一种检测snp的磁珠系统及其使用方法

专利名称：一种检测snp的磁珠系统及其使用方法
技术领域：
本发明涉及到一种检测单核苷酸多态性SNP的磁珠系统及其使用方法，具 体是提供一种基于质谱法和磁珠法以检测单核苷酸多态性SNP的磁珠系统及其 使用方法。更具体的说，质谱是基质辅助激光解析电离飞行时间质谱，并且磁 珠是与含有SNP的探针片段杂交的磁珠。技术背景人类的遗传信息储存在基因组中，2002年国际合作项目人类基因组计划的 最终完成，绘制出了人类基因组结构的精细图，为相关研究提供了参考序列。 人类基因组序列共由30亿个位点组成，研究表明，任意两个人之间的基因组差 异在0.1%左右，即大约300万个位点的差异。这些差异极有可能是造成两个人 之间个体差异的遗传因素。发现这些位点，可广泛地应用于遗传标记的研究、 评估个体遗传关系、评估物种进化等研究领域。在人类基因组中，约90%的差异是以单个核苷酸的形式体现出来的，这样 的差异位点被称作单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)。 SNP 具有两个显著的特点: 一是数目众多,据估计人类基因组中的SNP数目约在1100 万左右，目前国际数据库dbSNP中已收录来源于人类基因组的SNP达1083万， 其中经过确认的为644万(截至2007年8月22日)，如此大量的SNP方便了研 究这选择合适的位点进行研究，也使得绝大多数基因组区域在SNP效力的覆盖 范围内；另外一个特点是SNP位点大多数为双态，即在一个位点上仅有两种表 现形式(基因型)，这样很容易就能设计出高通量自动化的检测方法。正因为这 两个特点，使得SNP位点越来越受到研究者的青睐，被誉为是继限制性片段长 度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)和短串联重复序 列(shorttandemrepeat, STR)之后的第三代分子标记物。人类基因组计划完成 前后，基因组学研究的重点逐渐转向SNP领域，因此，SNP在遗传标记学、生 物群体遗传学、生物分类学、遗传育种学、物种或人类进化学、法科学、药物 基因组学等领域都有重要的应用。例如，SNP的丰富性和双等位基因特性使作物或家畜遗传作图更加精细， 使得育种工作者能够更精确的进行标记辅助选择(MAS)和标记辅助导入(MAI)， 降低或消除了目的基因之外的遗传背景对这些技术带来的不良影响，同时也给 品种资源和品种纯度鉴定带来崭新局面。姜运良等人通过对3种"双肌臀"猪 品种的肌肉生长抑制基因3个不同位点进行分析，获得肉质提高的新品种。 Monna等人利用SNP标记技术成功地将水稻半矮杆基因sd-l图位克隆，Shen等人构建了水稻全基因组SNP数据库，并成功地筛选多个水稻功能基因。例如，不同个体中存在的SNP差异，成为了法科学中身份鉴别的有力工具。 Gabirel等人对105个样本的线粒体HVI/HVII区域的SNP进行分析，并用途分 析了实际案例中毛发和骨骼等检材，证明了该方法用于法医检案是可行的。李 莉、李成涛等人对人HLA-DR基因的SNP进行检验，在应用于亲子关系鉴定的 25个案例中，成功率达到96%。为了抢占市场，各大生物学公司都推出了自己的SNP检测方法。其中质谱 仪被认为是很有发展前途的仪器，尤其是基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 (MALDI-TOFMS)。基于MALDI-TOF MS，开发了一些SNP检测方法，如美 国Sequenom公司的hME和iPLEX方法，德国Bruker公司的GOOD assay方法， 韩国GeneMatrix公司的RFMP方法。这些方法的原理是设计一条与待检测SNP 位点上游的基因组序列匹配的寡核苷酸探针，根据SNP位点的基因型差异，探 针将在待检测SNP位点处连接上不同的脱氧核苷酸。