专利名称：一种穿梭质粒及其衍生质粒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种穿梭质粒及其衍生质粒。
技术背景质粒是染色体外遗传因子，能够进行自主复制。它并不是寄主细胞生命活动必 需的遗传元件，但是能给予宿主细胞某些特殊的性质，例如抗药性，降解或利用某 些化合物等。在分子生物学研究中，质粒可以作为载体用于克隆外源基因。关于质 粒的研究已经相当深入，人们一方面不断从自然界发现新质粒，另一方面也不断在 已有质粒的基础上构建衍生质粒，作为基因工程的载体。在细菌基因工程领域，绝大部分质粒载体来自革兰氏阴性菌大肠杆菌，许多已经商品化。对革兰氏阳性菌谷氨酸棒杆菌质粒的研究开始的较晚。1984年，先后报 告了谷氨酸棒杆菌质粒pBLl、 pCGl、 pCG2和pCG4等。(Santamaria. R. et al 1984 丄Gen. Microbiol. 130. 2237-2246.Ozaki. A et al 1984 Mol. Gen. Genet 196. 175-178 Kats咖ata. R. et al 1984 J. Bacteriol. 159.306-311)目前已经从各 种棒杆菌中分离出24种内源质粒。这24种内源质粒中大部分小质粒是隐蔽型的， 仅质粒pXZ10145是个例外，该质粒带有一个氯霉素抗性基因。(沈天翔等1993生 物工程学报9. 216-222)而在较大的质粒中，也只有pAGl、 pCG4和pTET3编码抗 生素抗性基因。根据谷氨酸棒杆菌可能的复制方式和复制起始蛋白之间的相似性， 可以把它们分为两组。 一组是采取滚环方式复制，包括pBLl族质粒和pCGl族质粒； 另一组采取e复制方式复制，包括pXZ10145族质粒和pCRY4族质粒。 一般来说， 采取e复制方式复制的质粒较采取滚环复制的质粒具有较高的稳定性。在谷氨酸棒 杆菌基因工程研究中，已构建的克隆载体大部分源于隐蔽型质粒pBLl (Miwa. K et al 1985 Gene 39. 281-286; Yeh. P et al 1986 Gene 47 301-306; Santamari. R. I. 1987 Gene 56 199-208; Patek. M. 1989 Appl. Microbiol. Biotechnol. 31. 65-69; Nesvera, J. et al 1990 Folia Microbiol. 35.273-277; Mukherjee. K. J. et al 1990. J. Biotechnol. 16. 109-122; Eikmanns. B. J. et al 1991 Gene 102. 93-98;Tauch. A. et al 1998a Arch. Microbiol. 169. 303-312; ); pCGl (Miwa. K. et al 1985 Gene 39.281—286; Yoshihama. M. et al 1985, J. Bacteriol.162. 591—597;); pCG2( Ozaki. A et al 1984. Mol. Gen. Genet 196. 175—178; Ikeda. M. and Kats咖ata. R. 1999. Appl. Environ. Microbial. 65.2497-2502;) 禾卩.pCG4 (Ikeda. M. and Katsumata. R. 1999. Appl. Environ. Microbial. 65.2497-2502;)。卡那霉素、博来霉素、氯霉素和红霉素的抗性基因的启动子均能 被棒杆菌的DNA聚合酶识别，已经被广泛地用于载体构建。另一方面，由于大肠杆 菌的基因操作系统已经比较成熟，目前在谷氨酸棒杆菌基因工程研究中使用的绝大 多数克隆载体都是在大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌之间均能复制的穿梭载体，并且带有 多克隆位点。但目前鲜有从具有e复制机制的谷氨酸棒杆菌质粒出发构建克隆载体 的报道。 发明内容本发明的目的是提供一种穿梭质粒及其衍生质粒。本发明所提供的一种穿梭质粒，名称为pAK6,它的核苷酸序列是序列表中的序 列1。pAK6是能够在谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌中复制的穿梭质粒载体。 