一种检测dna碱基突变的方法

专利名称：一种检测dna碱基突变的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测DNA中是否存在碱基突变的方法。
技术背景近年来，DNA碱基错配受到了大家的广泛关注，研究表明，人类基因大约含有 109个碱基对。对DNA的物理和化学破坏都有可能导致DNA在复制过程中产生碱基错 配或误配，虽然生物体自身存在强大的修复系统用于修复错配，但是仍有部分错配 未被修复。由于一个碱基突变都有可能引发致命的癌症以及基因相关疾病，所以对 于DNA碱基错配的检测对于临床诊断，基因表达分析和治疗以及生物医药研究都具 有重要的意义。目前已有多种方法可用于DNA碱基错配的检测，其中大部分是基于DNA错配会 对DNA双螺旋的稳定性产生较大影响的原理，利用寡核苷酸的特异性杂交来检测 DNA碱基错配。基于上述原理的方法具有原理简单的优点，但存在步骤繁琐、成本 较高、灵敏度低的缺点，而且由于非特异性杂交的影响，导致上述方法选择性降低， 很难实现单个碱基突变的检测。 发明内容本发明的目的是提供一种检测DNA中是否存在碱基突变的方法。 本发明提供的检测DNA中是否存在碱基突变的方法，依次包括以下步骤1) 用荧光素标记单链多核苷酸M;所述M与待测DNA的正常序列完全互补且可 以形成G-四聚体结构；2) 使荧光素标记的M形成G-四聚体结构；3) 将形成G-四聚体结构的M和溴乙锭混合，加入待测DNA和下述式(I)的化 合物、同时设置加入由待测DNA的正常序列组成的DNA片段和下述式(I)的化合 物的对照体系，按照如下方法确定待测DNA是否存在突变若待测DNA反应体系的 16。。》/142^小于等于对照体系的1.5 ±0.08，待测DNA存在碱基突变；若待测DNA反 应体系的161/1422 等于对照体系的2. 0±0. 07，待测DNA不存在碱基突变;所述I ,。nra 为发射波长为600 mn的发射峰的荧光强度；所述1422 为发射波长为422 mn的发射 峰的荧光强度；<formula>formula see original document page 6</formula>所述式(I)中，m=6、 n=6、 R产H、 R2=H、 R3= H、 R4= H、 R5=CH3、 R6=Br。 所述式(I)中，m=6、 n=6、 R产H、 R2=H、 R3=H、 R4=H、 R5=CH2CH3、 R6=I。 本发明提供的检测DNA中是否存在碱基突变的方法，还可依次包括以下步骤1) 制备单链多核苷酸D1，所述Dl与待测DNA的正常序列完全互补；2) 制备单链多核苷酸D2，用荧光素标记序列D2;所述D2能形成发卡DNA，茎 环与D1完全互补，茎干与D1至少有6 nt不互补，且茎干区含有限制性内切酶的 酶切位点；3) 将D1和D2混合，再加入待测DNA，然后加入与D2茎干区的酶切位点相应 的限制性内切酶，再加入下述式(I)的化合物；同时设置用待测DNA的正常序列 组成的DNA片段取代待测DNA的体系作为对照；按照如下方法确定待测DNA是否存在突变若待测DNA反应体系的I424m/I527nm 小于等于对照体系的2.57士0.05，待测DNA存在碱基突变；若待测DNA反应体系的 1424 乂1527，等于对照体系的3.8±0. 11，待测DNA不存在碱基突变；所述1424 为发射 波长为424 nm的发射峰的荧光强度；所述15、为发射波长为527 nm的发射峰的荧 光强度；<formula>formula see original document page 7</formula>所述式(I)中，m=6、 n=6、 R,=H、 R2=H、 R3=H、 R4=H、 R5=CH3、 R6=Br。 所述式(I)中，m=6、 n=6、 R产H、 R2=H、 R3=H、 R4=H、 R5=CH2CH3、 R6=I。 本发明提供的检测DNA中是否存在碱基突变的方法，还可依次包括以下步骤1) 制备单链多核苷酸K1，所述Kl与待测DNA的正常序列完全互补；2) 制备单链多核苷酸K2，所述K2的中间部分具有脱氧核酶活性(其中活性部 分的序列为5， -AGGCTAGCTACAACGA-3' ) ， K2与Kl至少有15 nt完全互补，且包 含有至少10 nt的脱氧核酶(DNAzyme)序列，K2与Kl头尾至少各有6 nt不互补；3) 制备脱氧核酶底物S，用荧光素标记S;底物S的DNA部分与K2完全互补, 底物S中间有包含两个特异的RNA碱基的酶切位点；4) 将K1和K2混合，然后加入底物S，加入待测DNA和下述式(I)的化合物， 同时设置加入由待测DNA的正常序列组成的DNA片段和下述式(I)的化合物的对 照体系，按照如下方法确定待测DNA是否存在突变:若待测DNA反应体系的I424 /I527nm 小于等于对照体系的1. 595±0. 06，待测DNA存在碱基突变；若待测DNA反应体系 的14^/1527 等于对照体系的3. 08±0. 1，待测DNA不存在碱基突变；所述142畅为发 射波长为424 nm的发射峰的荧光强度；所述1527^为发射波长为527 rim的发射峰的 荧光强度。<formula>formula see original document page 7</formula>2 100; R,, R2， R3， R4=CXH2X+1或-0(CXH2X+1), x=l 10; R5=CXH2X+1， x=l 3; R6=Br、 Cl、 I、 CF3C00或CH3C00。所述式(I)中，ra=6、 n二6、 R产H、 R2=H、 R3=H、 R4=H、 R5=CH3、 R6=Br。 所述式(I)中，m=6、 n=6、 R产H、 R2=H、 R3=H、 R4=H、 R5=CH2CH3、 R6=I。 本发明提供的方法克服了现有的检测DNA碱基突变方法步骤繁琐、成本较高、灵敏度低和选择性低等缺点，具有简单、经济、灵敏度高且可靠的优点。 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。