耳中，组成DNA片段的 四种脱氧核苷酸的分子量分别是dAMP 313.21Da， dCMP 289.19Da， dGMP 329.21Da, dTMP 304.20Da。不同脱氧核苷酸之间是存在分子量差异的，其中差 异最小的是dAMP与dTMP之间的9.01Da，差异最大的是dCMP与dGMP之间 的40.02Da，通过质谱仪能检测到这种差异，从而将分子量不同的探针区分开来。 质谱仪的检测效果与探针的分子量相关，探针片段越短，分子量越小，区分效 果越明显例如，在图1中，A图标示的两个峰，对应的两个寡核苷酸片段为 5 ，-ACGT-3 ，和5 ，-ACGA-3 ，，分子量分别为1174.699和1183.770Da,相差9.071Da， B图标示的两个峰，对应的两个寡核苷酸片段为5'-ACGTACGT-3'和 5，-ACGTACGA-3，，分子量分别为2410.628和2419.821Da，相差9.193Da， C图 标示的两个峰，对应的两个寡核苷酸片段为5'-ACGTACGTACGT-3'和 5，-ACGTACGTACGA-3，，分子量分别为3645.917和365.4.736Da，相差8.819Da， 同样相差9Da左右，但如图所示，A图中两个峰之间的差异最明显，B图次之， C图中两个峰之间的差异相对不明显，也就是说，分子量越小，质谱仪的区分效 果越明显，即分辨率越高。为了提高质谱仪的分辨率，对SNP位点进行检测倾 向于检测分子量较小的寡核苷酸片段，如RFMP方法通过对含SNP位点的PCR 产物进行限制性酶切，产生2000 4000Da左右的寡核苷酸片段进行检测，而 GOOD assay方法通过磷酸二酯酶(Phosphodiesterase, PDE)将含SNP位点的 寡核苷酸片段切割成1000~2000Da左右的小片段进行检测。然而，国外公司利用质谱仪对SNP位点进行检测的方法，在实际应用中存 在不少缺陷(1) Sequenom公司的hME、 iPLEX两种方法采用的是两步PCR，即第一次 PCR放大待检测SNP位点的拷贝数，第二次PCR对待检测的SNP位点进行检测，在两次PCR之间，还要使用虾碱性磷酸酶(Shrimp Alkaline Phosphatase, SAP)除去第一次PCR反应体系中剩余的dNTP，这样就造成总检测时间的延长， 以及单个检测成本的增加；此外，这两种方法没有对含SNP位点的寡核苷酸片 段进行切割，检测范围在4000 9000Da之间，因而分辨率不高；C2) GOOD assay方法也采用了两步PCR，而且，为了提高分辨率，采用磷 酸二酯酶切割含SNP位点的寡核苷酸片段，提高了成本，延长了时间，不利于 快速检测；(3) RFMP方法只有一步PCR,但是同GOOD assay方法(1000~2000Da) 相比，产生待检测片段过长(2000~4000Da),相应的，分辨率不如GOOD assay 方法。因此，基于MALDI-TOFMS，目前需要开发一种分辨率高、准确、成本低、 快速的方法来检测基因组中SNP位点。发明内容本发明是在针对以往基于质谱法(例如MALDI-TOFMS)检测基因组SNP 位点的方法存在的前期处理速度慢或检测分辨率不够高等问题，而提出的相应 的解决方案。因此，本发明的第一个发明目的是提供一种用于检测单核苷酸多态性SNP 的磁珠系统，包括(1) 表面上附着含有SNP的探针片段的磁珠，其中探针片段是包含待检序列 中的SNP位点并可与待检序列配对杂交的片段，以及SNP在探针片段中的上下 游序列长度是相同的；(2) 具有磁力并可分离磁珠的磁架。 在一个具体实施方案中，所述的磁珠系统还包括(1) 用于扩增待检序列的引物，其中待检序列中可能包含SNP位点；(2) S1核酸酶；(3) 用于检测含有SNP的扩增产物-探针复合物的质谱装置。