糖厂废水污染土壤微生物宏基因组文库
为了用这些纯化的DNA制做基因文库，首先对这些DNA进行末端修补以产生平头末端而 和文库制备试剂盒中己处理好的同样具平头末端的CopyControl pCClFOS 载体相连，依次 在冰上向一个新的灭过菌的微量离心管中加入8pl IOX末端修补缓冲液(330 mMTris —醋 酸[pH7.8]， 660 mM醋酸钾，lOOmM醋酸镁，5mM DTT)， 8pl 2. 5 mM dNTP混合物(每种2. 5 mM)， 8^1 10 mM ATP， 20 DNA(O. 5 pg/pl) ， 4pl末端修补酶混合物(T4 DNA聚合酶和 T4多聚核苷酸激酶)。室温下放置45分钟，再转移到7(TC水浴锅放置10分钟以终止酶反应， 1. 0%低熔点琼脂糖凝胶电泳后切下含25 kb — 45 kb的DNA的凝胶进行DNA回收，为了使回 收片段与文库制备试剂盒中已处理好的具平头末端的载体在T4 DNA连接酶的作用下连接起 来，依次在冰上向一个新的灭过菌的微量离心管中加入2pl无菌水，1)^110倍快速连接缓 冲液(10X Fast-Link Ligation Buffer), 1 10 m\1 ATP， lpl CopyControl pCClFOS 载 体(0.5 pg)， 5^1低熔点琼脂糖凝胶回收的25 kb—45 kb的DNA (0.1吗/>1)， lpl快速 连接DNA连接酶(Fast-Link DNA Ligase， 2单位/>1)，混匀后在室温下放置2个小时，再在7CTC放置IO分钟以终止酶反应。为了将连接反应产物用人包装提取物(属购自Epicentre公 司的文库制备试剂盒CopyContror Fosmid Library Production Kit (目录号CCF0S110)的 一个组分)包装，将在冰上刚刚溶化的X包装提取物(属购自Epicentre公司的文库制备试剂 盒CopyContror Fosraid Library Production Kit (目录号CCF0S110)的一个组分)25jal 立即转移到一个新的灭过菌的微量离心管中并快速置于冰上，再往其中加入10 pi连接反应 产物，充分混匀后置于3(TC 90分钟后，再往其中加入25]al溶化的X包装提取物，充分混匀 后置于30。C 90分钟，向其中加入935 pl噬菌体稀释缓冲液(lOmMTris-HCl[pH8. 3], 100 mM NaCl， 10 mM MgCL)，再将该lmL包装反应产物加入到10 mL的0D,=1. 0的宿主大肠杆菌 EPI300培养液(培养基为LB[每升含胰蛋白胨(0xoid)， ]0g;酵母浸出粉(D订co)， 5g; NaCl， 5g; pH7. 0] + 10 mM MgS04)中，37。C下放置20分钟让上述得到的包装的X噬菌体吸附和侵 染宿主细胞Eco〃RPT300，在含氯霉素(12.5ug/raL)的LA平板上筛选转化子。结果共获 得约ll万个转化子。7) 蔗糖酶基因ZwvGZ序列的测定用平板影印法将含有氨卞青霉素的LA平板上得到的转化子(每平板约300个菌落)分别影 印到含有氨卞青霉素的以蔗糖为唯一碳源的M9基本培养基(M9基本培养基[每升含 Na2HP04 7H20， 12.8g; KH2P04， 3g; NaCl， 0.5g; NH4C1， lg])的平板上，将平板倒置 于37'C培养箱培养3天。结果筛选到两个能在以蔗糖为唯一碳源的基本培养基上生长的克隆， 本发明只涉及其屮一个克隆，进一步提取该克隆的质粒DNA并将其命名为pINV，用限制性 内切酶及^MI酶切pINV后，将获得的DNA片段与去磷酸化的经5aMil酶切的pUC19质粒进 行连接。再将连接产物转化到大肠杆菌JM109中(转化方法为CaCL法)，在含氨节青霉素 (lOOugAiU的LA平板上筛选转化子。结果共获得约200个转化子，用平板影印法将得到 的转化子影印到含有氨卞青霉素的以蔗糖为唯一碳源的M9基本培养基的平板上，将平板倒 置于37'C培养箱培养3天。结果筛选到一个能在以蔗糖为唯一碳源的M9基本培养基上生长 的亚克隆。进一步提取该亚克隆的质粒DNA并将其命名为pINV2，用限制件内切酶 完全酶切pINV2后，进行0. 7%琼脂糖凝胶电泳分析，结果pINV2除有一个2. 7kb的载体片 段外，还给出另外一条DNA片段，大小为6.4kb。于是，对pINV2进行测序。pINV2送交大 连宝生物生物工程公司测定DNA核苷酸序列。8) 蔗糖酶基因/m;GX的核苷酸序列分析用NCBI (National Center for Biotechno]ogy Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上的软件如0RF finder (ht.tp://www. ncbi. nlm. nih. gov/gorf/gorf. html)，Blast (http:〃雨.ncbi. nlm. nih. gov/BLAST)对DNA序列进行分析。