图1为使用G-四聚体DNA检测碱基突变的结果图。 图2为使用发卡结构DNA检测碱基突变的结果图。 图3为使用脱氧核酶DNA检测碱基突变的结果图。
具体实施方式
本发明是通过如下的技术方案实现的首先，合成聚2,7-[9，9-二 (6'-N,N,N- —三甲基溴化胺)己烷-芴]-共- (1， 4-苯)(PFP)。按照参考文献(Stork， M. ; Gaylord， B. S. ; Heeger， A. J. ; Bazan， G. C. ifefer. 2002， 14， 361-366.)合成上述式(I)的阳离子发光共轭聚合物，命名为 PFP。 PFP是一种新型的荧光探针，与小分子的荧光探针相比，它具有高度共轭的分 子结构，由许多重复单元组成，这种结构导致它具有荧光放大的效果，可以高灵敏 的检测到光学信号从而大大提高检测灵敏度。PFP的最大吸收值为380nm，最大发 射峰在427nm。依据F5rster能量转移理论，在一定距离条件下它可以和荧光素发 生能量转移(最大吸收峰为480 nm，最大发射峰为527nm)。荧光素被标记在寡核8苷酸上，带正电荷的PFP和带负电荷的寡核苷酸通过静电相互作用形成复合物。PFP 和标记的荧光素的距离被拉近，从而能量转移发生。由于DNA结构或长度变化对电 荷密度影响，静电作用强度发生变化从而造成能量转移效率的变化。然后，利用PFP和寡聚核苷酸通过静电相互作用形成复合物后和标记的染料发 生能量转移以及DNA的构象变化来检测DNA中的碱基突变。DNA具有多种构象，其中比较常见的有双螺旋结构，另外还有三螺旋结构和特 殊的G-四聚体，发卡式结构等。本发明提供了三种检测方法，方法一主要是基于 DNA的G-四聚体结构到双链的转化影响了从PFP到荧光素再到溴乙锭(EB)的双重 能量转移；方法二主要是利用发卡结构DNA (beacon)的保护和释放，通过加入目 标DNA驱动DNA发生交换，从而释放出限制性内切酶的发卡结构的底物DNA，底物 被酶切后变成短链的荧光素片段降低能量转移效率，由于碱基突变阻碍交换，所以 通过能量转移来检测DNA酶切和交换可以检测到DNA的碱基突变；方法三主要是基 于脱氧核酶(DNAzyme)的保护和释放，通过加入目标DNA驱动DNA发生交换，释 放出脱氧核酶对标记有荧光素的底物S进行酶切，底物被酶切后变成短链的荧光素 片段降低能量转移效率，由于碱基突变阻碍交换，所以通过能量转移来检测DNA酶 切和交换可以检测到DNA的碱基突变。结果证明，以上的三种方法对于DNA的碱基 突变检测具有简单、经济、灵敏度高而且可靠的优点。本发明提供的三种方法，具体如下方法一、利用G-四聚体结构DNA和PFP检测DNA中的碱基突变 本方法主要基于DNA的G-四聚体结构到双链的转化。DNA的G-四聚体结构是一类特殊的构象。 一些富含碱基G的DNA在钾离子或凝血酶存在时可以被诱导形成G-四聚体结构。1) 合成PFP。2) 设计并制备G-四聚体DNA序列M。设计一段DNA序列M， M可以形成G-四聚体结构且与待测DNA的正常序列完全 互补，在M的末端(5'或3')标记荧光素。3) 检测待测DNA中的碱基突变。① 将荧光素标记的M和PFP、 EB混合，加入钾离子或凝血酶DNA， M形成G-四 聚体结构。② 加入待测DNA序列，得到反应体系；同时，在步骤①的混合溶液中，加入与待测DNA等量的正常序列，作为对照体系。对于不含有碱基突变的DNA (即与M完 全互补)，G-四聚体被破坏，双链结构形成，EB嵌入dsDNA;对于含有碱基突变的 DNA (即不能与M完全互补)，突变的碱基会大大影响G-四聚体和双链DNA的平衡。③10min后，在380 nm激发下得到激发光谱。对于不含有碱基突变的DNA，会 发生从PFP到荧光素再到EB的双重能量转移；对于含有碱基突变的DNA，从PFP 到荧光素再到EB的能量转移效率降低，随着突变碱基数的增加，从PFP到荧光素 再到EB的能量转移效率降低幅度增加。所以，若待测DNA反应体系的I6。。 /I422 J、 于等于对照体系的1.5±0.08，待测DNA存在碱基突变；若待测DNA反应体系的 16。，/1422 等于对照体系的2.0±0.07，待测DNA不存在碱基突变。I,为发射波长 为600 nm的发射峰的荧光强度；1422 为发射波长为422 nm的发射峰的荧光强度。此方法中，双链MA嵌入剂溴乙锭(EB)被引入。EB的最大吸收峰在520nm， 最大发射峰为610nm。当加入钾离子或凝血酶DNA形成G-四聚体结构，DNA的电荷 密度增大，造成PFP和荧光素之间的很高的能量转移效率，但由于EB分子不能嵌 入到G-四聚体中，所以不能观察到从荧光素到EB的能量转移。而当与G-四聚体序 列互补的DNA加入后，G-四聚体被破坏而双链结构形成。EB嵌入dsDNA后就会发生 从PFP到荧光素再到EB的双重能量转移。DNA的碱基突变会大大影响G-四聚体和 双链DNA的平衡，通过观察被放大的EB的荧光强度就可以检测DNA的碱基突变。 利用此方法可以实现DNA中碱基突变的检测，而且可被检测的最低DNA浓度可达到 50 nM。因此，本方法可以实现高灵敏度和高选择性检测DNA中的碱基突变。方法二、利用发卡结构DNA和PFP检测DNA中的碱基突变主要是利用发卡结构DNA(beacon)的保护和释放。发卡结构DNA —般含有25 35个核苷酸，含有两部分(1)环区为单链状态， 一般由10 30个核苷酸组成， 用于与目标DNA特异结合；(2)茎干区为双链结构，用于稳定发卡结构。稳定 的发卡结构DNA —般茎干区碱基对的数目应大于8个。1) 合成PFP。2) 设计并制备DNA序列Dl和D2。设计两段DNA序列Dl和D2， Dl与待测DNA的正常序列完全互补；D2为发卡 DNA，且在茎干区含有限制性内切酶的酶切位点，D2的茎环与D1完全互补，D2的 茎干与D1至少有6 nt不互补，用荧光素标记D2;3) 检测待测DNA中的碱基突变。① 将D1和D2混合，破坏D2的发卡结构，形成稳定的dsDNA。