专利名称：一种利用粪便中sfrp2基因超甲基化筛查大肠癌的方法
技术领域：
本发明属于医学领域，特别是公开一种筛查大肠癌的方法。
技术背景大肠癌是指大肠粘膜上皮在环境或遗传等多种致癌因素作用下发生 的恶性病变，包括结肠癌、直肠癌和肛管癌，是最常见的消化道恶性肿 瘤之一。临床常见血便或粘液脓血便，大便形状或习惯发生改变，腹痛, 腹部包块等。根据其发生部位不同，其临床表现常各有其特殊性。大肠 癌起病隐匿，早期常无明显的临床表现，病情发展较慢，所以在早期易 被忽略。大肠癌的危险因素包括①年龄超过45岁，发病高峰为45-65 岁；②腺瘤性息肉，包括管状腺瘤、絨毛状腺瘤、管状-绒毛状腺瘤(混 合性腺瘤)，绒毛结构比例高的息肉和大的息肉更可能癌变，大肠癌生成 可能需10年时间，从可辨认的腺瘤发展为侵袭性癌需5年；③大肠癌 家族史，癌病人一级亲属的大肠癌发病率比普通人群高出2~3倍，而家 族性腺瘤性息肉病病人大肠内有成百丄T个腺瘤性息肉，如不切除结肠， 在十年内很可能发展为癌；④炎症性肠病，溃疡性结肠炎或Cmhn病癌 变机会随病程而增大。随着社会的发展，大肠癌的诱发因素不断增加，尤其是近二十年来， 其发病率居高不下并有明显的上升趋势。在我国，大肠癌的发病率位居 肿瘤的第五位，发病男性多于女性。据国内统计，该病发病年龄也呈年 轻化，高发国家大肠癌高发年龄为60 70岁，30岁以下者占6%左右，而我国大肠癌好发年龄比国外提早10 15岁，30岁以下者占10%左右， 我国报道的最小的患者14岁。大肠癌的预后与确诊时肿瘤的分期关系最密切，病期晚则预后差。 大肠癌患者如无转移，手术5年存活率可超过90%;如有转移，手术5 年存活率不足50%。大肠癌早期患者无特异性临床症状，极易被忽略而 延误治疗，因此，早期发现、早期诊断、早期治疗成为治疗大肠癌的关 键因素。目前临床常用的检测方法有以下几种l.直肠肛门指检，该方 法简单易行，是直肠癌术前检査中最基本的方法，但是此方法容易误诊、 漏诊，特异性不强。2.实验室抽血检査。针对性不强，且对身体有损伤， 不适合作为普查或早期诊断方法。3.内镜检査。4.CT诊断。5.超声显象 检査。6.磁共振检査。这些方式或对身体都有一定的创伤性，对身体造 成损伤，或特异性不强，或费用太高，因此，探索一种安全可靠、特异 性强、能早期有效筛查大肠癌的方法，使患者能早期发现、早期诊断、 早期治疗大肠癌，成为医学界噬待解决的问题。 发明内容鉴于以上问题，本发明的目的在于提供一种利用粪便中SFRP2基因 超甲基化筛査大肠癌的方法。为了达到以上目的，本发明是通过以下步骤实现的1 、标本制备，粪便DNA从粪便标本用QIAamp DNA Stool Mini Kit 分离DNA，置于-70^-85-C保存备用；2、数据收集，取500ng-2ng的基因组DNA放在容器中，用终浓度 为0.15-0.25mol/L的NaOH在36-37.5°C中变性14-17分钟，添加30pL 的9-llmmol/L的对苯二酚和520pL的2.0-3.5mol/L的NaHS03，pH4.9-5.1，混合物在50-60。C下培养15-18小时，重亚硫酸盐修饰的DNA 用Wizard DNA Cleanup kit纯化，DNA用NaOH在室温下培养14-17分 钟脱磺酸基，终浓度为0.25-.035mol/L，用醋酸氨中和，PH为6.5-7.3， 终浓度为0.3mol/L， DNA用乙醇沉淀回收，用蒸馏水稀释到终浓度为 4.5-5.5ng/^iL， 3pL的重亚硫酸盐修饰的DNA和从80^L提取出的等量的 DNA用来扩增，PCR在反应容器中进行，包括17.875pL的ddH20、2.5jiL 的10xPCR Buffer、 2pL的dNTP Mixture 、 0.25 (iL的Forward Primer、 0.25 jaL 的Reverse Primer、 2pL的Template和0.125pL的TaKaRa Taq HS，在以 下条件下进行93-97"C变性5分钟进入循环，循环温度及时间为93-97 °C， 25-35秒；退火温度U型引物45-55。C， M型引物60-64-C, 25-30 秒；70-75°C， 25-35秒，共40个循环，70-75*€延长5分钟；3、数据处理及检测，进行电泳分析，根据电泳图，得出甲基化结果， 根据MSP原理判定有无肿瘤存在。本发明的原理亚硫酸氢盐可选择性地将胞嘧啶变成尿嘧啶，甲基 化的胞嘧啶却不会发生变化，利用甲基化与非甲基化的差异，以亚硫酸 氢盐处理过的DNA作模板，利用特异性的引物作PCR，扩增产物通过琼 脂糖电泳或DNA测序就可以检测基因是否发生甲基化。本发明是针对目前常用大肠癌检测化验方法对人体的创伤性及操作 的复杂性等缺陷的改进。本发明操作简便且无创伤。通过大量反复的实 验表明，MSP技术检测粪便中SFRP2基因甲基化改变情况效果确切，如 若检测到SFRP2基因发生频繁的甲基化改变(超甲基化)则可筛査大肠 癌。本发明的优点是1、 简便易行，易于大规模推广；2、 通过检测粪便中SFRP2基因发生频繁的甲基化改变(超甲基化) 有效筛査大肠癌；3、 有效提高检测效率，安全实用，降低检测成本；4、 无创伤，减轻患者痛苦。
