一种超临界CO₂条件下微生物转化制备辅酶Q₁₀的方法

专利名称：一种超临界CO₂条件下微生物转化制备辅酶Q₁₀的方法
技术领域：
本发明涉及一种制备辅酶Qh)的方法，特别涉及一种在超临界C02条件下微生物转化制备辅酶Qu)的方法。
背景技术：
超临界C02作为一种反应和萃取介质，条件温和，有较大的扩散系数，溶解能
力和介电常数对温度和压力敏感，且无毒、不燃、经济，不产生溶剂残留，因此可以作为酶催化反应良好的反应介质。
辅酶Qu)由于其特殊的生理生化功能而被广泛应用于临床、保健等领域，近几年随着对其研究的深入，其应用领域、需求量等都在扩大。目前生产辅酶Qu)的方法主要有组织提取法、化学合成法和微生物发酵及转化法。前两种由于原料和成本条件限制而未被广泛应用，微生物转化法因反应条件温和、速度快且底物无毒无害而备受关注，但不足之处在于易受产物抑制而降低产量。

发明内容
本发明的目的是提供一种制备辅酶Qw的方法。
本发明所提供的制备辅酶Qw的方法，是将粟酒裂殖酵母菌接入含有茄尼醇的培养基中，在温度为25-35°C、压力为5-20MPa的超临界C02的环境中进行发酵，得
到辅酶Q1Q。其中，接入所述培养基的粟酒裂殖酵母菌和所述茄尼醇的配比可以为茄尼醇粟酒裂殖酵母菌的湿菌重=(10-50) rag: lg。
接入所述培养基的粟酒裂殖酵母菌与所述培养基的质量配比可以为粟酒裂殖酵母菌的湿菌重培养基=1:(1-4)。
上述粟酒裂殖酵母菌和所述茄尼醇的配比具体可以为茄尼醇粟酒裂殖酵母菌的湿菌重=10 mg: lg。
上述粟酒裂殖酵母菌与所述培养基的质量配比具体可以为粟酒裂殖酵母菌的
湿菌重培养基=1: 4。
上述培养基可以为任一种可以培养粟酒裂殖酵母菌的培养基。
所述超临界co2的温度具体可以为3rc。
3所述发酵的时间可以为8-24h。所述发酵的时间具体可以为20h。所述发酵结束后，以0.2-0. 5MPa/min的速度卸压。
本发明方法利用超临界C02的扩散系数高及溶解能力良好的特点，以增加辅酶Q^前体——茄尼醇的溶解度，另外，由于辅酶Qu)不易溶于水，在常规发酵条件下克服产物抑制的方法有限，而超临界C02可通过改变温度和压力而具有溶解辅酶Q1Q的能力。因此本发明方法充分利用超临界C02的溶解特性增加茄尼醇的溶解度，有效降低转化过程中的产物抑制作用，且给酵母提供了高厌氧环境，改变了微生物的呼吸链供氧方式，从而促进了辅酶Qm的合成；而且本发明方法中添加了茄尼醇作为辅酶Qu)合成的底物，提高了辅酶Qw合成的速度及产量。实验结果表明，采用本发明方法制备得到的辅酶Qu)产量比一般发酵方法提高60%-162%。


图1为辅酶Q,。标准品HPLC图谱。
图2为样品中辅酶QwHPLC图谱。
具体实施例方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。实施例1、超临界C02条件下微生物转化制备辅酶Qu)一、菌的培养
将粟酒裂殖酵母菌(6: p/^^，购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生
物中心，产品目录号2. 1794)接种到斜面活化培养基上，恒温培养箱中28。C培养24h，再接种到50ml液体活化培养基中，28。C摇床培养18h，摇床转速为200r/min，然后以10%的接种量接种到5个分别盛有100ml发酵培养基的250ral三角瓶中，在200r/min的转速下、28"C摇床培养18h，至对数生长期末期。
斜面活化培养基葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸提物1%， pH6.0，琼脂2%，其余为水；所述百分含量为质量百分含量。
液体活化培养基葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸提物1%， p服.O，其余为水；所述百分含量为质量百分含量。
发酵培养基葡萄糖15g/L，蔗糖15g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏10g/L，MgS041.0g/L ， K2HP04 3H20 1. Og/L ， KH2P041. Og/L，其余为水，pH5. 0。 121°C灭菌15min。
二、 超临界C02条件下利用粟酒裂殖酵母菌制备辅酶Q,。
将步骤一得到的发酵液离心(3000g， 10min)，收集菌体并用质量浓度为0. 85%生理盐水洗涤两遍，离心后称量湿重。(本实验采取的湿重的测定方法为将细胞离心(3000g， 10min)后，倒去上清液后在滤纸上倒置2min后称重。)取一定质量的菌，将其接入4倍于湿菌菌体质量的发酵培养基中，同时加入茄尼醇，使茄
尼醇与菌体的湿菌重配比为茄尼醇菌体湿菌重40mg : lg;然后将反应体系放入超临界C02装置中，调整温度为3rC，压力升至9MPa，保持该压力和温度下转化20h后，以0. 25MPa/min的速度卸压。