在另一个具体实施方案中，其中在探针序列中，所述SNP的上下游序列的 相同长度为10-14bp (优选ll-13bp，更优选12bp)，并且引物不含特殊的酶切位 点和标记。例如，合成与待检测SNP位点上下游各12bp序列(含SNP位点共 25bp)互补的探针，可以仅合成正链或反链DNA的探针，也可以正反双链的探 针均合成；可以仅合成含SNP位点的任意一种基因型的探针。在另一个具体实施方案中，磁珠直径为lOnm-lO^im,并且磁架是具有磁性或 内部有磁条或磁块的支架，当把含磁珠的反应体系置于磁架上时，在磁力的作用下，在溶液中均匀分布的磁珠聚集于磁极，从而纯化或分离磁珠。还在另一具体实施方案中，其中所述的质谱仪是基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI TOF MS)，例如，德国Bruker公司的flex系列，如 MicroFlex 、 AutoFlex 、 UltraFlex等，也包括其他公司的对应产品，如 AppliedBiosystems公司、Agilent公司等。本发明的第二个发明目的是提供使用上述系统以检测单核苷酸多态性SNP的方法，步骤包括步骤(l):制备直径lOnm-lOum的磁珠步骤(2):根据待检序列中可能的SNP，合成包含SNP的探针片段步骤(3):充分混合磁珠和探针片段，使得探针片段附着在磁珠表面，形成 磁珠-探针复合物；步骤(4):使用引物，扩增样品中的待检序列，然后将扩增产物与磁珠-探针 复合物进行充分杂交配对，形成磁珠-探针-待检序列复合物。其中，PCR引物为普通设计，不含特殊的酶切位点和标记。PCR产物长度 大约在100bp左右，包含SNP位点。具体的PCR反应体系，即含SNP位点的 DNA模板、本发明的引物、dNTPs、耐热保真聚合酶、缓冲液、Mg2+、无菌的 去离子水等各种试剂的体积，以及反应温度条件和反应时间根据具体的SNP位 点、引物Tm值及反应片段大小而定。PCR反应完成后，往反应产物中加入带有探针的磁珠，并在56'C温浴1小 时，使反应产物与探针杂交。若PCR产物带有的SNP位点的基因型与探针带有 的SNP位点的基因型互补，它们将完全杂交，即PCR产物中含SNP位点的25bp 与探针以共价键连接；若PCR产物带有的SNP位点的基因型与探针带有的SNP 位点的基因型不互补，它们将不完全杂交，即PCR产物中tSNP位点的25bp 序列将有24bp与探针以共价键连接，而在SNP位点处没有共价键连接，形成一 个"泡"状结构。磁珠加入量视反应产物量而定。步骤(5):使用S1核酸酶，充分酶切磁珠-探针-待检序列复合物，并将S1 核酸酶消化后的反应液置于磁架上，在磁力的作用下，收集磁珠和磁珠-探针-待检序列复合物，并弃去澄清液体。其中，如果待检序列中含有SNP位点，则 在复合物中，由于探针和待检序列在SNP位点处不能配对连接，将形成一个"泡" 状结构，因此Sl核酸酶在形成"泡"状结构的SNP处将探针-待检序列复合物切 断。其中，酶切反应和随后的灭活反应的时间根据具体的杂交反应体系的大小和S1核酸酶的浓度、质量而定。Sl核酸酶是一种高度单链特异的核酸内切酶， 能催化RNA和单链DNA分子降解成为5'单核苷酸，同时它也能作用于双链核 酸分子的单链区，并从此处切断核酸分子。在S1核酸酶的作用下，体系中的单 链DNA，如没有与PCR产物杂交的探针、PCR产物中没有与探针杂交的部分， 都将被降解；此外，若PCR产物与探针不完全杂交，Sl核酸酶将在"泡"状结构 处将PCR产物-探针复合体切断。