基因/"vGZ的开放阅读 框(Open Reading Frame, ORF)由1458个核苷酸组成，序列如SEQIDNO: 1。其中，/"vGZ 基因的起始密码子为GTG，终止密码子为GTA。 5)蔗糖酶基因/"vGX编码的产物InvGX的氨基酸序列分析蔗糖酶基因Z"vGX编码一个含486个氨基酸的蛋白质，用DNAStar软件预测该蛋白质的 理论分子量大小为53460道尔顿。用简争组件结构研究工具(Simple Modular Architecture Research Tool, SMART, http:〃smart. embl_heidelberg.de)分析糖厂废水污染土壤微生物中的蔗糖酶InvGX的组 件结构，结果是自N端的第18 — 448位氨基酸为家族32糖基水解酶(glycosyl hydrolase) 功能域。
6) 蔗糖酶基因/m'GX的克隆和表达
使用上游弓I物5'—ACCCATGGCACCACCACCACCACCACC GTCTGCACCTTCCGTATCC — 3 ，下游弓I物5 ， — CACAAGCTTT
CGGTCGGCGACAGGCTGAGCG—3'，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增蔗糖酶基因/"vGX 用限制性内切酶Wcol和州"dIII酶切蔗糖酶基因/otGJT后，与经脸ol和历"dIII酶切的表达 载体pSE380进行连接。再将连接产物转化到大肠杆菌XL1-Blue中(转化方法为CaCl2法)， 涂布到含氨苄青霉素(100吗/mL)的LA平板上筛选克隆。进一步提取该克隆的质粒DNA 并将其命名为pSE-7M用限制性内切酶Wcol和///"dill完全酶切pSE-/7W后，进行0.7%琼 脂糖凝胶电泳分析，结果？8￡-/7\^除有一个4.11^的载体片段外，还有一条大小为1458bp的 目的DNA片段。
将含有质粒pSE-/AV的重组大肠杆菌XL1-Blue菌株接种到20mL含氨苄青霉素 (10(Vg/mL)的LB培养基中，37t:振荡培养，待OD6W为0.4时，加入IPTG使其终浓度为 l.OmM， 37。C诱导10hr。 llOOOrpm离心3min，收集菌体，用4mLpH7.0 lOOmM的磷酸缓冲 液重悬菌体，超声波破胞9min。 12000rpm离心10min，上清即为含有蔗糖酶InvGX的粗酶 液。
7) 蔗糖酶IiwGX酶活的测定
取20pl蔗糖酶InvGX粗酶液，加入500W pH7.0值100mM的磷酸缓冲液)，与480(il 1%蔗 糖(溶于水中)溶液混合，在37'C作用2小时后，加入800pl DNS溶液[DNS试剂配制称取l 克NaOH用约40mlddH2O溶解，再称取l克二硝基水杨酸、0.2克苯酚、0.05克无水亚硫酸钠、 20克四水酒石酸钾钠，将其溶解于约30mlddH2O中，两种溶液混合，定容到100ml。]，放置 沸水中反应5分钟，室温冷却，用分光光度计测吸光度OD530。吸光度测定值与不同含量的葡 萄糖吸光度标准曲线图作比较计算酶活。
蔗糖酶酶活定义按国际酶活定义为每分钟产生葡萄糖的量。每毫升蔗糖酶粗酶液的酶活 力为316个国际单位，说明本发明的编码糖基水解酶家族32的蔗糖酶能够降解蔗糖，可以应用 于水解蔗糖生成葡萄糖和果糖。
权利要求
1.一种编码蔗糖酶的基因，其特征在于其核苷酸和蛋白质序列如下(1)核苷酸序列gtgccgtctgcaccttccgtatccatcaacactgagtttcagggtcagttccacctctgcgctccggtgggctggctgaacgaccccaacgggctttcctggttcgccgggaggcttcatctgttctatcagtaccatccgtattccagcgtctggggtcccatgcactggggccacgcggtcaccgaggacttggtgcgctggacccatctccctatcgcgctgattcccggagagccctacgacgccgacgggtgtttctcgggcggcgccgtggccgacggggagcgtcacgctctgctctacaccggacacgtggaccccgatcccctggacccgtcgcgccgcgtcgagacccagtgtctggcctggggcgacgggacggtctaccacaaggctccccagaacccggtgatcggtcccgagctgctgccggagggggcttctcggggcgatttccgcgatccgaaggtgtggaaggagggcctccactggtactgtctggttgccagccgccacgctgacgggcacggccagatcctcctgttcaccgccgagaccccgactcagtggcgcctggtggggccggtgcttcaaagccgtggtcggctgggcggcatgtgggagtgcccggacctgttcgtgctcgatggtcgggaggtgctgctttggtcggtgatgggacagccccagcaggacggcggcttccagaatcccagcgcggtggtgtggtccgtcggcaccctcgaccgcactaccggcgccttcctccccgacgcgattcaggaggtcgatcagggacccgacttctacgcggcccagaccacgacgttgcccgatggccgcgtggtgctcgtcggttggatgcagatgtgggagaggagcatccccaccgatgagcttgggcacggctgggccggtcggatgacgcttgtgcgcgaggtgtactggcaccgagggcgactggcccagaggccggtgcgagagctagaggcctaccggcgggaggaggtcacgggcgcggcgaccttcgaagggcgtcacgagttctcaggcgtggaggggcaggcactggacctcgaggtcgaattccgaagctggaaagggcagtccgtcgggctcagcgtgtttgcctcggagacggaagagacccgcctcacctgggagccgcagtcgggatggttgaccctcgaccgctctcggagtggcgtccccatcgccagccgatcggcgacgcaccccgactgccaggtctatcgtgctcgcgtcgaggctcccgagggtgtgctttcccttcgtttggtcttggaccgctcggcggtcgaggtcttcgcgcagaacggcaccacgacgctgagcgccacggtctatccgcggccgacgagcgcgcgcgtggcgtttctgtccgagggcggcaccaccgaagtggtctgccgagcctggccgctggccctcgta(2)蛋白质序列Vpsapsvsintefqgqfhlcapvgwlndpnglswfagrlhlfyqyhpyssvwgpmhwghavtedlvrwthlpialipgepydadgcfsggavadgerhallytghvdpdpldpsrrvetqclawgdgtvyhkapqnpvigpellpegasrgdfrdpkvwkeglhwyclvasrhadghgqillftaetptqwrlvgpvlqsrgrlggmwecpdlfvldgrevllwsvmgqpqqdggfqnpsavvwsvgtldrttgaflpdaiqevdqgpdfyaaqtttlpdgrvvlvgwmqmwersiptdelghgwagrmtlvrevywhrgrlaqrpvreleayrreevtgaatfegrhefsgvegqaldlevefrswkgqsvglsvfaseteetrltwepqsgwltldrsrsgvpiasrsathpdcqvyrarveapegvlslrlvldrsavevfaqngtttlsatvyprptsarvaflseggttevvcrawplalv
2. 根据权利要求1所述的编码蔗糖酶的基因，其特征在于所述的编码蔗糖酶的基因是将糖厂废水污染的上壤中提取微生物分离后，通过构建DNA文库和文库克隆的酶活性平板检 测筛选法，得到新的编码蔗糖酶的基因。
3. 根据权利要求1所述的编码蔗糖酶的基因，其特征在于其功能等同变异体的核苷酸序列的有突变形式，突变形式包括缺失、无义、插入、错义。
4. 如权利要求1所述的编码蔗糖酶基因的表达载体及宿主细胞，其特征在于所述的蔗糖酶基因的表达载体，及用于转化本发明基闲的宿主，含有基因所述表达载体转化的原核细 胞或真核细胞。
5.如权利要求1所述的编码蔗糖酶基因的采集以及测定的方法，包括以下歩骤(l)微 生物总DNA的提取；(2)构建微生物宏基因组文库；(3)蔗糖酶基因序列的测定；(4)蔗糖 酶基因的核苷酸序列分析；(5)蔗糖酶基因编码的产物氨基酸序列分析；(6)蔗糖酶基因/m，GI 的克隆和表达；(7)蔗糖酶酶活的测定。
6.权利要求1所述的蛋白质在蔗糖降解和对含蔗糖材料的处理中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种编码糖基水解酶家族32的蔗糖酶的基因及其应用，其特征在于含有SEQID NO1的核苷酸序列或其功能等同变异体。本发明含涉及该基因或其功能等同变异体编码的蔗糖酶(SEQ ID NO2)及该酶在降解蔗糖中的应用。
文档编号C12N9/24GK101407820SQ20081007381
公开日2009年4月15日 申请日期2008年9月26日 优先权日2008年9月26日
发明者朱绮霞, 杜丽琴, 王青艳, 罗兆飞, 韦宇拓, 黄志民, 黄日波 申请人:广西大学