② 加入待测DNA，同时，在步骤l的混合溶液中，加入与待测DNA等量的正常 序列，作为对照体系。再加入与D2茎干区的酶切位点相应的限制性内切酶。对于 不含有碱基突变的DNA，则与D2发生交换而形成Dl和待测DNA的dsDNA， D2被释 放，重新形成发卡结构，产生酶切位点，D2的茎干从酶切位点被切断，释放出带有 荧光素的短链DNA片段；对于含有碱基突变的DNA， DNA之间的交换能量禁阻，D2 的酶切位点被D1保护。③ 加入PFP，在380 nm激发下得到激发光谱。对于不含有碱基突变的DNA，由 于短链DNA片段的电荷密度较小，PFP和荧光素之间只有弱的能量转移；对于含有 碱基突变的DNA， PFP和荧光素之间发生较强的能量转移，随着突变碱基数的增加 I424 /I527 逐渐降低，能量转移效率逐渐增大。所以，若待测DNA反应体系的I424 /I527ra 小于等于对照体系的2.57士0.05，待测DNA存在碱基突变；若待测DNA反应体系的 142杨/15^等于对照体系的3.80±0.11，待测DNA不存在碱基突变；所述I娠为发 射波长为424 nm的发射峰的荧光强度；所述1527 为发射波长为527 rnn的发射峰的 荧光强度。利用此方法可以实现高灵敏度和高选择性检测DNA中的碱基突变。目标DNA的 最低检测浓度可以达到75 nM。另外此方法还具有很好的普适性，可以检测多个序 列的DNA。方法三、利用脱氧核酶(DNAzyme)和PFP检测DNA中的碱基突变 主要是基于脱氧核酶的保护和释放。脱氧核酶是利用体外分子进化技术获得的一种具有高效催化活性和结构识别能力的单链DNA片段。本方法中主要选用的是具有RNA切割活性的脱氧核酶。1) 合成PFP。2) 设计并制备DNA序列Kl和K2。设计两段DNA序列Kl和K2， Kl与待测DNA的正常序列完全互补；K2的中间部 分具有脱氧核酶活性(其中活性部分的序列为5' -AGGCTAGCTACAACGA-3， ) ， K2 与Kl至少有15 nt完全互补，且包含有至少10 nt的脱氧核酶(DNAzyme)序列， K2与Kl头尾至少各有6 nt不互补；3) 设计脱氧核酶底物S，底物S的DNA部分与K2完全互补，底物S中间有包含 两个特异的RNA碱基的酶切位点，用荧光素标记S;4)检测待测DNA中的碱基突变。① 将K1和K2混合，形成部分双链，头尾各有小部分的核苷酸不匹配。② 加入底物S，再加入待测DNA、同时在步骤l的混合溶液中加入与待测DNA 等量的正常序列作为对照体系，37'C反应。对于不含有突变碱基的DNA，则与K2 发生交换而形成Kl和待测DNA的dsDNA， K2被释放，与底物S结合，底物S被酶 切释放出标记有荧光素的短链DNA;对于含有突变碱基的DNA， DNA之间的交换能量 禁阻，从而不能释放脱氧核酶K2，底物S不能被切除。③ 加入PFP，在380 nm激发下得到激发光谱。对于不含有突变碱基的DNA，只 能观察到弱的能量转移；对于含有碱基突变的DNA，可以观察到强的能量转移。所 以，若待测DNA反应体系的1424 /152^小于等于对照体系的1. 595±0. 06，待测DNA 存在碱基突变；若待测0嫩反应体系的14^/1527 等于对照体系的3.08±0. 1，待测 DNA不存在碱基突变；所述1424 为发射波长为424 nm的发射峰的荧光强度；所述 152^为发射波长为527 nm的发射峰的荧光强度。利用此方法同样可以实现高灵敏度和高选择性检测DNA中的碱基突变。目标 DNA的最低检测浓度可以达到20 nM。此方法对目标DNA的序列也没有严格的限制， 而且操作更加方便、简单。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所有的标记和未标记的寡聚核苷酸都由上海生工生物工程技术服务有限公司 以及宝生物工程(大连)有限公司合成。本发明使用的紫外光谱仪型号为Jasco V-550型。荧光光谱仪的型号为 Hitachi F-4500,激发光源为氙灯。所用的荧光比色皿为3 mL的一次性聚苯乙烯 比色皿。实验中所用的水都需经过Millipore纯化系统过滤。本发明中的寡聚核苷酸的浓度都是通过检测260nm处的吸收值得到的。实施例1、应用PFP和G-四聚体检测DNA中的碱基突变一、PFP1的合成PFP1的结构如式(II)所示，合成方法如下
向100mL的单口瓶加入50mL甲苯、5. 2克新戊二醇和0. 5克对甲苯磺酸，回 流24小时，蒸除溶剂后硅胶柱分离(洗脱剂二氯甲烷)后得到4. 8克1， 4-苯二 硼酸新戊二酯。'H腿R(400 MHz， CDCU: S (ppm) 7.78他s)， 3. 77(8H，s)， 1. 02(12H， s)。
向25 mL的二口瓶中加入5. 4 raL甲苯和3. 6 mL 2M碳酸钾，鼓入氮气30分 钟后，加入325毫克2，7-二溴-9，9-二(6-溴己基)芴，165毫克1， 4-苯二硼酸新戊 二酯和20毫克四(三苯基膦)钯，于氮气下95。C搅拌反应24小时，冷却后加入氯仿 和水，取氯仿层水洗后用无水硫酸镁干燥，旋蒸浓縮，丙酮沉淀，得到210毫克浅 黄色固体。将固体溶于20毫升二氯甲垸，加入1毫升三甲胺于室温搅拌24小时后 离心，收集沉淀并干燥，得到208毫克聚合物PFP1， #n=3. 5X104。 iH丽R(400MHz， DMSO): S (卯m) 7. 3-8. 0 (IOH， m) ， 2. 9-3. 2 (16H， m) ， 2. 2-2. 3 (4H， m) ， 1. 5-1. 6 (4H， m)， 0. 9-1. 2(30H， m)。
二、 待测样本的制备 合成DNA序列如下
序列1 (无碱基突变DNA序列ssDNAc ) : 5' -CCCTAACCCTAACCCTAACCC-3'; 序列2 (单碱基突变DNA序列ssDNA1NC) : 5， -CCCTAACCCTAACACTAACCC-3，； 序列3 (三个碱基突变DNA序列ssDNA3NC) : 5， -CCCAAACCCAAACCCAAACCC-3'; 序列4 (六个基突变DNA序列ssDNA6NC) : 5' -CCCAATCCCAATCCCAATCCC-3'。