步骤(6):洗涤磁珠和磁珠-探针-待检序列复合物的混合物，然后将混合物从 磁架上取下来，稀释后，在95'C高温水浴5分钟、冰浴骤冷20分钟，使酶切后 的扩增产物与探针分离，并得到单链核酸溶液；其中，由于通过高温-骤冷的方 法，使得双链扩增产物-探针复合物解离成单链，并释放到溶液中呈游离状态， 因此在通过磁架分离探针和扩增产物后，得到了可用于质谱检测的单链核酸溶 液。然后，在磁力的作用下，磁珠(包括磁珠上的PCR产物-探针复合物)将聚 集在一起，以移液器吸取并丢弃反应体系中的液体，以无菌的去离子水配合磁 架将磁珠洗涤几次。将反应体系从磁架上取下来，加入无菌的去离子水，95°C 水浴5分钟，冰浴20分钟，使PCR产物与探针分离，再将反应体系置于磁架上， 室温或者冰浴条件下将不含磁珠的液体转移至另一个干净试管中。步骤(7):将溶液再次置于磁架上，然后在室温或者冰浴条件下收集不含磁 珠的单链核酸溶液；步骤(8):将单链核酸溶液进行经质谱检测，根据产物分子量相比对确定相 应的SNP，从而判断待检样品中的SNP类型。其中，由于野生型和突变型SNP 位点所代表的酶切片段相差13bp，在质谱仪中区分度在3500Da以上，因此利用 高分辨率质谱装置检测酶切片段的分子量，可测定待检序列中的SNP基因型。在使用质谱仪检测所述的单链核酸溶液过程中，先在样品靶上点0.5nl基质， 基质组成为柠檬酸氢二铵(Diammonium hydrogen citrate, DAC) 1.6g/L， 3—羟 基吡啶羧酸(3-hydroxypicolinicacid， 3-HPA) 6g/L,以l:l的乙腈-水混合溶解， 待基质在自然状态下结晶后，在结晶后的基质上点lul样品(即干净试管中的液 体)，自然状态下结晶。然后进行MALDI-TOF MS分析，获得酶切产物的质谱 图，经质谱检测测得酶切产物分子量根据实验推测的产物分子量相比对确定相 应的SNP类型，实现SNP检测。定义:术语"SNP"，又称单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism)是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括置换、颠换、缺失和插入。从理论上来看每一 个SNP位点都可以有4种不同的变异形式，但实际上发生的多为转换和颠换，二 者之比为2: 1。 SNP在CG序列上出现最为频繁，而且多是C转换为T,原因是 CG中的C常为甲基化的,自发地脱氨后即成为胸腺嘧啶。术语"磁珠"，又称磁粒(biomag)或磁性微球，是一种壳/核结构的微球，由磁 性、可磁化的、带电的以及可带电的内核(优选金属氧化物，如铁钴镍的氧化 物)和高分子材料的外壳组成，根据需要，磁珠外壳可包被不同的高分子材料。磁珠可以具有任何合适的尺寸，例如直径从10nm-10nm。参见 CN03123726.6、 CN01109870.8或WO02/075309。在实际应用中，在非固定的复合物中所采用的磁珠可以是磁性微粒。磁性 微粒可以通过任何合适的方法制备。例如，可以采用专利CN01/109870.8或 WO02/075309所述的方法来制备。在本发明所述的生物芯片系统和方法中可以 采用可以磁化的材料来制备磁性微粒。可磁化材料的例子包括亚铁磁性材料， 铁磁性材料，顺磁性材料以及超顺磁性材料。在一个具体实施方案中，磁性微 粒带有顺磁性材料，例如顺磁性金属氧化物。更适宜的，顺磁性金属氧化物是 过渡态金属氧化物或者合金等。任何过渡态的金属均可被釆用，例如铁，镍， 铜，鈷，锰，钜，锌以及zirconium(Zr).更好的情况是金属氧化物为？6304或 Fe203 。在另一个具体实施方案中，在磁珠中所采用的可磁化的物质是金属，这 一金属可以是过渡态金属或者合金铁，镍，铜，鈷，锰，钽，锌以及zirconium(Zr) 以及鈷-钽-zirconium( CoTaZr )合金。