具体实施方式
患者自行收集粪便标本，粪便DNA从粪便标本(250mg)用QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen)分离DNA，置-8(TC保存备用。取500ng-2吗 的基因组DNA在容积为50pL中用NaOH(新鲜制备，终浓度为0.2mol/L) 在37'C中变性15分钟。接着添加30pL的10mmol/L的新鲜对苯二酚和 520pL的3.0mol/L的新鲜制备的NaHS03， pH5.0 (Sigma)，混合物在 55'C下培养16小时。重亚硫酸盐修饰的DNA用Wizard DNA Cleanup kit (Promega)纯化。DNA用NaOH在室温下培养15分钟脱磺酸基(终浓度 为0.3mol/L)，用醋酸氨中和，PH为7.0 (终浓度为0.3mol/L)。 DNA用 乙醇沉淀回收，用蒸馏水稀释到终浓度为5ng/^iL。 3pL的重亚硫酸盐修 饰的dna和从80mL提取出的等量的dna用来扩增。pcr在25pL的 反应容积中进行，包括17.875pL的ddH20、2.5pL的10xPCR Buffer、2^L 的dNTP Mixture、 0.25|iL的Forward Primer、 0.25的Reverse Primer、 2pL的Template和0.125^L的TaKaRaTaqHS，然后在以下条件下进行 95'C变性5min进入循环，循环温度及时间为95 °C ， 30s;退火温度U 型引物5(TC， M型引物62'C， 30s; 72。C， 30s,共40个循环，然后72°C 延伸5min。最后进行电泳分析，根据电泳图，得出甲基化结果，根据 MSP原理判定有无肿瘤存在。
权利要求
1. 一种利用粪便中SFRP2基因超甲基化筛查大肠癌的方法，其特征是通过以下步骤实现的(1)粪便DNA从粪便标本用QIAamp DNA Stool Mini Kit分离DNA，置于-70--85℃保存备用；(2)取500ng-2μg的基因组DNA放在容器中，用终浓度为0.15-0.25mol/L的NaOH在36-37.5℃中变性14-17分钟；添加30μL的9-11mmol/L的对苯二酚和520μL的2.0-3.5mol/L的NaHSO3，pH4.9-5.1，混合物在50-60℃下培养15-18小时；重亚硫酸盐修饰的DNA用Wizard DNA Cleanup kit纯化；DNA用NaOH在室温下培养14-17分钟脱磺酸基，终浓度为0.25-.035mol/L，用醋酸氨中和，PH为6.5-7.3，终浓度为0.3mol/L；DNA用乙醇沉淀回收，用蒸馏水稀释到终浓度为4.5-5.5ng/μL；3μL的重亚硫酸盐修饰的DNA和从80μL提取出的等量的DNA用来扩增；PCR在反应容器中进行，包括17.875μL的ddH2O、2.5μL的10×PCR Buffer、2μL的dNTP Mixture、0.25μL的Forward Primer、0.25μL的Reverse Primer、2μL的Template和0.125μL的TaKaRa Taq HS，在以下条件下进行93-97℃变性5分钟进入循环，循环温度及时间为93-97℃，25-35秒；退火温度U型引物45-55℃，M型引物60-64℃，25-30秒；70-75℃，25-35秒，共40个循环，70-75℃延长5分钟；(3)进行电泳分析，根据电泳图，得出甲基化结果；根据MSP原理判定有无肿瘤存在。
2、 根据权利要求1所述的一种筛査大肠癌的方法，其特征在于所述判断 的标准为粪便中SFRP2基因是否发生甲基化。
全文摘要
本发明属于医学领域，提供了一种筛查大肠癌的方法，该方法是一种利用粪便中SFRP2基因超甲基化筛查大肠癌，通过制作标本、收集数据、处理数据来完成筛查。本发明具有极高的准确率，为大肠癌的早期发现、早期诊断治疗提供了新的方法；其设计合理，无创伤，痛苦小，费用低，可作为大肠癌的普查方法，如果应用到临床，能大幅提高大肠癌的治愈率，降低我国大肠癌的病死率，具有极高的经济效益和社会效益。
文档编号C12Q1/68GK101250588SQ20081008959
公开日2008年8月27日 申请日期2008年4月9日 优先权日2008年4月9日
发明者东 汤, 王道荣 申请人:王道荣;汤 东