三、 检测序列的碱基突变
1) 设计序列M，用荧光素标记M。
序列M: 5' -FAM-GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG -3，。
2) 在1900 u L离子强度为50 mM的磷酸缓冲溶液(pH=7. 4)中加入100 u L浓 度为1M的KC1，使KC1的终浓度为50 mM。
3) 将在4"C诱导的荧光素标记的M加入步骤2)得到的溶液中，至终浓度为 [G-quadmplex-Fl]=5. 0x10—8M。
4) 将PFP和EB加入步骤3)得到的溶液中，至终浓度为[PFP]=1.25xlO—6M， 重复单元浓度；[EB]=1. 5x10—6 M。
5) 在步骤4)得到的溶液中加入待测DNA，制备反应液，分如下两种情况 ①反应液A:在步骤4)得到的溶液中加入序列1所示的DNA，至终浓度为[ssDNAc]二5. Ox1(TM，即为对照体系甲。
② 反应液B:在步骤4)得到的溶液中加入序列2所示的DNA，至终浓度为 [ssDNA1NC]=5. 0xl0—8M。
③ 反应液C:在步骤4)得到的溶液中加入序列3所示的DNA，至终浓度为 [ssDNA3NC]=5. 0x10—8M。
④ 反应液D:在步骤4)得到的溶液中加入序列4所示的DNA，至终浓度为 [ssDNA6NC]=5, 0x10—8M。
⑤ 反应液E:步骤4)得到的溶液，作为对照乙。 6)荧光光谱的测定
10min后，分别取IO uL步骤5)得到的两种反应液，在380 nra激发下得到 激发光谱。
进行3次重复试验，图中的数据和结果均为平均值。
图1为使用G-四聚体DNA检测碱基突变的结果图；la为反应液A和反应液E 的荧光光谱，实线为反应液A，虚线为反应液E; lb为反应液A、 B、 C和D的FRET 效率柱状图，[ssDNAc] = [ssDNA1NC]= [ssDNA3NC] = [ssDNA6NC] = 5. 0x10—8M。
由图可见，反应液E只能观察到PFP和荧光素的荧光而不能观察到EB的荧光； 反应液A出现了EB的发射峰，发生了从PFP到荧光素再到EB的双重能量转移，且 16。麵/1422 =1. 6±0. 08;反应液B出现从PFP到荧光素再到EB的能量转移， IM。 /I422 =1.2±0.07，效率比反应液A降低了 25%;反应液C出现从PFP到荧光素 再到EB的能量转移，I6Q。 /I422nm=0.8±0.06，效率比反应液A降低了 50%;反应液 D出现从PFP到荧光素再到EB的能量转移，I6。。 /I422nm=0.8±0.04，效率比反应液A 降低了 50%。
实施例2、利用PFP和G-四聚体检测DNA中的碱基突变 一、PFP2的合成<formula>formula see original document page 14</formula>
PFP2的结构如式(III)所示
合成方法如下:向100mL的单口瓶加入50mL甲苯、5. 2克新戊二醇和0. 5克对甲苯磺酸，回 流24小时，蒸除溶剂后硅胶柱分离(洗脱剂二氯甲烷)后得到4.8克l，4-苯二 硼酸新戊二酯。'H NMR(400 MHz, CDC13): S (ppm) 7. 78(4H，s)， 3. 77(8H，s)，
1. 02(12H, s)。
向50mL的单口瓶加入lOmL干燥的四氢呋喃和0. 65克2, 7-二溴芴(郑州太平洋 化源公司)，低温冷却至-78。C后加入2mL 2M丁基锂溶液(Alfa Aesar公司)低温搅 拌1小时，加入1.0克1，6-二碘己烷(北京偶合公司)于室温反应过夜，结束反应。 向反应液加入10mL水和15inL氯仿，分液，有机层经水洗、无水硫酸镁干燥后蒸除 溶剂，硅胶柱分离(石油醚/乙酸乙酯20/1， v/v)得到0. 8克2， 7-二溴-9, 9-二 (6-碘己基)芴。丽R (400 MHz， CDC13): S —) 7. 82 (d， 2H) ， 7. 42 (m， 4H) ， 3. 39 (m， 4H)，
2. 06(m，4H)， 1.67(m，4H)， 1. 22(m，8H)， 0.69(m，4H)。
向25 mL的二口瓶中加入6 raL四氢呋喃和3 mL 2M碳酸钠，鼓入氮气30分 钟后，加入390毫克2，7-二溴-9，9-二(6-碘己基)芴，182毫克1， 4-苯二硼酸新戊 酯和23毫克四(三苯基膦)钯，于氮气下8(TC搅拌反应48小时，冷却后加入氯仿和 水，取氯仿层水洗后用无水硫酸镁干燥，旋蒸浓縮，丙酮沉淀，得到230毫克浅黄 色固体。将固体溶于25毫升二氯甲烷，加入1毫升33%三甲胺醇溶液于室温搅拌 24小时后离心，收集沉淀并干燥，得到222毫克聚合物PFP2， #n = 4.1X104。 丽R(400 MHz， DMSO): S (ppm) 7, 1-8. 0 (IOH， m) ， 3. 2 (4H， m) ， 3, 1 (12H， m) ， 2. 1 (4H， m)， 1. 2(16H， m)。
二、 待测样本的制备 合成DNA序列如下
序列5 (无碱基突变DNA序列ssDNAc ) : 5' -CCAACCACACCAACC-3'; 序列6 (单碱基突变DNA序列ssDNA1NC) : 5'-CCTACCACACCAACC-3'。
三、 检测序列的单碱基突变
1) 设计序列M，用荧光素标记M。 序列M: 5' -FAM—GGTTGGTGTGGTTGG-3，。
2) 在1900 u L离子强度为50 mM的磷酸缓冲溶液(PH=7. 4)中加入100 u L浓 度为1M的KC1，使KC1的终浓度为50 mM。
3) 将在4TH秀导的荧光素标记的M加入步骤2)得到的溶液中，至终浓度为 [G-quadruplex-Fl]=5. 0xl(T8M。
154) 将PFP和EB加入步骤3)得到的溶液中，至终浓度为[PFP] =1.25x101， 重复单元浓度；[EB] = 1. 5xl0—6 M。