磁珠也可以从可获得的初级磁珠中制备，也可以从被单体所包被的粗的材 料以及金属氧化物中制备，如专利U.S.PatentNo.5，834，121所示，上述单伴在经 过交联以后可以形成一个坚固的多聚物壳体。在这里"坚固"指的是交联而形成的 多聚物壳体可以对包裹在其内的金属氧化物起到稳定的作用(也就是壳体不会膨 胀或者溶解)，因此颗粒会保留在壳体的内部。在这里"微孔的"指的是在畸形的 有机溶剂中会膨胀或者扩展的树脂状的多聚物基质。这里的"装载"指的是颗粒上 的集合位点可以被功能化或者衍生化的一种能力。合适的材料可以被用作可磁化的材料，例如，锰铁矿，锰铁酸盐，鈷，镍， 磁铁矿以及多种不同的合金。锰铁矿是优选的金属氧化物。通常，金属盐往往 先被转化成金属氧化物然后被包被上多聚物或者被吸收进磁珠中，该磁珠带有 热塑性的多聚物树脂并且在其上有较少的基团。当想从金属氧化物开始而获得 疏水的初级微球，有必要提供来源于乙烯基单体的热塑多聚物坚固的壳体，最 好是能够与微孔基质结合或者被微孔基质结合的交联的聚苯乙烯。磁珠可以采 用已有的方法来制备，例如来自文献中的方法(Vandenberge等，J.ofMagnetism9and Magnetic Materials, 15-18: 1117-18(1980); Matijevic， Acc.Chem.Res.， 14: 22-29(1981);和U.S.PatentNos.5,091，206; 4,774,265; 4,554,088;和4,421 ，660.)。本发明中可能用到的初级磁珠可来于专利所述U.S.Patent.Nos.5,395，688; 5,318,797; 5,283,079; 5，232，7892; 5，091，206; 4，965，007; 4,774,265; 4,654,267; 4，4卯,436; 4,336,173;以及4，421,660)或者初级微球可以通过商业途径从已有的 亲水或者疏水的微球中获取，只要其能够满足尺寸以及稳定性的要求，并且具 有吸收使用的乙烯基单体而形成网状基质的能力。优选的是，初级磁珠是一种 疏水的，聚苯乙烯包被的，顺磁性的颗粒。这种聚苯乙烯顺磁性小球可以从 Dynal， Inc.(Lake Success, N.Y.)， Rhone Poulonc (France);禾卩SINTEF(Trondheim， Norway)获得。原始的仅带有一层不稳定的多聚物的微粒或者磁性微粒可通过在 其表面上进行进一步的处理而带上坚固的多聚物外壳而被使用。术语"待检序列"，指可能包含SNP位点的核酸序列，包括单链/双链DNA、 单链/双链RNA、 DNA-RNA杂交序列等。术语"磁架"，指磁架是具有磁性或内部有磁条或磁块的支架，当把含磁珠的 反应体系置于磁架上时，在磁力的作用下，在溶液中均匀分布的磁珠聚集于磁 极方向，从而纯化或分离磁珠。


图1分别是具有相同SNP(T/A)的不同长度的序列分子量与质谱仪分辨率关 系的示意图。其中，图例A是5bp长度(5'-ACGT-3'和5'-ACGA-3')的分子量 质谱检测差异，图例B是8bp长度(5'-ACGTACGT-3，和5'-ACGTACGA-3，)的 分子量质谱检测差异，图例C是12bp长度(5，-ACGTACGTACGT-3，和 5'-ACGTACGTACGA-3')的分子量质谱检测差异。图2-A是待检序列与磁珠-探针复合物的几种杂交结合模式。其中，图例1 表示待检序列与所述复合物上的单链探针片段完全杂交；图例2表示待检序列 与所述复合物上的单链探针片段不完全杂交，并在SNP位点形成一个鼓起的泡 状结构；图例3表示不含待检序列的对照。图2-B是使用Sl核酸酶进行酶切磁珠-探针复合物的示意图。其中，图例1 表示Sl核酸酶切去待检序列中不与单链探针配对结合的单链部分，得到不含 SNP的磁珠-完整探针片段-待检序列复合物；图例2表示Sl核酸酶切去待检序 列中不与单链探针配对结合的单链部分，并在形成泡状结构的SNP位置进行切 断，从而得到磁珠-1/2探针片段-待检序列复合物；图例3表示不含待检序列的 磁珠-探针复合物的酶切对照。图3是利用磁珠系统检测单核苷酸多态性SNP的流程图。图4是是根据本发明的方法，所得到的阴性对照A、待测样品B、待测样品 C的质谱检测结果。