以未经超临界C02作用且未添加茄尼醇的转化体系和经超临界C02外场作用但未添加茄尼醇的转化体系作为对照。
三、 辅酶Qw的提取及检测
1、 提取方法步骤二的转化反应结束后，将菌体离心(3000g， 10min)，收集菌体，分离上清，收集的菌体用质量浓度为0.85%的生理盐水洗涤两遍，菌体悬浮于25ml磷酸缓冲液(pH5. 0)30min，加入38 u 1巯基乙醇，于摇床中作用3h(37。C，200rpm)，然后加入蜗牛酶(拜尔迪生物技术公司)作用lh (其中湿菌重与蜗牛酶质量配比为100: 3)，超声波粉碎仪在冰浴条件下破碎细胞(超声条件超声功率为500w，超声60次，超声时间5s，间隔时间6s)，加入等体积(约25ml)石油醚萃取，取上层，用去离子水洗至中性，无水硫酸钠脱水至澄清，氮吹浓縮干燥(37'C水浴)，加入10ml无水乙醇清洗，收集清洗液，4X:冰箱冷析，除去固醇等杂质，过0.45um滤膜，待测。
2、 检测方法色谱柱为Spherisorb C18fe， 150mmX4.6mm， 5ym，色谱柱填充料为十八烷基硅烷键合硅胶，柱温22-23°C。采用无水乙醇水(98: 2)为流动相，流速为lml/min，进样量20 u 1，检测波长为275nm。
标准品辅酶Qu)的保留时间为12. 408min，样品中辅酶Q!。保留时间为12. 039min。标准品和样品的图谱分别如图1和图2所示。
实验设3次重复，结果取平均数。样品中辅酶Qu)的峰面积分别为1066.63、1054.72、 1037.86。结果测得辅酶Qi。产量为0. 41mg/g(湿菌重)，比对照未经超临界C02作用且未添加茄尼醇的方法产量增加了 161.8%，比经超临界C02外场作用但未添加茄尼醇的方法提高了 128. 4%。实施例2、超临界C02条件下微生物转化制备辅酶Q1Q
一、 菌的培养
将粟酒裂殖酵母菌(5: proz^，购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，产品目录号2. 1794)接种到斜面活化培养基上，恒温培养箱中35i:培养20h，再接种到50ml液体活化培养基中，35。C摇床培养24h，摇床转速为250r/min，然后以5%的接种量接种到5个分别盛有100ml发酵培养基的250ml三角瓶中，在250r/min的转速下、35。C摇床培养24h，至对数生长期末期。
斜面活化培养基葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸提物P/。， p朋.5，琼脂2%，其余为水；所述百分含量为质量百分含量。
液体活化培养基葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸提物1%， pH6.5，其余为水；所述百分含量为质量百分含量。
发酵培养基葡萄糖15g/L，蔗糖15g/L，蛋白胨12g/L ，酵母膏12g/L，MgS041.2g/L ， K2HP04 3H20 1. 2g/L ， KH2P041. 2g/L，其余为水，pH5. 5。 121。C灭菌15min。
二、 超临界C02条件下利用粟酒裂殖酵母菌制备辅酶Qh)
将步骤一得到的发酵液离心(3000g， 10min)，收集菌体并用质量浓度为0. 85%生理盐水洗涤两遍，离心后称量湿重。(本实验采取的湿重的测定方法为将细胞离心(3000g， 10min)后，倒去上清液后在滤纸上倒置2min后称重。)取一定质量的菌，将其接入4倍于湿菌菌体质量的发酵培养基中，同时加入茄尼醇，使茄尼醇与菌体的湿菌重配比为茄尼醇菌体湿菌重-50mg : lg;然后将反应体系放入超临界C02装置中，调整温度为35t:，压力升至20MPa，保持该压力和温度下转化24h后，以O. 5MPa/min的速度卸压。
以未经超临界C02作用且未添加茄尼醇的转化体系和经超临界C02外场作用但
未添加茄尼醇的转化体系作为对照。
三、 辅酶Q,。的提取及检测提取及检测方法同实施例1中三所述相同。
实验设3次重复，结果取平均数。样品中辅酶Qu)的峰面积分别为505.95、470.77、 491.11。结果测得辅酶Qw产量为0.20mg/g(湿菌重)，比对照未经超临界C02作用且未添加茄尼醇的方法产量增加了 78. 9%，比经超临界C02外场作用但未添加茄尼醇的方法提高了 62. 6%。实施例3、超临界C02条件下微生物转化制备辅酶Q,。
一、 菌的培养
菌的培养步骤同实施例1中步骤一所述相同。
将粟酒裂殖酵母菌(6: z^o历力，购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生