5) 在步骤4)得到的溶液中加入待测DNA，制备反应液，分如下两种情况
① 反应液A:在步骤4)得到的溶液中加入序列5所示的DNA，至终浓度为 [ssDNAc，5. 0x10—8M，作为对照体系甲。
② 反应液B:在步骤4)得到的溶液中加入序列6所示的DNA，至终浓度为 [ssDNANC]=5. 0x10—8M。
③ 反应液C:步骤4)得到的溶液，作为对照乙。
6) 荧光光谱的测定
10min后，分别取IO uL步骤5)得到的两种反应液，在380 nm激发下得到 激发光谱。
进行3次重复试验，结果数据为平均值。
反应液C只能观察到PFP和荧光素的荧光而不能观察到EB的荧光；反应液A 出现了EB的发射峰，发生了从PFP到荧光素再到EB的双重能量转移，且 UK 86±0. 05;反应液B出现从PFP到荧光素再到EB的能量转移， 160。 乂1422 =1.56±0.08，效率比反应液A降低了 16%。
实施例3、利用发卡结构DNA和PFP检测DNA中的碱基突变
一、 PFP的合成 同实施例1的步骤一。
二、 待测样本的制备 合成DNA序列如下
序列7 (无碱基突变DNA序列Tc):
5' -GATTGCGGAAAGAAGGTATGAGATAATGTCAC -3，； 序列8 (单碱基突变DNA序列T1NC):
5' -GATTGCGGAAAGAAGGTATGAGATAATATCAC -3'; 序列9 (2个碱基突变DNA序列T)
5' -GATTGCGTAAAGAAGGTATGAGATAATATCAC-3'; 序列10 (3个碱基突变DNA序列T3NC):
5' -GATTGCGTAAAGAAGGTATGAGACAATATCAC-3'; 序列ll (5个碱基突变DNA序列l^c):5' -GATTACGGAAAGTAGGTCTGAGATCATGCCAC-3，。 三、检测序列的碱基突变1) 设计D1和D2，用荧光素标记D2， D1和D2的序列如下 Dl: 5，-GTGACATTATCTCATACCTTCTTTCCGCAATCGGA-3';D2: 5，-FAM-CTGGCCTCCGATTGCGGAAAGAAGGTATGAGATCGGAGGCCAG—3，。2) 将7. 5 uL的D1 (10 uM)和5. 0 u L的D2 (10 yM) 80。C杂化20 min 后降至室温得到双链结构。3) 制备反应液反应液A:将2.5 yL的限制酶缓冲液，1.5 U L的限制酶内切酶HaeIII (10 unit/uL) (NEB公司)，7. 5 y L序列7的DNA (10 uM)和1. 0 uL的Millipore 水一同加入于37'C反应50 min，即为对照体系甲。反应液B:将2.5 PL的限制酶缓冲液，1.5 u L的限制酶内切酶HaeIII (10 unit/uL) (NEB公司)，7. 5u L序列8的DNA (10 u M)禾卩1. 0 nL的Millipore 水一同加入于37。C反应50 min。反应液C:将2.5 PL的限制酶缓冲液，1.5 u L的限制酶内切酶HaeUI (10 unit/uL) (NEB公司)，7. 5 y L序列9的DNA (10 u M)和LO nL的Millipore 水一同加入于37。C反应50 min。反应液D:将2.5 WL的限制酶缓冲液，1.5 U L的限制酶内切酶HaeLII (10 unit/uL) (NEB公司)，7. 5 n L序列10的DNA (10 uM)和1.0 uL的Millipore 水一同加入于37"C反应50 min。反应液E:将2.5 WL的限制酶缓冲液，1.5 u L的限制酶内切酶HaelII (10 unit/uL) (NEB公司)，7. 5 u L序列11的DNA (10 u M)和1.0 uL的Millipore 水一同加入于37"C反应50 min。反应液F:将2.5 ixL的限制酶缓冲液，1.5 w L的限制酶内切酶HaeIII (10 unit/uL) (NEB公司)和l.O u L的Millipore水一同加入于37。C反应50 min, 作为对照乙。反应液G:将2.5 uL的限制酶缓冲液，7.5uL序歹lj7的DNA (10 uM)禾tU.O u L的Millipore水一同加入于37。C反应50 min，作为对照丙。4) 荧光光谱的测定分别取10 u L步骤3)得到的四种反应液，分别加入到2. 0 niL的HEPEs缓冲液(含服PEs 25 mM， pH=8. 0)中，分别加入1.5 u L的PFP (2xl0-3 M)后，在380 nm下激发，检测荧光光谱。进行重复试验三次，图中的数据和结果均为3次试验的平均值。 图2为使用发卡结构DNA检测碱基突变的结果图；2a为反应液A、 B、 F、 G的荧光光谱;2b为反应液A、B、C、D和E的FRET效率柱状图。[Tch [T1NC]=[T2NC]]=[T3NC]]=[T5NC]]=15 nM。结果表明，反应液6的1424 /15^约为0.42±0.05 (平均值土标准差)；反应 液A的1 畅/1527 约为1. 597±0. 107;反应液B的1424 /1527咖约为1. 08±0. 046，比 反应液A降低了 32%;反应液C的1424鬧/15^约为0. 69±0. 046，比反应液A降低了 57%;反应液0的1424 /1527 约为0.503±0.006，比反应液A降低了69X;反应液 E的142畅/1527 , 约为0. 46±0. 01，比反应液A降低了 72%。实施例4、利用发卡结构DNA和PFP检测DNA中的碱基突变一、 PFP2的合成 同实施例2的步骤一。二、 待测样本的制备 合成DNA序列如下序列12 (无碱基突变DNA序列Tc):5' -GATTGCGGAAAGAAGGTATGAGATAATGTCAC -3'; 序列13 (单碱基突变DNA序列Twc):5， -GATTGCGGAAAGAAGGTATGAGATATTGTCAC -3，。