具体实施方式
现在仅用参考下面非限制性的实施例的方式进一步描述本发明。但是应当 理解，下面的实施例仅仅是作为例证的，不应以任何方式当作对上述本发明总 体的限制。实施例1:磁珠的制备称取20g FeS04'7H20和40g FeC13'6H20分别溶于50mL蒸馏水中，充分 溶解后混合在500mL的三口瓶中搅拌。将上述混合液温度降到5°C，在搅拌 (200 400rmin-l)的同时滴加10。/。的NaOH溶液，使反应液pH值到ll，搅拌10min 后将反应釜温度调节到8(TC，反应釜温度升至8(TC后加2g沉降剂，在8(TC下 搅拌60min。将反应温度降至室温。将反应液转移到500mL的烧杯后放在一块 强磁铁上，10min后将上部清夜倾出。反复数次，直到反应液显中性。将上述溶 液过滤分离出磁珠，准备下一步使用。实施例2:设计乙肝病毒P基因的SNPs38的探针片段，并结合磁珠乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是严重的世界性卫生问题，每 年约有近百万人死于乙肝病毒感染引起的各类疾病。但是对于已经确诊的乙肝 病人而言，不同个体中的乙肝病毒基因组存在多种SNP突变，导致相同疾病的 病人对同一药物产生耐药性。如果对乙肝病人体内的SNP标记进行研究，揭示 了人群中不同个体对相同药物的敏感性差异的根本原因，将有助于研究者筛选 更合适的药物。 ，其中，乙肝病毒基因组编码的P基因(NCBI Gene ID: 944565)上第838位 核苷酸发生A—C突变，使编码氨基酸由天冬酰胺变为苏氨酸(N236T)，从而 产生对阿德福韦酯(adefovirdipivoxil)的耐药性。对于该位点的质谱检测，我们设计如下实验合成探针GTATACATTTGAaCCCTAATAAAAC，该探针含突变位点的A等 位基因型(小写字母a表示)以及突变位点上下游各12bp的DNA序列。分别溶解所制备的探针和磁珠，根据适当比例(例如V:V-10:1)混合探针 溶液和磁珠溶液(500til:5(^1)，然后加入300W丙酮。在漩涡振荡器上轻微振荡 30s，室温静置5min。用磁架将磁珠固定，弃上清后，再用70%乙醇洗磁珠2次， 最后溶于10(^1TE溶液(或无菌水)，得到磁珠-探针复合物。实施例3:乙肝病毒P基因的扩增根据乙肝病毒基因组的P基因序列，设计PCR引物如下:上游弓I物为CTTGAGTCCCTTTTTACCTC ， 下游引物为TTAAGGGAGTAGCCCCATCG ，PCR反应产物大小为95个核苷酸，PCR反应条件:95'C 150s，然后95。C 25s、 50°C 40s、 72°C 75s循环45次，之后72°C 3min。 PCR产物有两种，在突变位点 为A核苷酸的称之为野生型(wild type, wt)，在突变位点为C核苷酸的称之为 突变型(mutant type， mt)。实施例4:磁珠-探针片段-扩增产物复合物的制备PCR反应后，将磁珠-探针复合物加入扩增产物中，56'C水浴1小时，使PCR 产物与探针杂交。其中野生型PCR产物的反义链(在突变位点处为T)将与探 针完全杂交(参见图2-A-l)，而突变型PCR产物的反义链(在突变位点处为G) 在SNP位置与探针不完全杂交，而形成泡状结构(参见图2-A-2)。而两种PCR 产物的正义链以及空白对照不与探针杂交(参见图2-A-3)。实施例5: Sl核酸酶消化杂交后加入S1核酸酶，37'C水浴1小时，进行完全的酶切反应。