微流体温度驱动的阀的制作方法

专利名称：微流体温度驱动的阀的制作方法
技术领域：
本发明的主题是一种利用核酸扩增分析液体样品的仪器中使用的 微流体器件、 一种利用核酸扩增分析液体样品的仪器、 一种分析液体样 品的方法以及 一 种扩增液体中的核酸的方法。
背景技术：
本发明对保健，以及生物学和医学科学研究领域特别有用，尤其在 核酸分析、基因定量和基因分型，这类需要对所含组分实施可靠样品分 析的领域。扩增核酸用的方法和器件是技术上熟知的。
一种利用包括变性和扩增步骤的反应循环的方法是聚合酶链反应
(PCR)。该技术给核酸处理带来革命性变化，特别是核酸分析，因为它 提供一种将特定序列的核酸的数量由微不足道增加到可检测数量的工 具。PCR描述在，例如，EP 0201184和EP 0200362中。 一种利用加热 和冷却某一延长的金属块以控制方式对管子中的样品实施热循环的仪 器公开在例如EP 0236069中。
最近，已研发出改进和更强大的PCR技术。定量实时PCR是一种 用于同时定量和扩增给定DNA分子特定部分的实验室技术。它被用来 确定某一特定序列是否存在于样品中以及，如果存在，可对样品中复制 的份数进行定量。2种常用定量方法是采用嵌入了双链DNA的荧光染料 以及，当与互补DNA杂交时，发荧光的改性DNA低聚核苷探针。此类 方法描述在，例如，EP 0512334中。
通常，聚合酶链反应在特殊反应容器中实施。为提供鲁棒、可靠和 高度准确的核酸扩增结果，重要的是避免反应区的污染。PCR能使单个 分子扩增十亿倍。因此，哪怕很少量污染物也可能被扩增并导致假阳性
结果。此种污染物常常是来自以前的PCR扩增的产物，被称作带入的污 染。除了预防反应区灌注期间带入的污染之外，特别重要的是，在反应 进行期间将反应区密封，以防止污染物。这在1个以上反应区使用共同 的流体通道同时灌注的场合特别难以办到。此类场合常常采用带有多个 反应区的小型化器件以达到较高处理量，具有减小的反应体积，这导致对减少污染危险的技术要求的进一步提高。
微流体学是设计、制造和制定与"纳-或皮升"范围流体体积打交道的 器件和方法的科学。微流体硬件要求不同于宏观尺度硬件的构造和式 样。通常不可能将传统器件按比例缩小，然后预期它们在微流体场合同 样能行，因为系统行为有了巨大改变。毛细管作用改变了流体通过微尺 度-直径管子的规律，它将与宏观尺度通道截然不同。另外，涉及到诸多 未知因素，尤其涉及微尺度热量传递和质量传递。微流体体系在保健， 例如，血细胞分离、生化化验、化学合成、基因分析、药物筛选和电色
谱法等方面具有多种多样和广泛潜在的应用。
为解决污染问题，已研发出减少当进行反应时的交叉污染危险的、 允许将液体样品灌注并维持在反应区中及其以外的特定微流体阀。这 里，该阀将每个反应腔逐一气密密封。这一点很重要，特别是在对1或 多个样品就几个截然不同的参数接受试验的阵列格式中。由于交叉反应 可能导致假阳性结果，故主要的任务是避免此类交叉反应。于是，在许 多领域，阀被应用在阵列器件中以防止反应腔特定试剂的带入。
技术上已知有几种类型阀，其中两种主要类型可能是著名的，通常
被称作一次性关闭阀(once-close valve)和启/闭阀(ON/OFF valve)。 一次性 关闭阀在基态(ground state)处于敞开并可能关闭仅仅一次。关闭后，该 阀将可能被被再打开。启/闭型阀可打开和关闭数次，通常借助外部执行 机构。
US 20050072946公开一种采用多层软光刻(lithography)的拔i流体 阀。此种阀的特征在于其恒定厚度的弹性体膜部分，从而允许该膜沿其
整个宽度对外加压力产生相近的反抗力。此种用可挠曲膜制造的启/闭阀 可具有极低致动压力，因此可用于实现主动(active)功能，例如，在集成 微流体芯片中的泵和混合机。然而，此类带有一体化软膜的器件是采用 双组分生产技术制造的。第一组分一般是较硬聚合物材料，例如，聚丙 烯(PP)或聚甲基丙烯酸曱酯(PMMA),而第二组分是软材料，例如，热 塑性弹性体(TPE)。那些双组分技术是复杂且成本高的，况且生产1个 器件的时间，与单组分技术相比，大大增加。另外，该弹性体阀必须是 三维构成的。该器件不得不建造在几层上，每层具有特定功能(例如，流 体层、开关层等)。用于阀的致动层在几何上位于流体层上方。这样的多 层工艺进一步增加了商品的成本和器件的复杂性。利用Peltier(珀耳帖)-致动的微型阀(Richard P. Welle和Brian S. Hardy,第24届热电学国际会议(24th International Conference on Thermoelectrics (ICT))， 2005， pp. 343-346)抑制流体排出物进出反应区的 阀在技术上是公知的。Peltier元件放在靠近流体通道网或流体通道网下 方。