其中，pAK6包括一个如下顺序排列的多克隆位点5"acl-fcoRI-勘7II-ffi/7rf111-尸WI-Z&I-SpM;所述多克隆位点的核苷酸序列是序列表中序列1自5' 末端第14-48位脱氧核糖核苷酸所示。除所述多克隆位点外，pAK6还包括一个氨 苄青霉素抗性基因及其启动子和一个卡那霉素抗性基因及其启动子；所述氨苄青霉 素抗性基因及其启动子的核苷酸序列是序列表中序列1自5'末端第2085-1227位 脱氧核糖核苷酸所示；所述卡那霉素抗性基因及其启动子的核苷酸序列是序列表中 序列1自5'末端第4872-5664位脱氧核糖核苷酸所示。本发明还提供了由pAK6衍生的穿梭质粒pAKC6，该穿梭质粒可作为启动子检测 载体。本发明所提供的pAKC6，是将pAK6的卡那霉素抗性基因及其启动子片段，即序 列表中序列1自5'末端第4872-5664位脱氧核糖核苷酸序列进行倒位后，在其多 克隆位点插入报告基因和谷氨酸棒杆菌LeuB基因的转录终止子得到的；所述报告 基因的方向与所述卡那霉素抗性基因及其启动子方向相反；所述谷氨酸棒杆菌LeuB 基因的转录终止子位于所述报告基因与所述卡那霉素抗性基因之间。其中，所述报告基因可以是氯霉素乙酰转移酶基因；所述氯霉素乙酰转移酶基 因的核苷酸序列是序列表中序列2自5'末端第50-827位脱氧核糖核苷酸所示。所述LeuB基因的转录终止子的核苷酸序列是序列表中序列2自5'末端第6-37位脱 氧核糖核苷酸所示。质粒pAKC6的核苷酸序列具体可为序列表中的序列2。本发明所述的质粒pAK6和pAKC6可在基因工程中应用。质粒稳定性实验结果表明，本发明构建的质粒pAK6和pAKC6在没有选择压力 的情况下，连续培养100代，质粒pAK6保持率为100%，质粒pAKC6保持率为98. 5% 以上，与滚环复制型质粒pUL340的保持率(28%以下)相比明显高于滚环复制型质 粒；质粒复制中间体的电镜检测实验表明质粒pAK6和pAKC6以8型复制；质粒稳 定性实验和质粒复制中间体的电镜检测实验结果综合表明质粒pAK6和pAKC6的稳 定性高，在基因工程上将得到广泛的应用。
图l为质粒pAK6的物理图谱。图2为质粒pAKC6的物理图谱。图3为质粒pAK6的构建图。图4为质粒pAK6的酶切电泳分析M: DNAmarker、入/￡c。RT 141、 1: v5b。R I 、 2:拳I 、 3:份211、 4:历72dl11、 5:尸Wl 、 6:H 、 7:&力I 。图5为PCR扩增氯霉素乙酰转移酶基因基因M: DNA marker为A/EcoT14I、 1: PCR扩增氯霉素乙酰转移酶基因产物。 图6为PCR扩增卡那霉素抗性基因M: DNA marker为A/EcoT14I、 1: PCR扩增卡那霉素抗性基因产物。图7为质粒pAKC6的构建图。图8为质粒pAKB6和pAKC6的酶切电泳分析结果。M: DNA marker为入/EcoT141、 1: pAKB6/ Afcol、 2: pAKC6/ Afcol图9为质粒pAKC6的酶切电泳分析结果。M: DNA marker、人/EcoRT 141、 1:^a/dll—、 2:#i77din—IZ aI。图10为pUL340/13032稳定性实验结果图11为pAK6/13032稳定性实验图12为pAKC6/13032稳定性实验图13为质粒pAK6复制中间体电镜照片图14为质粒pAKC6复制中间体电镜照片具体实施方式
实施例l、质粒pAK6的构建 质粒pAK6的构建过程如图3所示，具体方法如下以谷氨酸棒杆菌质粒pXZ10145 (沈天翔等1993生物工程学报9. 216-222) (中国科学院微生物研究所)为出发质粒，用&oRl/5^el双酶切质粒pXZ10145， 经琼脂糖凝胶电泳分离，回收带有复制起始点的大片段。用^boR I/J^ I双酶切大 肠杆菌质粒pUC119-KanR (Guoqing Niu et al 2006 Metabolic Engineering 8. 183-195)(中国科学院微生物研究所)，回收带有KanR基因的小片段。将两片段连 接，构建重组质粒。将重组质粒转化谷氨酸棒杆菌ATCC 13032，提取质粒，命名为 pAK0。为在pAKO上引入大肠杆菌复制起始点，用fcoRIM^II双酶切pAK0，回收带 有棒杆菌复制起始点和KanR基因的大片段；对大肠杆菌质粒pUC19进行同样的双酶 切，回收带有大肠杆菌质粒复制起始点的大片段，将两大片段连接，构建重组质粒。 