三、 检测序列12和序列13的单碱基突变1) 设计Dl和D2，用荧光素标记D2， Dl和D2的序列如下 Dl: 5'-GTGACATTATCTCATA CCTTCTTTCCGCAATCGGA-3';D2: 5'-FAM-CTGGCCTCCGATTGCGGAAAGAAGGTATGAGATCGGAGGCCAG-3'。2) 将7. 5 uL的D1 (10 uM)禾卩5. 0 uL的D2 (10 yM) 80。C杂化20 rain 后降至室温得到双链结构。3) 制备反应液反应液A:将2.5 PL的限制酶缓冲液，1.5 u L的限制酶内切酶HaeIII (10 unit/yL) (NEB公司)，7. 5 ix L序列12的DNA (10 uM)禾B 1.0 uL的Millipore 水一同加入于37 "C反应50min，即为对照体系甲。反应液B:将2.5 "L的限制酶缓冲液，1.5 y L的限制酶内切酶HaeIII (10 unit/uL) (NEB公司)，7. 5 u L序列13的DNA (10 nM)禾卩1.0 uL的Millipore 水一同加入于37 "C反应50 min。反应液C:将2.5 WL的限制酶缓冲液，1.5 u L的限制酶内切酶HaeIU (10 unit/uL) (NEB公司)和1. 0 u L的Millipore水一同加入于37 。C反应50 min， 作为对照乙。4)荧光光谱的测定分别取IO ixL步骤l得到的三种反应液，分别加入到2.0 mL的HEPEs缓冲 液(含HEPEs 25 mM， pH=8.0)中，分别加入1.5 n L的PFP (2x10—3 M)后，在 380 nm下激发，检测荧光光谱。进行重复试验三次，数据结果为3次试验的平均值。反应液C的I424nm/I527nm约为0. 45±0. 04;反应液A的142畅/15》约为1. 65±0. 08; 反应液B的142411 /152711 约为1. 12±0. 045，比反应液A降低了 32%。结果表明，反应 液A的能量转移效率比对照的转移效率降低达3倍。随着突变碱基数的增加 142杨/152^逐渐降低，能量转移效率逐渐增大。对于单碱基突变的DNA可以观察到 非常明显的变化。实施例5、利用脱氧核酶和PFP检测DNA中的碱基突变一、 PFP1的合成 同实施例1的步骤一。二、 待测样本的制备 合成DNA序列如下序列14 (无碱基突变DNA序列Mc): 序列15 (单碱基突变DNA序列Mwc): 序列16 (2个碱基突变DNA序列M2NC) 序列17 (3个碱基突变DNA序列M^c) 序列18 (5个碱基突变DNA序列M5NC)三、 检测序列的碱基突变 1)设计Kl和K2， Kl和K2的序列如下 Kl: 5，-GCTCTCGTTGTAGCTTCACCG-3，； K2: 5， -TACAGCTAATAGGCTAGCTACAACGAGAGC-3'5， -CGGTGAAGCTACAACGAGAGC-3'; 5' -CGTTGAAGCTACAACGAGAGC-3';5， -CGTTGAAGCAACAACGAGAGC-3'; 5， -CGGAGAAGCTTCAACGTGAGC-3，； 5' -CGGAGAAGCTTGAGCGAGTGC—3'。设计底物S，用荧光素标记S， S的序列如下5， -FAM-GCTCrArUATTAGCTGTA -3，。2) 2.0 yL的Kl (10 yM)和2. 0yL的K2 (10 uM)在80。C杂化20 min后 降至室温得到双链结构。3) 制备反应液反应液A:将双链DNA加入到1 mL的HEPEs缓冲溶液(含25 mM HEPEs， 50 mM MgCl2，pH=7. 5)中，然后加入O. 5 uL的底物S (10 uM)和2. 0 u L序列14的DNA (10 uM)，即为对照体系甲。反应液B:将双链DNA加入到1 mL的HEPEs缓冲溶液(含25 mM HEPEs， 50 mM MgCl2，pH=7. 5)中，然后加入O. 5 PL的底物S (10 uM)和2. 0 u L序列15的DNA (10 uM)。反应液C:将双链DNA加入到1 mL的HEPEs缓冲溶液(含25 mM HEPEs， 50 mM MgCUpH二7.5)中，然后加入0.5 uL的底物S (10 u M)和2. 0 u L序列16的DNA (10 uM)。反应液D:将双链DNA加入到1 mL的HEPEs缓冲溶液(含25函HEPEs， 50 mM MgCl2，pH=7. 5)中，然后加入O. 5 yL的底物S (10 uM)和2. 0 y L序列17的DNA (10 uM)。反应液E:将双链DNA加入到1 mL的HEPEs缓冲溶液(含25 mM HEPEs， 50 mM MgCUpH二7. 5)中，然后加入O. 5 yL的底物S (10 wM)和2. 0 u L序列18的DNA (10 uM)。反应液F:将双链DNA加入到1 mL的HEPEs缓冲溶液(含25 mM HEPEs， 50 mM MgCUpH二7.5)中，然后加入0.5 uL的底物S (10 w M)，作为对照乙。4) 荧光光谱的测定将上一步的溶液在37。C诱导1 h，加入IO uL的PFP (0.1函)和3. 0 uL 的Kl (10 uM，为了去除非特异性相互作用)后在380 nm下激发得到荧光光谱。 进行重复试验三次，图中的数据和结果均为3次试验的平均值。 图2为使用脱氧核酶DNA检测碱基突变的结果图；3a为反应液A、 B和F的荧 光光谱；3b为反应液A、 B、 C、 D和E的FRET效率柱状图，[Mc]= [M1NC]=[M2NC]]=[M3NC]]= [M5NC]]=20 nM。结果表明，反应液F的l4、/l527^0.6土0. 10，反应液八的1424 /1527 =1.847±0. 121;反应液B的I424U. 957±0. 035;反应液C的I424nm/I527nm =0. 78±0. 07; 反应液D的I424nm/I527 =0. 71±0. 04;反应液E的UI527 =0. 67±0. 04，可以观 察到非常明显的变化。随着突变碱基数的增加I 4 /I527nm逐渐降低，能量转移效率 逐渐增大。