通过利用Peltier元件冷却进出反应腔的通道中的流体使流体冻结， 从而导致通道内形成水塞。该冰塞堵住通道，于是扩散受阻。当把Peltier 元件关掉时，冰塞融化，于是通道重新打开。这样一来，液体就可流过 通道，同时扩散可再次发生了。此类型阀也划归启/闭阀一类，因为可能 要实施几个冻融循环。然而，此种Peltier-致动的阀具有许多缺点。每个 阀在非常靠近的部位就需要1个Peltier元件。该Peltier元件是尺寸有 限的，因此，该阀不能用于具有高度密集反应腔和通道的微流体器件。 另外，每个Peltier元件必须能电子存取和调节，从而要求容纳布线和复 杂控制器的空间。不仅如此，此种阀也不能用于热循环领域，因为在关 闭状态，通道中的液体被冻结在非常靠近反应腔的部位，而这里却进行 着50 90。C之间温度的热循环。阀与反应腔之间的温度梯度势必既影响 冻结也影响加热过程，而这两个过程都需要较多能量。这种作用将限制 快速热循环的速度和效率。再者，冷冻也导致液体体积的改变，从而在 器件及其材料中感应出应力。
利用毛细管与所述毛细管进入反应区的开口之间润湿度差异的、基 于毛细管的被动阀被称作毛细管驱动的截止阀或毛细管破裂阀，其描述 在Duffy等人的《分析化学》(Analytical Chemistry, 1999， 71， 4669 ~ 4678) 中。此种被动阀基于润湿能。将弯月面从细毛细管推入到较大腔内所需 要的力被用作阀。该压力——被定义为单位面积的力——通常明显低于 1.4 bar,其是热循环期间被关闭的PCR反应腔中产生的压力。因此，被 动阀不足以强到耐受PCR反应的加热所产生的压力。该压力导致较大的 腔#/润湿，因此该阀将在应该关闭时却开启。
总之，所有上面所描述的这些阀都具有共同缺点它们不过是部分 地适应微流体用途要求的宏观阀的小型化而已，因此，不能满足微流体 用途的全部需要和要求。这样的阀的共同之处在于，需要外致动，例如， 电流、气压或温度。然而，超结构零件，例如，供应外致动作用所需要 的管道和接线通常都非常占据空间并且是成本密集型。特别是对于集成 芯片领域来说，可供此类阀使用的空间仅仅是有限的。另外，尤其是在微流体芯片上的核酸分析中，携带阀致动的另一层的添加是不利的，因
为微流体芯片的热质量(thermal mass)应尽可能小以便提供快速和高效 的传热，特别是当实施扩增反应时。
另外，并非是宏观阀小型化的微流体概念也没有完全满足较高通量 的微流体领域的要求，特别是就成本而言。此种阀的例子是用于"芯片 上的实验室(Lab-on-a-Chip)"领域的自致动热响应水凝胶阀，正如在以下 中描述的JingWang等，Biomedical Microdevices 7:4， 313-322, 2005。此 种阀利用这样的事实聚合物N-异丙基丙烯酰胺表现出感温行为。该聚 合物材料由具有多孔结构的网络构成。孔隙的尺寸依赖于温度。当此种 材料被用来起阀的作用时，灌注在微流体网络腔内的材料随温度之不同 允许流体流动抑或阻止其流动。但是，带有水凝胶阀的器件制造起来既 复杂，成本又高，因为水凝胶必须经受就地聚合或不得不被结合到薄衬 (foil)中。水凝胶材料与工艺流体直接接触，并且由于其孔隙结构提供巨 大的每单位体积的表面。在大多数情况中，这是不利的，因为巨大的表 面为蛋白质、DNA或其他化学成分的吸附提供更多空间，因为那些物质 可能根据表面化学规律结合到表面。然而，那些物质乃是反应腔内需要 的，不应被水凝胶吸附。于是，化验/测试的表现就可能受到损害。
此外，另一些阀采用一种可膨胀微球，它具有包围着气体芯的软组 分壳(P. Griss, H. Andersson和G. Stemme, Lab Chip, 2002， 2: 117-120, "Expandable microspheres for the handling of liquids (处理液体用的可膨 胀微球)")。温度一旦升高，微球便膨胀，从而关闭通道。珠粒的壳在某 一提高的温度软化。壳软化后，被嚢封的气体可膨胀，于是微粒就胀大 到比其原来体积大几倍的大小。该膨胀是不可逆的并且当温度降低时微 球将不重又变小。因此，这种阀被归为一次性关闭阀。然而，此种包含 微球的器件的生产非常复杂，因为必须将微球结合并在恰当的位置存积 到微流体器件中。此种微球阀的制造很难，因为在制造器件期间温度不 得不维持在低于微球膨胀点的水平。
总之，技术上公知的阀或者是宏观阀为适应微流体应用所做的小型 化，因此，没有满足微流体领域的所有要求，因为需要外致动来关闭阀， 或者是微流体概念，这一概念的主要缺点在于必须采用复杂材料，从而 导致，当这些复杂材料表现出对以热或液体的处理不稳定时，生产过程 的错综复杂，从而导致微流体器件的高成本。因此，目前需要提供一种制造低成本微流体器件用的微流体阀，它不需要复杂外致动和复杂制造方法。