将重组质粒转化大肠杆菌DH5 a ，提取重组质粒，得到具有谷氨酸棒杆菌质粒复制 起始点和大肠杆菌质粒复制起始点以及卡那霉素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因 的质粒，命名为pAK2。由于pAK2上多克隆位点区还有其它的五coRl 、 Kp" I 、 SflmHl酶切位点，不利于克隆外源片段，所以重新设计了多克隆位点区，特别是 引入了v^7II单切位点，方便经5"sw3AI完全消化的片段的克隆。通过以下方法得到 多克隆位点区设计两个寡核苷酸序列，分别为S1和S2， S1和S2的序列如下 5' —AGCTGCATGCTCTA GACTGCAGAAGCTT AGAT CTG—3'禾口5' -AATTCAGATCTAAGCTTCTGCAGTC TAGAGC AT G C-3'。将合成的S1和S2寡核苷酸 序列分别用无菌蒸馏水溶解使其浓度为50mmol/L，将二者混合，在6(TC-9(TC保持 5-60分钟，降温，得到带有多克隆位点区(MCS)的核苷酸片段，该片段具有 5g/II,历"din ，尸W I I I单一酶切位点，两端分别为fcoR I的粘末端和与 ^//7din互补的突出端。用AV7din/fc0R I双酶切pAK2，回收大片段，与带有多克隆 位点区的核苷酸片段连接，构建重组质粒，该重组质粒转化大肠杆菌DH5 a ，提取 重组质粒，命名为pAK6。该质粒具有按下列顺序排列的多克隆位点区 《。/7l-feci-fcoRI-A^II- ffi"oTI1-尸WI-易al- &力1。将pAK6电击转化谷氨酸棒 杆菌ATCC 13032，提取pAK6质粒，再转化大肠杆菌DH5 a ，提取pAK6质粒，进行酶 切电泳验证，结果与转入的质粒相符，说明质粒pAK6可在大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌 之间穿梭。分别用fcoRI、勤"I、勘_/11、历72dlH、尸WI、 J&I和S。力I酶切质粒pAK6，各酶在其上分别只有一个酶切位点，结果如图4所示，与预期相符。测序结果表明，质粒pAK6的大小为5684bp，其核苷酸序列如序列表中的序列l所示。在 目前已报道的穿梭载体中质粒pAK6属较小的一种。利用其带有的克隆位点，pAK6可 以很方便地改造成整合载体，表达载体，启动子探测载体等。 实施例2、质粒pAKC6的构建质粒pAKC6的构建过程如图7所示，具体方法如下为构建启动子探测载体，在质粒pAK6上引入报告基因氯霉素乙酰转移酶基因CAT和谷氨酸棒杆菌LeuB基因的转录终止子TleuB。首先通过PCR方法从质粒pXC9犯 (Kirchner 0 and Tauch A 2003 J. Biotechnology 104:287-299)(中国科学院微生物研究所)扩增氯霉素乙酰转移酶基因(GenBank No.AT219685)的编码区和SD序列。所用引物为PI: 5' -GGGAAGCTTAAGTAATTAACAGGAGCTAAGGAAGCTAAA-禾口P2: 5' -AACTCTAGATAAGGGATTTTGGTCATGCG-3'，下划线部分分别为沿'/^III和屈al的识别位点。反应体系为总体积50nL， 2XGC bufferll 25叱、dNTP 7叱、fa( DNA聚 合酶0. 5叱、50i!mol/L引物各l叱、DNA模板l叱、ddH20 15叱。PCR反应条件首先94。C 2min;然后94°C 30s、 55°C 45s、 72°C lmin、 30 cycles;再72"C 5min。
PCR扩增CAT基因产物的电泳结果如图5所示。然后，根据文献(M. Patek. et al 1998 Appl. Microbiol. Biotechnol. 50. 42-47)设计寡核苷酸序列S3和S4， S3和S4序列如下5-AATTCAAAGTAAACCCCTCGCC ATAAAA GGCGAGGGGTAC-3'禾口5' -CCCTCG CCTTTTATGGCGA GG GGTTTACTTTG-3';将合成的S3和S4寡核苷酸片段配制成 50mmol/L溶液，将二者混合，在6(TC-9(TC保持5-60分钟，降温，得到两端分别为 化oR I和^m I的粘末端的片段，即谷氨酸棒杆菌Zw^基因终止子序列。将质粒pAK6用^c^ I/7T/Ml进行双酶切，回收大片段，与谷氨酸棒杆菌丄e^基 因终止子T^B连接，构建重组质粒转化大肠杆菌DH5 a ，重组质粒命名为pAKT6。