物中心，产品目录号2. 1794)接种到斜面活化培养基上，恒温培养箱中3(TC培养16h，再接种到50ml液体活化培养基中，25°。摇床培养16h，摇床转速为150r/min，然后以1%的接种量接种到5个分别盛有100ml发酵培养基的250ml三角瓶中，在150r/min的转速下、25。C摇床培养16h，至对数生长期末期。
斜面活化培养基葡萄糖1%，蛋白胨1%，酵母浸提物0.5%， pH5.5，琼脂2%，其余为水；所述百分含量为质量百分含量。
液体活化培养基葡萄糖1%，蛋白胨1%，酵母浸提物0.5%， pH5.5，其余为水；所述百分含量为质量百分含量。
发酵培养基葡萄糖10g/L，蔗糖10g/L，蛋白胨8g/L，酵母膏8g/L， MgS040. 8g/L ， K2HP04.3H20 0. 8g/L ， KH2P04 0. 8g/L，其余为水，pH4. 8。 121。C灭菌15min。
二、 超临界C02条件下利用粟酒裂殖酵母菌制备辅酶Qk)
将步骤一得到的发酵液离心(3000g， 10min)，收集菌体并用质量浓度为0. 85%生理盐水洗涤两遍，离心后称量湿重。(本实验采取的湿重的测定方法为将细胞离心(3000g，10min)后，倒去上清液后在滤纸上倒置2min后称重。)取一定
质量的菌，将其接入l倍于湿菌菌体质量的发酵培养基中，同时加入茄尼醇，使茄尼醇与菌体的湿菌重配比为茄尼醇菌体湿菌重30mg : lg;然后将反应体系放
入超临界C02装置中，调整温度为25。C，压力升至5MPa，保持该压力和温度下转化8h后，以0.2MPa/min的速度卸压。
以未经超临界C02作用且未添加茄尼醇的转化体系和经超临界C02外场作用但未添加茄尼醇的转化体系作为对照。
三、 辅酶Qt。的提取及检测提取及检测方法同实施例1中三所述相同。
实验设3次重复，结果取平均数。样品中辅酶Qw的峰面积分别为588.82、585.55、 549.37。结果测得辅酶Q^产量为0. 21mg/g(湿菌重)，比对照未经超临界C02作用且未添加茄尼醇的方法产量增加了 82. 9%，比经超临界C02外场作用但未添加茄尼醇的方法提高了 62. 6%c
权利要求
1、一种制备辅酶Q10的方法，是将粟酒裂殖酵母菌接入含有茄尼醇的培养基中，在温度为25-35℃、压力为5-20MPa的超临界CO2的环境中进行发酵，得到辅酶Q10。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于接入所述培养基的粟酒裂殖酵 母菌和所述茄尼醇的配比为茄尼醇粟酒裂殖酵母菌的湿菌重=(10-50) nig: lg。
3、 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于接入所述培养基的粟酒裂 殖酵母菌与所述培养基的质量配比为粟酒裂殖酵母菌的湿菌重培养基=1: (1-4)。
4、 根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述粟酒裂殖酵母菌和所 述茄尼醇的配比为茄尼醇粟酒裂殖酵母菌的湿菌重=40 mg: lg。
5、 根据权利要求2、 3或4所述的方法，其特征在于所述粟酒裂殖酵母菌与所述培养基的质量配比为粟酒裂殖酵母菌的湿菌重培养基=1: 4。
6、 根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述超临界C02的温度为31°C。
7、 根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述超临界C02的压力 为暨a。
8、 根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述发酵的时间为8-24h。
9、 根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于所述发酵的时间为20h。
10、 根据权利要求1-9中任一所述的方法，其特征在于所述发酵结束后，以 0. 2-0. 5MPa/min的速度卸压。
全文摘要
本发明公开了一种制备辅酶Q₁₀的方法。本发明所提供的制备辅酶Q₁₀的方法，是将粟酒裂殖酵母菌接入含有茄尼醇的培养基中，在温度为25-35℃、压力为5-20MPa的超临界CO₂的环境中进行发酵，得到辅酶Q₁₀。本发明方法充分利用超临界CO₂的溶解特性增加茄尼醇的溶解度，有效降低转化过程中的产物抑制作用，且给酵母提供了高厌氧环境，改变了微生物的呼吸链供氧方式，从而促进了辅酶Q₁₀的合成；而且本发明方法中添加了茄尼醇作为辅酶Q₁₀合成的底物，提高了辅酶Q₁₀合成的速度及产量。实验结果表明，采用本发明方法制备得到的辅酶Q₁₀产量比一般发酵方法提高60％-162％。
文档编号C12R1/645GK101591685SQ200810114118
公开日2009年12月2日 申请日期2008年5月30日 优先权日2008年5月30日
发明者萍 刘, 孙君社, 霄 肖 申请人:中国农业大学