发明内容
本发明的第 一 个主题是一种利用核酸扩增分析液体样品用的仪器 中使用的微流体器件，它至少包括反应腔，后者具有适合给所述反应腔 灌注所述液体样品的进口通道，和适合从所述反应腔中排出流体的出 口，其中所述出口可在反应腔灌注所述液体样品后关闭，且其中所述进 口通道还包含至少一个包含死端分岔的微流体阀，所述死端分岔不具有 出口，它包含气体并且尺寸设计为，在至少所述死端分岔加热期间，至 少包含足以密封所迷进口通道的量的气体，此时所迷气体从所述死端分 岔膨胀到所迷进口通道中形成能可逆地密封所述进口通道的扩散屏障。
本发明的第二个主题是利用核酸扩增分析液体样品的仪器，其至少
包括
-本发明的微流体器件，
-监视核酸扩增反应的器件，以及
-至少覆盖所述微流体器件的所述至少 一个死端分盆的加热器件。
本发明的第三个主题是利用核酸扩增分析液体样品的方法，其至少 包括
-通过所述器件的进口通道向本发明微流体器件的反应腔内提供 液体样品，
-利用加热器件加热所述器件的至少死端分盆，借此，死端分盆 内的气体从所述死端分岔膨胀到所述进口通道中形成扩散屏障并从而 可逆地密封所述器件的进口通道，
-扩增所述液体样品中的核酸，以及
-监视扩增反应。
本发明的第四个主题是扩增液体样品中的核酸的方法，其至少包
括
-通过所迷器件的进口通道向本发明微流体器件的反应腔内提供 液体样品，
-利用加热器件加热所述器件的至少死端分岔，借此，死端分岔内的气体从所述死端分岔膨胀到所述进口通道中形成扩散屏障并从而 可逆地密封所述器件的进口通道，以及 -扩增所述液体样品中的核酸。
本发明的第五个主题是一种包含规定体积气体的死端分岔室形成 微流体阀用于关闭含液体的微流体通道的用途，其中，当加热至少所述 死端分岔室时，所迷气体从所述死端分盆室膨胀到所述通道中形成能可
逆地密封所述通道的扩散屏障，从而将所述液体分割为2部分并且关闭
所述通道。
附图简述
下面将通过实施例说明本发明优选实施方案，同时参考附图，其中 图l(A)显示微流体器件(l)，它包含主通道(15)和由主通道分出的几 条进口通道(12),每条进口通道通往反应腔(11)并具有含有气体的死端分 岔(14)， 一旦加热，所示气体可以密封进口通道。图l(B)详细展示了进 口通道(12)的具体实施案，它具有死端分岔(14),通往一个反应腔(ll), 后者具有出口通道(13)，它包含疏水改性的几何阀(16)，而图l(C)则详 细展示防止从反应腔(11 )外流的几何阀(16)。
图2显示本发明微流体温度驱动阀的某些实施方案，它具有进口通 道(12)和死端分岔(14),其中死端分岔与进口通道之间的夹角小于90°, 指向所迷反应腔灌注期间液体样品的流动方向(A)，或其中进口通道包 含2个死端分岔且其中死端分岔进入进口通道的开口基本上位于另 一个 的对面(B)。
图3显示本发明微流体温度驱动阀的功能。放大断面图显示了以下 情况下的通往反应腔(11)的进口通道(12)和灌注了气体(14)的死端分盆 当不存在液体时(A);当进口通道和反应腔灌注了液体时(B)，以及当 加热至少死端分岔从而导致气体膨胀，同时反应腔和进口通道灌注了液
体时(C)。
图4显示微流体器件的放大断面，特别显示出部分主通道(15)和通 往反应腔(11)的进口通道(12)的连接点。表示出进口通道(12)上的死端分 岔(14)的几种实施方案和安排。
图5显示微流体器件的放大断面，特别显示出部分主通道(15)和通 往反应腔(l l)的进口通道(12)的连接点。表示出进口 (12)和出口 (13)通道上的死端分岔(14)的几种范例实施方案和安排。
图6显示微流体器件的放大断面，特别显示出部分主通道(15)和通 往反应腔(11)的进口通道(12)的连接点。出口通道(13)还包含几何阀(16)。 表示出进口通道(12)上的死端分岔(14)的几种实施方案和安排。
图7显示微流体器件的放大断面，特别显示出部分主通道(15)和通 往反应腔(11)的进口通道(12)的连接点。出口通道(13)还包含几何阀(16)。 表示出进口(12)和出口(13)通道上的死端分岔(14)的几种范例实施方案 和安排。
图8显示具有几何阀(16)的死端分岔(14)的特定实施方案。
图9显示在出口通道(13)中包含几何阀(16)的实施方案中反应腔(11) 和收集通道(17)的灌注。


图10代表当在6个平行反应中分析一份人类HBV-阳性患者的血浆 样品时，循环数目对焚光的曲线图。
附图标记说明
I 微流体器件
II 反应腔
12 进口通道
13 出口通道
14 死端分岔
15 主通道
16 几何阀
17 收集通道
18 样品进入孔口
19 补偿体积
具体实施例方式