进 一步将pAKT6用历/7dlI/Jtel进行双酶切，回收大片段；用同样的酶双切氯霉素乙 酰转移酶基因(CAT)，将两片段连接，构建重组质粒转化大肠杆菌DH5 a ，提取重 组质粒，命名为pAKB6。由于pAKB6上的KanR基因启动子较强，且本身没有终止子序 列，因而有可能会通读过终止子T,，B。为避免此现象，采用PCR技术使KanR基因两侧的勤/2l和^ayrfn位点互换。方法如下根据质粒pUC119-KanR (GuoqingNiu et al 2006 Metabolic Engineering 8.183-195)(中国科学院微生物研究所)的序列设计一对 引物P3和P4，引物P3和P4的序列如下5' -TAGAGGTACCCCTGGATACCGCTCG-3'禾口 5' -GCTCGGATCC CGAACCCCAGAGTCC-3'，下划线部分为if/m I和As朋yi识别位点， 使KanR基因两侧原来的泡W I 、勤/21位点定点突变为I 、 fe;zWI ，以改变KanR 基因在pAKB6中的插入方向。以质粒pUCl 19-KanR (GuoqingNiu et al 2006 Metabolic Engineering 8. 183-195)(中国科学院微生物研究所)为模板，以引物P3/P4进行PCR 扩增。反应体系为总体积50fiL， 2XGC bufferll 25叱、dNTP 7叱、L4 7^<7 DNA 聚合酶0.5叱、50firaol/L引物各lli、 DNA模板l叱、ddH20 15叱。PCR反应条件:先94。C 2min;再94°C 30s、 55°C 45s、 72。C lmin、 30 cycles; 最后72°C 5min。 PCR扩增KanR基因产物的电泳结果如图6所示。必/2l/^3/sHI双酶切PCR扩增KanR基因的产物，回收KanR基因片段。A^I/^MH 双酶质粒pAKB6，回收pAKB6大片段。将KanR基因片段和pAKB6大片段连接，构建 重组质粒，转化大肠杆菌DH5a ，提取重组质粒，用TfcoI、 ^3』1Af/OTl及 历V7oTIlAK^I进行酶切鉴定，结果与预期相符。结果如图8和图9所示。该质粒命 名为pAKC6。 pAKC6上的KanR基因转录方向与CAT转录方向相反，不会引起通读。 将pAKC6电击转化谷氨酸棒杆菌ATCC 13032，提取pAKC6质粒，再转化大肠杆菌 DH5 a ，提取pAKC6质粒，经#cat、及mHI/J;mI及^z'/ rfin/J/^1酶切电泳分析， 结果与转入的质粒相符。说明pAKC6可以在谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌之间穿梭。测序结果表明，质粒pAKC6的大小为6474bp，具有表中序列2所示序列。质粒 pAKC6以CAT为报告基因，可以作为穿梭载体用来筛选启动子和测定启动子的强度。实施例3、质粒pAK6和pAKC6采用e方式复制1.质粒pAK6和pAKC6的稳定性实验质粒pUL340为滚环复制型质粒，以质粒pUL340为对照，测定质粒pAK6和pAKC6 的稳定性。方法如下1)以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032作为质粒pUL340 (Ramon I. Santamaria et al 1985 J. Bacteriology Vol.162 No. 1. p. 463-467)(中国科学院微生物研究所)、 pAK6和pAKC6的宿主。将pUL340、 pAK6和pAKC6分别导入谷氨酸棒杆菌ATCC 13032中，得到含有 pUL340的重组菌pUL340/13032、含有pAK6的重组菌pAK6/13032和含有pAKC6的重组菌pAKC6/13032。将pUL340/13032、 p雄/13032和pAKC6 /13032的单菌落分别接种于含有50y g/ml卡那霉素的LB培养基中3(TC培养至对数期，用质量百分比为0. 85%的生理盐水按照10倍梯度稀释到一定的倍数后，取50 w 1涂在不含有卡那霉素的LB平板上，3(TC培养计数单菌落数用以计算代时。代时可由下述公式计算得到G=" 3.3xlg^G为代时，x为时间t。时的菌数，y为时间L时的菌数。结果表明3(TC培养条件下，谷氮酸棒杆菌pUL340/13032代时为62分钟；谷氨 酸棒杆菌pAK6/13032代时为83分钟；谷氨酸棒杆菌pAKC6 /13032代时为83分钟。