实施例6、利用脱氧核酶和PFP检测单碱基突变
一、 PFP2的合成 同实施例2的步骤一。
二、 待测样本的制备 合成DNA序列如下
序列19 (无碱基突变DNA序列Mc) : 5'-CGGTGAAGCTACAACGAGAGC-3'; 序列20 (单碱基突变DNA序列Mwc) : 5'- CGGTGTAGCTACAACGAGAGC-3'。
三、 检测序列的单碱基突变
1) 设计Kl和K2， Kl和K2的序列如下 Kl: 5，-GCTCTCGTTGTAGCTTCACCG-3';
K2: 5，-TACAGCTAATAGGCTAGCTACAACGAGAGC -3'。 设计底物S，用荧光素标记S， S的序列如下 5'-FAM-GCTCrArUATTAGCTGTA -3'。
2) 2. 0 u L的Kl (10 uM)和2. 0u L的K2 (10 n M)在80。C杂化20 min后 降至室温得到双链结构。
3) 制备反应液
反应液A:将双链DNA加入到1 mL的HEPEs缓冲溶液(含25 raM HEPEs， 50 mM MgCl2， pH=7. 5)中，然后加入0. 5 "的底物S (10 u M)和2. 0 u L序列19的DNA (10 uM)，即为对照体系甲。
反应液B:将双链DNA加入到1 mL的服PEs缓冲溶液(含25 raM服PEs， 50 mM MgCl2，pH=7.5)中，然后加入0.5 liL的底物S (10M)和2. 0 y L序列20的DNA (10 uM)。
反应液C:将双链DNA加入到1 mL的HEPEs缓冲溶液(含25 mM HEPEs, 50 mM MgCl2,pH=7.5)中，然后加入0.5 "L的底物S (10 uM)，作为对照乙。
4) 荧光光谱的测定
将上一步的溶液在37 。C诱导1 h，加入IO yL的PFP (0.1 mM)和3. 0 y L的K1 (10 "M，为了去除非特异性相互作用)后在380 nm下激发得到荧光光谱。 进行重复试验三次，数据结果为3次试验的平均值。
结果表明，对照乙的1飾/15271 =0. 58±0. 08;反应液A的I424 /I527nm=l. 95±0. 12; 反应液8的14241 /1527^1.02±0.08，比反应液A降低了48X。可以观察到非常明显 的变化。随着突变碱基数的增加I424 /I527 逐渐降低，能量转移效率逐渐增大。序列表
〈110〉中国科学院化学研究所 <120〉一种检测DNA碱基突变的方法
〈130〉CGGNARY81218
<160〉20
<210〉1 〈211>21 <212〉謹 〈213〉人工序列
<400〉1
ccctaaccct aaccctaacc c 21
<210〉2 <211〉21 〈212〉DNA <213〉人工序列
<400>2
ccctaaccct aacactaacc c 21
<210〉3 <211〉21 <212〉DNA 〈213>人工序列
23<400〉3
ccca肪ccc3 sacccaaacc c 21
<210〉4 <211〉21 <212〉DNA <213〉人工序列
<400〉4
cccaatccca atcccaatcc c 21
〈210>5 <211〉15 <212>腿 〈213〉人工序列
<400>5ccaaccacac caacc 15
<210>6 <211〉15 〈212〉DNA <213〉人工序列
〈400〉6
cctaccacac caacc 15
〈210〉7
<211〉32
〈212〉DNA<213>人工序列<400>7gattgcggaa agaaggtatg agataatgtc ac<210>8 <211〉32 〈212〉DNA <213>人工序列<400〉8gattgcggaa agaaggtatg agataatatc ac<210>9 <211>32 <212〉DNA <213〉人工序列<400〉9gattgcgtaa agaaggtatg agataatatc ac<210>10 <211〉32 〈212〉DNA <213>人工序列<400〉10gattgcgtaa agaaggtatg agacaatatc ac 〈210〉1132323232<211〉32〈212〉DNA<213>人工序列<400>11gsttacggaa a_gtsggtctg 3gstc3tgcc etc 32<210>12 〈211〉32 〈212〉DNA 〈213〉人工序列〈400〉12gattgcggaa agaaggtatg agataatgtc ac 32<210>13 <211〉32 <212>腿 <213〉人工序列<400>13gattgcggaa agaaggtatg agatattgtc ac 32〈210>14 〈211〉21 〈212〉DNA <213〉人工序列<400〉14cggtgaagct acaacgagag c 21<210〉15<211〉21<212〉薩<213〉人工序列<400〉15cgttgaagct acaacgagag c 21<210〉16 <211〉21 <212〉薩 <213〉人工序列〈400〉16cgttgaagca acaacgagag c 21〈210>17 <211〉21 <212>画 <213〉人工序列<400>17cggagaagct tcaacgtgag c 21<210>18 <211>21 〈212>腿 <213〉人工序列<400〉18cggagaagct tgagcgagtg c 21〈210〉19 <211〉21 <212〉DNA 〈213〉人工序列<400〉19cggtgaagct acaacg3gag c 21<210〉20 <211〉21 <212〉DNA <213〉人工序列〈400〉20cggtgtagct acaacgagag c 2权利要求