本发明涉及可应用在微流体器件或微流体芯片上的微流体温度驱 动阀。此种阀在微流体器件中的应用是优越的，因为它允许器件不是由 多层构成，并在一个-复合方法中制成，这既省钱又省时。此种微流体器 件或微流体芯片可用于分析液体样品的仪器中。这里所使用的术语"微 流体器件"描述一种器件，具有微结构化(micro-structured)的零件，例如 通道、通道网络或反应腔。微流体器件可以是仪器的一部分(多次使用)或者是一次性的(一次使用)。
在本发明的 一种实施方案中，用于利用核酸扩增分析液体样品的仪 器中的微流体器件至少包括反应腔，它具有适合给反应腔灌注液体样品 的进口通道，和适合从反应腔排出流体的出口 。出口可在反应腔灌注液 体样品后关闭，并且进口通道还包含至少一个死端分岔。死端分岔不具 有出口，包含气体。另外，死端分岔的尺寸被设计成，当至少分岔被加 热期间气体从分盆膨胀出来时，至少包含足以密封进口通道的量的气 体。当液体存在于进口通道中并对至少死端分岔加热时，气体将从死端 分岔室膨胀到进口通道中。从死端分岔延伸到进口通道中的气泡于是便 形成扩散屏障，将进口通道中存在的液体分割为分开的部分，从而密封 进口通道。死端分岔的尺寸被设计成，使延伸自从死端分岔的气泡是足 够大量的以致在发生反应的温度下完全密封进口通道。在优选的实施方 案中，气体从死端分岔到进口通道中的延伸达到这样的程度，以致气泡 与进口通道的壁发生物理接触从而使得完全密封。
反应腔是在微流体器件上分析物与反应试剂发生要求的反应的区 域。另外，在某些方面，反应腔也可以是，当监—见反应时，检测反应用
的部位。反应腔通过作为流体网络一部分的进口通道^L灌注以液体，该 液体就某些方面而言包含分析物。就某些方面而言，进口通道可在反应 腔灌注液体之后利用塞子或阀(例如，本发明微流体温度驱动阀)可逆或 不可逆地关闭，借助胶粘，热和/或机械力或具有高沸点的不可混溶液体 (例如，矿物油、蜡、卣代烃)，取决于进口通道的类型和器件的应用领 域的类型。
出口也是在反应腔灌注液体期间用作从流体网络和反应腔中被替 换的气体的排气装置的流体网络的一部分。出口可以是通道，通气孔或 渗透性或半渗透性膜，它们在某些方面可涂以疏水化合物或由疏水化合 物制成。在某些方面，出口可在反应腔灌注液体后，利用塞子或阀(例如， 本发明微流体温度驱动阀)利用胶粘、热和/或机械力或具有高沸腾温度 不可混溶液体(例如，矿物油、蜡、卣代烃)，取决于出口的类型和器件 应用领域的类型，可逆或不可逆地关闭。
微流体阀的主要特征之一是死端分岔，它也是流体网络的 一部分。 死端分岔灌注了气体(空气、无菌空气或惰性气体如氮气、氩气等)并从 通道中分岔出来。当微流体器件灌注液体时，死端分岔依然灌注了气体，因为死端分岔不具另外的出口。
死端分岔可具有多种几何形状；优选的是，与死端分岔的连接是窄 通道，比进口通道窄。在窄通道后面，坐落着气体体积，其至少大到足 以膨胀到通道内并把流体分割为2部分。这种较大的体积的形状可以是 圆形、矩形、三角形或任何其他有利于高存储密度或制造的形状。
在微流体器件的某些实施方案中，死端分岔基本上垂直于所迷进口 通道。在微流体器件的另一种实施方案中，死端分岔出口部分与进口通 道之间的夹角小于90。，沿反应腔灌注期间液体样品的流动方向。在此 种实施方案中，当对至少死端分岔加热时，气体朝反应腔膨胀。该实施 方案是有利的，因为反应腔灌注期间死端分岔中所含的气体被液体挤出 以及死端分岔中灌入液体的危险减少了 。
然而，在某些方面，死端分岔出口部分与进口通道之间的角度高于 90°，沿反应腔灌注期间液体样品流动方向，也可能有利。这里，当对 至少死端分盆加热时，气体将膨胀远离反应腔，从而防止气体意外地膨 胀到反应腔内。这对于器件具有高反应腔密度和/或相对于死端分岔中所 提供的气体量而言仅具有短进口通道的情况特别有用。
另外，如果采用包含死端分盆的微流体温度驱动阀来关闭出口通 道，则在某些方面可能有利的是，死端分岔基本上垂直于所述出口通道， 或者死端分岔出口部分与出口通道之间的角度小于90。，沿反应腔灌注 期间液体样品流动方向。这样的实施方案保证，当对至少死端分岔加热 时气体膨胀远离反应腔，并借此防止气体意外地膨胀到反应腔内。
一种范例实施方案表示在图2(A)中。在该实施方案中，死端分岔(14) 的出口部分的直径分别小于进口通道(12)和出口通道(13)的直径，以防止 不希望的死端分岔室被灌注。死端分忿(14)的出口部分与进口通道(12) 之间的角度为约130°,而死端分岔(14)的出口部分与出口通道(13)之间 的角度为约50°，沿反应腔灌注期间液体样品流动方向。这样的组件保 证，当对至少死端分岔(14)加热时，膨胀自2个死端分盆(14)的气体扩散 入相应的通道而远离反应腔(ll)。借此，反应腔(ll)的内容物便被密封， 同时不希望的气体膨胀到反应腔(11)内的情况也得以防止。