2)以l: 60的体积比将105-106的稀释液转接到不含有卡那霉素的31111 LB摇 管中3CTC培养，24小时后稀释，重复步骤1的涂板与转接直至培养大约100代。其中，代数按照如下方法测定lg_y —lgx 1g2其中n为代数，x为时间t。时的菌数，y为时间ti时的菌数。3 )取200个步骤2中不含有Kan的LB平板上的单菌落分别点种在含有50 u g/ml Kan和不含有Kan的LB平板上，无抗生素选择条件下质粒的保持率=含有50 u g/ml Kan的LB平板上的存活菌数/不含有Kan的LB平板上的存活菌数。在没有选择压力 的条件下，连续培养100代，质粒pUL340的保持率为28。z&以下；质粒pAK6的保持 率为100%;质粒pAKC6的保持率为98. 5%以上。表明质粒pAK6、 pAKC6稳定性优于质粒pUL340，质粒pAK6、 pAKC6符合9复 制型质粒比滚环复制型质粒(质粒pUL340)稳定的规律。2.质粒复制中间体的电镜检测为了观察pAK6、 pAKC6的复制方式，将pAK6、 pAKC6导入谷氨酸棒杆菌ATCC 13032中得到含有pAK6的重组菌pAK6/ATCC 13032和含有pAKC6的重组菌 pAKC6/ATCC 13032。将重组菌pAK6/ATCC 13032和pAKC6/ ATCC 13032分别接种于 含有50yg/ml卡那霉素的LB培养基中，培养至对数生长期。按照下述文献中的温 和方法提取质粒pAK6和pAKC6: Mojica F.丄M. et al 1994 J. Bacteriology vol. 176. No. 16. p. 4966-4973。将提取质粒pAK6和pAKC6分别溶于 TE(10raMTris-HC1 pH8. 0 lmMEDTA)溶液中，终浓度为10ng/ral。按照下述文献使用电镜观察质粒pAK6、 pAKC6: BurkardtH， Lurz R. (1984) Electron microscopy. In Pilhler A & Timmis認.(eds)， JoV朋ceo^a/eci/Jar ge"e"C51. Springer-Verlag Press, Berlin, Heidelberg, New York and Tokyo, Chap. 6， pp.286—288。 具体方法如下所用试剂包括，上相2n 1碳酸盐缓冲液(400n 1 ddH20、 40u 1 Na2C03(lM) 20u 1 EDTA(02M)) 、 5nl甲酰胺、lul细胞色素C (lmg/ml) 、 2pl质粒DNA(10 Pg/ral)， pH10.5。上相现配现用，用时放在冰上。下相双蒸水。步骤如下1、 取一洁净的培养皿，倒入足量的双蒸水(凸出一明显凸面为宜)，然后用 洁净的PVC轻轻从培养皿一端刮到另一端，作为下相；2、 轻轻放入一洁净载玻片， 一端靠在PVC上， 一端浸入到下相的液面以下；3、 在下相表面喷一层滑石粉；4、 将5-20 ii 1上相滴在步骤2的载玻片上，使上相缓缓流下形成单分子层， 静置3-5分钟；5、 用载有火棉胶的铜网蘸取单分子层，将铜网在100%的酒精中浸20秒(2次)， 然后在滤纸上自然干燥；6、 铜网放入真空镀膜机中，用铂铱合金喷涂，投影角为70，旋转台转速为90 转/分；透射电镜Hitachi H-700A观察。结果如图13、 14所示，表明图13和图14分别为质粒pAK6和pAKC6复制中间体的 电镜照片，可以看到复制中间体中存在复制泡，说明质粒pAK6和pAKC6复制方式为e型。实施例4、用pAKC6筛选谷氨酸棒杆菌启动子将经5"sw3A I完全消化的谷氨酸棒杆菌10147 (李开等2007微生物学报 47(2) :191-196)(中国科学院微生物研究所)基因组DNA片段，与用5^II酶切的 pAKC6连接获得重组质粒，将重组质粒转化大肠杆菌DH5 a ，获得20个转化子；将转 化子点种于含400ug/mL氯霉素的LB平板，有5个可以生长；提取重组质粒，分别电 击转化谷氨酸棒杆菌10147感受态细胞，转化后的细胞涂布在含25u g/ml卡那霉素 的LB平板上，再把生长出的转化子点种于含30yg/mL氯霉素的LB平板，得到一个阳 性克隆，将该阳性克隆中的质粒命名为pAKC6-F19。 pAKC6转化的谷氨酸棒杆菌10147 作为对照。由于启动子的强弱决定了报告基因的表达量，所以通过测定报告基因的比活 力，可以推断启动子的强度。