体系中的 单链部分将被降解。PCR产物仅有25bp因与探针杂交而形成双链，其余部分都 将被降解，其中，野生型PCR产物与探针完全杂交，不受S1核酸酶的影响， 因此得到不含SNP的磁珠-完整探针片段-待检序列复合物(参见图2-B-l);而 突变型PCR产物与探针不完全杂交，在突变位点处形成一个"泡"状结构，Sl核 酸酶从这里切断PCR产物-探针复合体，因此得到磁珠-1/2探针片段-待检序列复 合物(参见图2-B-2)。这样，将产生两个12bp的双链DNA片段(即部分探针-部分待检序列的双链片段)，其中一个与磁珠联接，另外一个释放到溶液当中， 呈游离状态。实施例6:分离纯化单链核酸片段酶切反应后，将含反应体系的小管在磁架上静置1分钟，吸取并丢弃液体， 将小管从磁架上取下，加入500ul无菌的去离子水，轻混数次，然后将小管在磁 架上静置1分钟，吸取并丢弃液体，如此反复洗涤3次，再将小管从磁架上取 下，加入15ul无菌的去离子水，95'C水浴5分钟，冰浴20分钟，使PCR产物-探针复合体解成单链，再将小管置于磁架上1分钟，将不含磁珠的液体转移至 另一个干净的小管中。实施例7:质谱检测先在样品靶上点lul基质，待基质在自然状态下结晶后，在结晶后的基质上 点lul样品(即干净小管中的液体)，自然状态下结晶。然后进行MALDI-TOFMS 分析，获得酶切产物的质谱图。基质组成为柠檬酸氢二铵(Diammonium hydrogen citrate, DAC) 1.6g/L， 3—羟基吡啶羧酸(3腸hydroxypicolinic acid， 3-HPA) 6g/L，以1:1的乙腈-水混合溶解，避光室温保存。判定标准如下若患者体内的乙肝病毒基因组序列没有发生耐阿德福韦酯 突变，酶切产物应为25bp长的5'- GTTTTATTAGGGTTCAAATGTATAC-3'，分 子量为7701.05;若患者体内的一个拿病毒基因组序列发生耐阿德福韦酯突变， 酶切产物应为12bp长的5'-TCAAATGTATAC-3'，分子量为3628.39。其中，样品A为阴性对照样本，样品B和样品C为待测样本。(1) 对于阴性对照样本A，由于其为没有发生耐药突变的野生型(wt) 病毒株，其SNP基因型为A，因此酶切产物为5'-GTTTTATTAGGGTTCAAATGTATAC-3',而实测分子量为7700.953， 与预期的分子量(7701.05)仅偏差0.1Da不到，这属于可以接受的 误差范围。因此，证实样品A为阴性对照样本(参见图4A)。(2) 对于样品B，片段长度12bp，实际质谱检测分子量为3628.214，这 与预期的阳性结果的分子量(3628.39)仅^差0.20&不到(属于可 以接受的误差范围)，因此证实样品B属于发生耐药突变的突变型(mt)病毒株，SNP基因型为C，酶切产物为 5'-TCAAATGTATAC-3'(参见图4B);(3) 对于样品C，实际质谱检测分子量为3628.460和7701.102，这与预 期的阴性分子量(7701.05)以及阳性分子量(3628.460)分别相差 0.1Da不到(属于可以接受的误差范围)，因此证实样品C属于发生 耐药突变的突变型(mt)病毒株与没有发生耐药突变的野生型(wt) 病毒株共存时的检测结果，其基因型为A/C，酶切产物为12bp的 5，-TCAAATGTATAC-3， 和 25bp 的 5，國 GTTTTATTAGGGTTCAAATGTATAC-3'(参见图4C)。因此，根据检测结果，揭示了样本A、 B以及样本C个体对相同药物的敏 感性差异的根本原因，这有助于研究者筛选更合适的药物。
权利要求
1.一种用于检测单核苷酸多态性SNP的磁珠系统，包括(1)表面上附着含有SNP的探针片段的磁珠，其中探针片段是包含待检序列中的SNP位点并可与待检序列配对杂交的片段，以及SNP在探针片段中的上下游序列长度是相同的；(2)具有磁力并可分离磁珠的磁架。