在微流体器件的某些实施方案中，进口通道的内壁，至少在死端分 岔与进口通道之间的连接处，被覆盖以疏水涂层。这样做之所以有利是 因为，膨胀后的气体在膨胀阶段期间及其以后得到稳定，因为基于能量的原因，空气将聚集在疏水表面。这样的行为最小化了空气从微流体阀 流向反应腔的危险——将导致阀功能的丧失。 一种疏水涂层是具有表现
出与作为试验流体的水之间大于90。接触角的低表面张力的涂层。例子 是聚四氟乙烯(Teflon)(PTFE)涂层、烃类或氟代烃、钛(titan)涂层、聚对 二甲笨(parylene)和硅烷化玻璃表面。
在某些实施方案中，微流体器件包括多个反应腔，以便允许在1个 器件上平行地分析1个以上液体样品。在某些方面，每条进口通道一端 连接一个反应腔，而另一端连接主通道。主通道对于样品的分配，以及 给多个反应腔每一 个灌注所述液体样品是有用的。这使得若干反应腔在 基本上同 一 时间灌注同 一 液体样品成为可能。样品被提供在器件上的特 定灌注位置。随后，液体样品沿着主通道被送入到进口通道并进而到反 应腔中，优选地通过毛细管力。在其他实施方案中，反应腔可通过低压、 高压或利用离心机旋转器件得到灌注。在此种实施方案中，同样的样品 可在几个反应腔内平行地进行同样的扩增和/或检测反应，以提供同 一 实 验的多个结果，如果在所有反应腔内提供同一扩增混合物；或者同一 样品可在几个反应腔中接受各种不同的扩增和/或检测反应，如果在反 应腔中提供不同的扩增混合物。这样的扩增和/或检测反应是，例如，聚 合酶链反应(polymerase chain reaction)、 连接酶链反应(ligase chain reaction)、 基于核酸序歹'J的扩增(nucleic acid sequence-based amplification)、 ^J不才广i曽(rolling circle amplification)、链置才奐扩增(stmnd-displacement amplification)或转录-介导的扩增(transcription- mediated amplification),
在图l(A)中，画出一种微流体器件(l)的范例实施方案，其包括主通 道(15)和从主通道分出的若千进口通道(12)，每条进口通道通往反应腔 (ll)并具有包含气体的死端分岔(M)，该气体在一旦加热时可密封进口通 道。样品(例如，血浆)被提供在器件(l)上，进入样品进入孔口(18),通 过各种微流体结构(例如，主通道(15))被送到反应腔(11)，这或者借助对 流体网络加压，借助器件的离心力或者借助毛细管力实现。主通道(15) 包括几个连接点，引导液体样品通过进口通道(12)进入反应腔(U)中。每 条进口通道(12)包括起微流体阀作用的死端分岔(14)。灌注死端分岔(14) 的空气没有被液体样品替代，因为在死端分岔(14)中不存在另外的出口。 每个反应腔(ll)包括出口通道(13),存在于反应腔(ll)中的空气在空气被样品液体替代时通过所述出口通道(13)被排出。最终进口通道(12)从主通 道分叉后，主通道(15)弯曲并被引导使得出口通道(13)注入到主通道(15) 中。该段主通道被称作收集通道(7)。于是，从反应腔(ll)通过出口通道 (13)排出的气体通过收集通道(17)放出。反应腔(ll)灌注完成后，器件应 将利用关闭手段，例如，盖子、软塞、胶或利用胶带来关闭。当对器件 施以热循环时，被困在死端分岔(14)内的气体将在较高温度膨胀到进口 通道(12)中，并借此将通道分隔成2个独立的段——2个充液段夹一气体 体积。由于此种膨胀，使得从一个反应腔(ll)进入另一个反应腔(ll)的扩 散得到防止。热循环过程完成后，芯片冷却下来，于是气体体积收缩， 导致阀的开启。因此，只要阀处于关闭，必须在高温或实时地使用检测 手段。
在另一种优选的实施方案中，如图l(B)和(C),以及图6(A)详细表 示的，微流体器件的出口通道(13)每条包括疏水改性的几何阀(16)。如图 1 (C)详细描述的几何阀将空气围困在狭窄小段内，因为该段为疏水的。 当收集通道(17)灌注液体时，几何阀被反应腔和出口通道内的液体样品 从内側关闭，并被收集通道(17)内的液体样品从外側关闭。另外，被困 在疏水改性的几何阀(16)的狭窄小段中的气体阻止了分子从反应腔(U) 到收集通道(17)的扩散。
在某些方面，包含引物(primer)、探针和/或緩沖液的不同反应混合 物被提供给不同反应腔(U),从而允许分析一种样品中几种不同核酸的 存在。在另一个方面，不同反应腔(ll)包含相同的含引物、探针和/或緩 沖液的反应混合物，从而允许分析一种样品在几种独立反应中的1个参 数。
在扩增和/或检测反应中在微流体器件上微流体温度驱动阀的使用 的主要优点是，可利用反应期间的加热作为致动以利用死端分岔中提供 的气体膨胀关闭该阀，从而关闭进口通道和将液体样品密封在1或多个 反应腔内。于是，当在扩增和/或检测反应中采用此种微流体器件时，不 需要提供额外致动以密封反应腔(例如，额外加热器和/或冷却器或机械 密封反应腔的器件)。另外，在此种装置中不需要附加的用于供应外致动 的超结构零件如管道和接线，从而导致器件的简化。替代包括超结构零 件和通道以及反应腔的复杂多层结构，包含微流体温度驱动阀的本发明 微流体器件可制成一层，具有可比的简单几何形状，从而导致制造成本的降低。
本发明微流体温度驱动阀的详细功能展示在图3中。该放大断面表 示出，当不存在液体时(A),通往反应腔(11)的进口通道(12)和灌注气体 的死端分岔(14)。液体样品通过进口通道(12)供应给微流体器件的反应腔 (11)。进口通道(12)包括至少一个死端分岔(14)。死端分岔(14)不包括另 外的出口，因此，死端分岔中装有的气体在样品经过进口通道(12)流向 反应腔(ll)时不被液体样品所替代。因此，当反应腔(11)和进口通道(12) 灌注液体时，规定数量的气体被包含在死端分岔(14)中。这情形表示在 图3(B)中。死端分岔(14)的尺寸以及因此被包含的气体数量，根据待关 闭的进口通道(12)的直径以及给死端分岔施加的热量来选择。正如可从 图3(C)看出的，当对至少死端分岔(14)加热时，气体从死端分岔(14)膨 胀进入灌注液体的进口通道(12)中，此过程符合理想气体定律并依赖于 气体的热容。气体在一侧的膨胀以及几何阀(16)在出口通道(13)中的存 在，只允许气体但阻止液体从反应腔(ll)移出，致使液体联通被中断并 使反应腔(ll)内的液体分成段。因此，从死端分岔(14)膨胀出的气体起到 扩散屏障的作用，使反应腔(U)与进口通道(12)脱节，从而当对至少死端 分岔(14)加热时，在反应腔(11)与进口通道(12)之间不可能进行物质交 换。
当加热时，微流体器件必须关闭以防止液体样品蒸发。敞开的器件 在热循环后将是空的，因此不能实现成功的扩增。关闭可通过，例如， 盖子、胶带、软塞或胶(其通过UV或快速反应(2组分体系)在孔口(port) 内瞬间聚合)来实施。
为实现在闭合系统内气体从死端分岔到进口通道中的所述膨胀，必 须存在一定补偿体积。该补偿体积允许气体从死端分岔膨胀，同时补偿 体积本身则收缩。补偿体积也必须灌注气体，因为液体几乎不可压缩。 没有这样的补偿体积，闭合系统中的压力将升高，而气体从死端分岔到 进口通道中的膨胀将不会发生。理想地，补偿体积在施加热循环期间不 被加热，否则在补偿体积和死端分岔阀中的压力将同等程度地升高。在 补偿体积也被加热的情况下，气体从死端分岔的膨胀是通过相对于死端 分岔室的高度而言增加补偿体积室的厚度和/或高度而成为可能的。借 此，沿补偿体积的温度梯度允许气体从死端分岔室膨胀。作为例子，可 采用一种在器件灌注后关闭并且在施加热循环期间不被加热的空灌注孔口作为补偿体积(19)，正如图l(A)所示。
在如图2(B)的例子所示的微流体器件的其他实施方案中，进口通道 (12)包含至少2个死端分岔(14),其中所述死端分岔(14)进入进口通道(12) 的开口位于彼此基本上相反的位置。在另一些实施方案中，死端分岔可
与另一个相邻。这样的实施方案的第一个优点是冗余度。这样，如果1 个死端分岔偶然被灌注了流体，则第二个阀可关闭通道。此种实施方案 的第二个优点是存储密度。可将气体体积分成2个部分，在进口通道每 侧各一个部分，从而造成阀以及，因此，器件，与整个气体体积都在进 口通道一側的一个死端分盆中的实施方案相比，更为紧凑的格式。
方案:范例实施方案、^绘在图4(B; (E)中。死端分岔(;)可位于另二个 的对面(B),对面但错开(C)，与另一个相邻(D),或者可存在多个死端分 岔(E)。另外，如图5所示，在出口通道(13)中也可存在1或多个死端分 岔，让出口通道(13)也能在微流体器件加热的同时关闭。在该死端分岔 中提供的气体的量可选择，使得，当加热该器件时，每个死端分岔(14) 含有足够气体用于关闭进口通道(12)，或者使得，当器件加热时，在2 或多个死端分盆(14)合在一起中的气体的量足以关闭进口通道(12)。第一 种实施方案具有优越性，因为冗余度。这样，假如1个死端分岔偶然被 灌注了流体，则第二个阀能关闭通道。后一种实施方案具有的优势在于 它能够实现在器件上的高存储密度。
在微流体器件的又一种实施方案中，出口通道(13)包含几何阀(16) 和/或至少一个死端分岔(M)和/或疏水涂层。这样的实施方案描绘在图6 和7中。在图6(A)中画出一种微流体器件的实施方案，它具有从引导液 体进入反应腔(11)的进口通道(12)分出的1个死端分岔(M),并具有位于 出口通道(13)末端的几何阀(16),后者能，当反应腔(ll)灌注液体样品时， 引导气体离开反应腔(11)进入收集通道(17)中。另外，在图6(B)-(E)展 示其他具有至少2个从进口通道(12)分出的死端分岔(14)的范例实施方 案，其中死端分岔(14)位于另一个的对面(B),对面但错开(C)，与另一个 相邻(D)，或者可存在多个死端分岔(E)。另外，出口通道(13)也可包含1 或多个死端分岔，这让出口通道(13)也能在微流体器件加热期间被关闭。 这样的实施方案表示在图7中。