分别测定含质粒pAKC6谷氨酸棒杆菌和含质粒 pAKC6-F19谷氨酸棒杆菌的总蛋白和CA頂每活，CAT酶活测定方法如下1. OmL反应体 系含100mmol/L Tris-HCL(PH7. 8), 0. lmmol/L乙酰辅酶A ， 4mg/mL 5， 5-二硫二 硝基苯甲酸(DTNB)，适量的粗酶液；将反应混合物在水浴中加热到37t:，加入氯 霉素使为终浓度0.1minol/L，混匀，立即测定光吸收值」化；以未加氯霉素的反应液 为对照。CAT活性单位的定义 一个活力单位(U)为在上述反应条件下，每分钟乙酰化 lmol氯霉素所需酶量。结果表明，带有pAKC6的谷氨酸棒杆菌可少量的表达CAT， CAT酶比活力为 0.21U/mg，而带有pAKC6-F19的菌株的CAT酶比活力为25. 15U/mg，是前者的120倍， 说明F19片段具有启动子功能，启动子探测载体pAKC6可用于筛选具有启动子功能的 片段。进一步对该启动子片段进行测序，F19片段的长度为632bp。经BLASTN比对，表 明F19与谷氨酸棒杆菌R株的Strain-specific DNA island 9有99%的同源性。使用 BDGP Neural Network Promoter Prediction V2. 2对F19进行分析，发现一段得分 为0. 97的启动子，该启动子潜在的-10区(TGGGGT)和-35区(TTTACT)与标准的-10区 和-35区的相似性较低，但是二者的间隔为标准的18bp,而且该-10区(TGGGGT)与已 经报道的谷氨酸棒杆菌启动子P34的-10区(TGGGGT)完全一致，表明它应该能为谷氨 酸棒杆菌RNA聚合酶识别。该F19片段的启动子区序列如表4所示。表4.启动子的序列片段 分数 _ 启动子序l!J__一致性 TTGACA TATAAT—35 _10序列表< 110〉中国科学院微生物研究所〈120〉一种穿梭质粒及其衍生质粒<130> CGGNARW81156<160〉2<210〉1 〈211〉5684 <212〉DNA <213>人工序列〈220〉 〈223〉<400>1ggt獄g3gCtcgaattcagatctaagcttctgcagtctagagcatgcagcttggcgtaa60tcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattcc120CggLgCCgg^LgcataaagtgtaaagcctggggtgCCt33tgagtgagctaactcacatta180attgcgttgcgctcactgcccgctttccagtCggg333CCtgtcgtgccagctgcattaa240tg犯tcggcc犯cgcgcgggg卿ggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcg300■ctcactgactcgctgcgcixggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaag360gcggtaatacggttatccac卿atcaggggat犯cgcsggaa3g犯catgtgagcaaaa420ggccagc犯accgt朋aaaggccgcgttgctggcgtttnccataggctc480cgc.ccccctgacgagcatcacgctxaagtcagaggtggcg540gataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccg600accctgccgcttaccgg3t3cctgtccgcctttctcccttcggg鄉cgtggcgctttct660catagctcactctcagttcggtgtagg化gttcgctccaagctgggctgt720gtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgag780tccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagc840卿gcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctac900cagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaaga960gttggtagctcttgatccggaccgctggtagcggtggtttttttgtttgc1020aagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacg1080gggtctgacgctc已gtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcat1140tcacctagatccttttaaatgtttt犯atc1200aaacttggtctgacagttaccaMgcttaBtcagtgaggcacctatctca1260gcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacg1320atacggg鄉gcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctca1380ccggctccagaat￡L￡L￡LCC3gccagccggaagggccgagcgc卿agtggt1440cctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagc1500agttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtca1560cgctcgtcgtUggtstggcttcattcagctccggttcccaacgatcaag1620tgatcccccatgttgtgcaaa已aagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcaga1680agt卿ttggccgcagtgtt已tcactcatggttatggcagcactgcataattctcttact1740gtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtg观tact 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atcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcg647权利要求
1、一种穿梭质粒，它的核苷酸序列是序列表中序列1所示。
2、 根据权利要求1所述的质粒，其特征在于所述序列表中序列1的自5'末端第4872-5664位脱氧核糖核苷酸为卡那霉素抗性基因及其启动子。
3、 一种穿梭质粒，是将序列表中序列1的自5'末端第4872-5664位的卡那霉素 抗性基因及其启动子进行倒位后，在其多克隆位点插入报告基因和谷氨酸棒杆菌LeuB 基因的转录终止子得到的；所述报告基因的方向与所述卡那霉素抗性基因及其启动子 方向相反；所述谷氨酸棒杆菌LeuB基因的转录终止子位于所述报告基因与所述卡那 霉素抗性基因之间。
4、根据权利要求3所述的质粒，其特征在于所述报告基因为氯霉素乙酰转移 酶基因；所述氯霉素乙酰转移酶基因的核苷酸序列是序列表中序列2自5'末端第 50-827位脱氧核糖核苷酸所示。
5、 根据权利要求3或4所述的质粒，其特征在于所述谷氨酸棒杆菌LeuB基因 的转录终止子的核苷酸序列是序列表中序列2自5'末端第6-37位脱氧核糖核苷酸所 示。
6、 根据权利要求5所述的质粒，其特征在于所述质粒的核苷酸序列是序列表中的序列2。
7、 权利要求1-6任一所述质粒在基因工程中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种穿梭质粒及其衍生质粒。本发明所提供的穿梭质粒的核苷酸序列是序列表中的序列1；序列表中序列1的自5′末端第4872-5664位脱氧核糖核苷酸为卡那霉素抗性基因及其启动子。本发明还公开了该穿梭质粒的衍生质粒，它是将序列表中序列1的自5′末端第4872-5664位的卡那霉素抗性基因及其启动子进行倒位后，在其多克隆位点插入报告基因和谷氨酸棒杆菌LeuB基因的转录终止子得到的；所述报告基因的方向与所述卡那霉素抗性基因及其启动子方向相反；所述谷氨酸棒杆菌LeuB基因的转录终止子位于所述报告基因与所述卡那霉素抗性基因之间。这两种质粒的稳定性高，在基因工程上将得到广泛的应用。
文档编号C12N15/77GK101250548SQ20081008448
公开日2008年8月27日 申请日期2008年3月25日 优先权日2007年3月30日
发明者丁久元, 刘桂明, 张英姿, 开 李, 宇 王, 智 赵 申请人:中国科学院微生物研究所