2. 根据权利要求1所述的磁珠系统，还包括(3) 用于扩增待检序列的引物，其中待检序列中可能包含SNP位点；(4) Sl核酸酶；(5) 用于检测含有SNP的扩增产物-探针复合物的质谱装置。
3. 根据权利要求1或2所述的系统，其中在探针序列中，所述SNP的上下游 序列的相同长度为10-14bp，并且引物不含特殊的酶切位点和标记。
4. 根据权利要求3所述的系统，其中磁珠直径为10nm-10Mm，并且磁架是具 有磁性或内部有磁条或磁块的支架，当把含磁珠的反应体系置于磁架上 时，在磁力的作用下，在溶液中均匀分布的磁珠聚集于磁极方向，从而纯 化或分离磁珠。
5. 根据权利要求4所述的系统，其中所述的质谱仪是基体辅助激光解吸电离 飞《亍日寸l、司质i普(Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry ， MALDITOF MS )。
6. 使用权利要求1-5所述的任一系统以检测单核苷酸多态性SNP的方法。
7. 权利要求6所述的方法，步骤包括(1) 制备直径10nm-10|im的磁珠；(2) 根据待检序列中可能的SNP，合成包含SNP的探针片段； 。)充分混合磁珠和探针片段，使得探针片段附着在磁珠表面，形成磁珠-探针复合物；(4) 使用引物，扩增样品中的待检序列，然后将扩增产物与磁珠-探针复合物 进行充分杂交配对，形成磁珠-探针-待检序列复合物；(5) 使用Sl核酸酶，充分酶切磁珠-探针-待检序列复合物，并将Sl核酸酶消 化后的反应液置于磁架上，在磁力的作用下，收集磁珠和磁珠-探针-待检 序列复合物，并弃去澄清液体；(6) 洗涤磁珠和磁珠-探针-待检序列复合物的混合物，然后将混合物从磁架上 取下来，稀释后，在95"C高温水浴5分钟、冰浴骤冷20分钟，使酶切后 的扩增产物与探针分离，并得到单链核酸溶液；OO将溶液再次置于磁架上，然后在室温或者冰浴条件下收集不含磁珠的单链 核酸溶液；(8)将单链核酸溶液进行经质谱检测，根据产物分子量相比对确定相应的 SNP,从而判断待检样品中的SNP类型。 '
8. 根据权利要求7所述的方法，其中在步骤(5)中，如果待检序列中含有SNP位 点，则在复合物中，由于探针和待检序列在SNP位点处不能配对连接，将形成 一个"泡"状结构，因此Sl核酸酶在形成"泡"状结构的SNP处将探针-待检序列 复合物切断。
9. 权利要求7所述的方法，其中在步骤(6)中，由于通过高温-骤冷的方法，使得 扩增产物-探针的双链复合物解离成单链，并释放到溶液中呈游离状态，因此在 通过磁架分离探针和扩增产物后，得到了可用于质谱检测的单链核酸溶液。
10. 权利要求7所述的方法，其中在步骤(8)中，由于野生型和突变型SNP位点所 代表的酶切片段相差13bp，在质谱仪中区分度在3500Da以上，因此利用高分辨 率质谱装置检测酶切片段的分子量，可测定待检序列中的SNP基因型。
全文摘要
本发明提供一种检测单核苷酸多态性SNP的磁珠系统及其使用方法，具体是提供一种基于质谱法和磁珠法以检测单核苷酸多态性SNP的磁珠系统及其使用方法。该方法的要点在于将含SNP位点的PCR产物与磁珠上联接的对应探针杂交，然后以S1核酸酶识别野生型的完全杂交和突变型的不完全杂交，将不完全杂交的DNA片段切断，随后进行洗脱、单链制备、点靶、质谱仪检测等步骤，以质谱仪分析基因组中的突变位点。本发明与以往方法相比，成本和耗时均得到降低，而分辨率明显提高。
文档编号C12Q1/68GK101245390SQ20081008948
公开日2008年8月20日 申请日期2008年4月3日 优先权日2008年4月3日
发明者于中连, 芳 吕, 吕萍萍, 赵洪斌, 马庆伟 申请人:毅新兴业(北京)科技有限公司