在图l(C)中画出一种范例几何阀。该几何阀由小直径的小通道(例如，毛细管)组成并位于2个较大腔或通道之间。优选的是，小通道位于 2个较大腔或通道之间的壁的中间并且不与腔或通道共享任何侧壁部 分。构成几何阀的小通道的延续部分应制造成这样，即，在每一侧存在 着较大腔或通道与小通道之间的90°角。由于制造的原因，这样的阀难 以生产。因此， 一般地这些几何阀通过与腔或通道共享一个壁而简化(例 如，通道的一个側壁直接延伸到腔或通道中，而不形成90。角)。另外， 如图8所示，死端分岔(14)还可包含几何阀(16),它优选是疏水的，位于 通道(12/13)与死端分岔(14)的出口之间的交叉点。这样的实施方案是有 利的，因为，几何阀(16)起到避免在器件灌注期间死端分岔(14)被意外地 灌注液体的附加功能。
在某些方面，几何阀经过疏水处理或者材料固有的是疏水的。这样 的实施方案表示在图9中。具有疏水表面的几何阀的行为不同于具有亲 水表面的几何阀之处在于，当微流体器件灌注水基液体时灌注(A)在阀的 狭窄部分前停止(B)。由于这样的行为， 一定数量气体被困在几何阀(16) 的狭窄部分中。与收集通道(17)相结合，气体被从两侧困住，并被来自 两侧的液体包围(C)。这两段液体被困在几何阀狭窄部分中的气体分开， 因此在2段液体之间不会发生扩散。此类型阀不要求加热，但如果几何 阀被加热，则困住的气体将膨胀而不妨碍功能。疏水改性的几何阀(16) 与收集通道(17)的组合被用作本发明器件中的反应腔的特殊出口。单靠 几何阀(16)，抑或与收集通道(17)组合起来，可在认为在出口需要阀的场 合用来替代或辅助阀(例如，死端分岔阀)以密封出口(13)。
在另 一种实施方案中，本发明提供一种利用核酸扩增分析液体样品 的仪器，其至少包括本发明的微流体器件、监视核酸扩增反应用的器 件，以及至少覆盖所述至少一个死端分岔的加热器件。在某些实施方案 中，加热器件还覆盖所述反应腔。该实施方案之所以有利是因为，关闭 微流体温度驱动阀与核酸的扩增正好重合。在某些方面，该仪器还包括 热控制(heat control),它允许加热以便按照受控方式开启和关闭微流体 阀，和/或加热或实施热循环以便按照受控方式完成扩增反应。在特定的 领域(例如，PCR领域)，有用的是，加热器件能执行热曲线(heat profiles)。 在某些领域，微流体器件在加热期间必须关闭，以防止液体样品蒸发。 微流体器件的关闭可通过，例如，盖子、胶带、软塞或胶(其通过UV或 快速反应(2组分体系)在孔口内瞬间聚合)来实施。在另 一种实施方案中，本发明提供一种利用核酸扩增分析液体样品
的方法，其至少包括通过所述器件的进口通道向本发明微流体器件的 反应腔内提供液体样品。在下一个步骤中，利用加热器件对该器件的至 少死端分岔加热，由此导致死端分岔内的气体膨胀，借此密封器件的进 口通道。随后，液体样品中的核酸进行扩增，并监视扩增反应。
在又一种实施方案中，本发明提供一种扩增在液体样品中的核酸的 方法，其至少包括通过所述器件的进口通道向本发明微流体器件的反 应腔内提供液体样品，利用加热器件对该器件的至少死端分岔加热，由 此导致死端分岔内的气体膨胀，借此密封所述器件的进口通道，以及扩 增液体样品中的核酸。
这两种方法在某些方面还可以包括，在反应腔灌注液体样品后，关 闭进口和/或出口通道。另外，在这些方法中，核酸的扩增可利用扩增反 应来实施，例如，聚合酶链反应、连接酶链反应、基于核酸序列的扩增， 滚环扩增、链置换扩增或转录-介导的扩增。
实施例
对在抗凝剂EDTA中收集的HBV-阳性患者的人体血浆利用以下手 段对乙型肝炎(Hepatitis B)病毒(HBV)进行测试COBAS AmpliPrep/ COBAS TaqMan HBV测试(Roche, P/N 03587819 190)。样品制备按照 手册采用COBAS AmpliPrep机器实施。样品制备后，提纯的样品与以 下试剂进行混合
提纯的样品 45^1
HBV Mn2+ (获自HBV CS4盒) 15 (xl
HBV MMx (获自HBV CS4盒) 35 pi
HBV QS (获自HBV CS4盒) 5 pi
总体积 100 pi
获得的溶液随后被吸移到如图1 (A)所示的具有6个反应腔的微流体 器件的样品孔口(18)中。样品是利用泵灌注到芯片中的。灌注后，用随 器件带来的一体化盖子关闭器件。按照以下程序对器件实施热循环，所 迷热循环使用 一 种为固定该器件并实时检测反应腔中的反应而采取的热循环机
匀变温度时间[°c][s]