1. 一种检测DNA中是否存在碱基突变的方法，依次包括以下步骤1)用荧光素标记单链多核苷酸M；所述M与待测DNA的正常序列完全互补且可以形成G-四聚体结构；2)使荧光素标记的M形成G-四聚体结构；3)将形成G-四聚体结构的M和溴乙锭混合，加入待测DNA和下述式(I)的化合物，同时设置加入由待测DNA的正常序列组成的DNA片段和下述式(I)的化合物的对照体系，按照如下方法确定待测DNA是否存在突变若待测DNA反应体系的I600nm/I422nm小于等于对照体系的2±0.07，待测DNA存在碱基突变；若待测DNA反应体系的I600nm/I422nm等于对照体系的1.5±0.08，待测DNA不存在碱基突变；所述I600nm为发射波长为600nm的发射峰的荧光强度；所述I422nm为发射波长为422nm的发射峰的荧光强度；id="icf0001" file="S2008101034584C00011.gif" wi="119" he="65" top= "126" left = "45" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>式(I)中，m＝1～10，n＝2～100；R1，R2，R3，R4＝CXH2X+1或-O(CXH2X+1)，x＝1～10；R5＝CXH2X+1，x＝1～3；R6＝Br、Cl、I、CF3COO或CH3COO。
2、 如权利要求l所述的方法，其特征在于所述式(I)中，m=6、 n=6、 R产H、 R2二H、 R:i=H， 、 R4二H、 R5二CH3、 Re二Br。
3、 如权利要求l所述的方法，其特征在于所述式(I)中，m二6、 n=6、 R产H、 R^pH、 R3二H， 、 I 4二H、 R5二CH2CH;j、 Re二I。
4、 一种检测DNA中是否存在碱基突变的方法，依次包括以下步骤1) 制备单链多核苷酸D1，所述D1与待测DNA的正常序列完全互补；2) 制备单链多核苷酸D2，用荧光素标记序列D2;所述D2能形成发卡DNA，茎环 与D1完全互补，茎干与D1至少有6 nt不互补，且茎干区含有限制性内切酶的酶切位点；3)将D1和D2混合，再加入待测DNA，然后加入与D2茎干区的酶切位点相应的 限制性内切酶，再加入下述式(I)的化合物；同时设置用待测DNA的正常序列组成 的DNA片段取代待测DNA的体系作为对照；按照如下方法确定待测DNA是否存在突变若待测DNA反应体系的1424 /1527，小于等于对照体系的2. 57±0. 05，待测DNA存在碱基突变;若待测DNA反应体系的I424nm/I527nm等于对照体系的3. 8±0. 11，待测DNA不存在碱基突变；所述14一为发射波长为424 nm的发射峰的荧光强度；所述1527 为发射波长为527 nm的发射峰的荧光强度；<formula>formula see original document page 0</formula>式(I)中，m=l 10， n=2 100; R!， R2， R3， R4=CxH2x+i或-0(CxH2X+1) ， x=l 10; CxH2x+i， x=l 3; R6=Br、 Cl、 I、 CF3C00或CH3C00。
5、 如权利要求4所述的方法，其特征在于所述式(I)中，m=6、 n二6、 R产H、 I 2二H、 I 3二H， 、 R4二H、 R5二CH3、 R6二Br。
6、 如权利要求4所述的方法，其特征在于所述式(I)中，m=6、 n=6、 RpH、R2二H、 R3二H， 、I 4二H、R5二CH2CH3、 I 6二I。
7、 一种检测DNA中是否存在碱基突变的方法，依次包括以下步骤1) 制备单链多核苷酸K1，所述K1与待测DNA的正常序列完全互补；2) 制备单链多核苷酸K2，所述K2的中间部分具有脱氧核酶活性，K2与K1至少 有15 nt完全互补，而且包含有至少10 nt的脱氧核酶序列，K2与Kl头尾至少各有6 nt不互补；3) 制备脱氧核酶底物S，用荧光素标记S;底物S的DNA部分与K2完全互补，底 物S中间有包含两个特异的RNA碱基的酶切位点；4) 将K1和K2混合，然后加入底物S，加入待测DNA和下述式(I)的化合物， 同时设置加入由待测DNA的正常序列组成的DNA片段和下述式(I)的化合物的对照体系，按照如下方法确定待测DNA是否存在突变若待测0嫩反应体系的1424 /1527，小于等于对照体系的1. 595±0. 06，待测DNA存在碱基突变；若待测DNA反应体系的 142^/15^等于对照体系的3.08±0. 1，待测DNA不存在碱基突变；所述1424 为发射波 长为424 nrn的发射峰的荧光强度；所述15^为发射波长为527 nm的发射峰的荧光强度。式(I)中，m=l 10， n=2 100; Rh R2， R3， R4=CXH2X+1或-0(CXH2X+1)， x=l 10; Re CXH2X+1， x=l 3; R6=Br、 Cl、 I、 CF3C00或CH3C00。
8、 如权利要求7所述的方法，其特征在于所述式(I)中，m=6、 n=6、 R产H、 R2=H、 R3=H， 、 R4=H、 R5=CH3、 R6=Br。
9、 如权利要求7所述的方法，其特征在于所述式(I)中，m=6、 n二6、 RfH、 Rs二H、 I 3二H， 、 R斗二H、 R5二CH2CH3、 I 6二I。
全文摘要
本发明公开了一种检测DNA中碱基突变的方法。本发明提供的检测DNA中碱基突变的方法为首先，合成式(I)的化合物；然后通过式(I)的化合物与单链寡聚核苷酸通过静电相互作用形成复合物后和标记的染料发生能量转移以及DNA的构象变化来检测DNA中的碱基突变。本发明提供的方法克服了现有的检测DNA中碱基突变的方法步骤繁琐、成本较高、灵敏度低和选择性低等缺点，具有简单、经济、灵敏度高且可靠的优点。
文档编号C12Q1/68GK101250590SQ200810103458
公开日2008年8月27日 申请日期2008年4月7日 优先权日2008年4月7日
发明者树 王, 芳 贺 申请人:中国科学院化学研究所