预循环1.250.0200
顺序开始
变性1.295.0150
退火1.259.0251
顺序结束5
顺序开始
变性1.291.0150
退火1.252.0251
顺序结束55
后循环1.240.01200
集(aquisation)
器件的初始加热期间，温度驱动阀按照死端分岔的几何式样对于特 定温度处于关闭状态，并维持关闭直至PCR反应完成以及器件冷却下来。
PCR性能在热循环期间进行实时在线监视。指出样品中存在的HBV 的量的类似Ct值可在每一个反应腔中检测到(见图10)。
权利要求
1.一种利用核酸扩增分析液体样品用的仪器中使用的微流体器件，其至少包括-反应腔，具有适合给所述反应腔灌注所述液体样品的进口通道，和-适合从所述反应腔中排出流体的出口，其中所述出口可在反应腔灌注所述液体样品后关闭，且其中所述进口通道还包含至少一个包含死端分岔的微流体阀，所述死端分岔不具有出口，它包含气体并且尺寸设计为，在至少所述死端分岔加热期间，至少包含足以密封所述进口通道的量的气体，此时所述气体从所述死端分岔膨胀到所述进口通道中形成能可逆地密封所述进口通道的扩散屏障。
2. 权利要求的微流体器件，其中所述死端分盆基本上垂直于所述进C7通道。
3. 权利要求1~2中任何一项的微流体器件，其中所述进口通道至少 在所迷死端分岔与所述进口通道之间连接点处的内壁被疏水涂层覆盖。
4. 权利要求1~3中任何一项的微流体器件，具有多个反应腔，每个 反应腔具有进口通道和出口 ，其中每个进口通道还包含至少一个包含死端 分岔的微流体阀，每个死端分岔不具有出口，它包含气体并且尺寸设计为， 在至少所迷死端分岔加热期间，至少包含足以密封所迷进口通道的量的气 体，此时所述气体从所述死端分岔膨胀到所述进口通道中形成能可逆地密 封所迷进口通道的扩散屏障。
5. 权利要求4的微流体器件，其中每个进口通道一端连接1个反应 腔，而另一端连接主通道，所迷主通道用于给所迷多个反应腔中每一个灌 注所述液体样 品。
6. 权利要求1 ~5中任何一项的微流体器件，其中所述进口通道包含微流体阀，该阀包括至少2个死端分岔，且其中所迷死端分岔进入进口通 道的开口与另一个相邻或基本上位于另一个的反面。
7. 权利要求1 ~6中任何一项的微流体器件，其中出口是出口通道并 包括几何阀和/或至少一个死端分岔和/或疏水涂层。
8. —种利用核酸扩增分析液体样品的仪器，其至少包括 -权利要求1 ~ 7中任何一项的微流体器件，- 监视核酸扩增反应的器件，以及- 至少覆盖所述微流体器件的所述至少一个死端分忿的加热器件。
9. 权利要求8的仪器，其中所述加热器件还覆盖所述微流体器件的所迷反应腔。
10. 权利要求8和9中任何一项的仪器，还包括热控制。
11. 权利要求8~10中任何一项的仪器，其中所述加热器件能执行热曲线。
12. —种利用核酸扩增分析液体样品的方法，其至少包括- 通过所述器件的进口通道向权利要求1 ~7中任何一项的微流体 器件的反应腔内提供液体样品，- 利用加热器件加热所述器件的至少死端分盆，借此，死端分岔内 的气体从所述死端分岔膨胀到所述进口通道中形成扩散屏障并从而可逆地 密封所述器件的进口通道，- 扩增所述液体样品中的核酸，以及- 监视扩增反应。
13. —种扩增液体样品中的核酸的方法，其至少包括- 通过所述器件的进口通道向权利要求1~7中任何一项的微流体 器件的反应腔内提供液体样品，- 利用加热器件加热所述器件的至少死端分岔，借此，死端分岔内 的气体从所述死端分岔膨胀到所述进口通道中形成扩散屏障并从而可逆地 密封所述器件的进口通道，以及- 扩增所述液体样品中的核酸。
14. 权利要求12或13中任何一项的方法，其还包括- 反应腔灌注了所迷液体样品后，关闭进口和/或出口通道。
15. 权利要求12~ 14中任何一項的方法，其中核酸是利用聚合酶链反 应、连接酶链反应、基于核酸序列的扩增、滚环扩增、链置换扩增、等温 扩增、触地聚合酶链反应或转录-介导的扩增实施扩增的。
16. —种死端分岔室的应用，该室包含一定体积的气体以形成关闭含 液体的微流体通道用的微流体阀，其中当加热至少所述死端分岔室时，所 述气体从所述死端分岔室膨胀到所迷通道中形成能可逆地密封所述通道的 扩散屏障，借此，将所述液体分隔成2部分并且关闭所述通道。
全文摘要
一种微流体温度驱动的阀，其主题是一种利用核酸扩增来分析液体样品的仪器中使用的微流体器件、一种利用核酸扩增分析液体样品的仪器、一种分析液体样品的方法以及一种扩增液体中的核酸的方法。
文档编号C12M1/00GK101307834SQ20081008848
公开日2008年11月19日 申请日期2008年3月31日 优先权日2007年3月30日
发明者M·格劳瑟 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司