专利名称：：从牛奶中提取总dna的方法
技术领域：
：本发明涉及奶牛分子生物学
技术领域：
。具体涉及从牛奶样品中纯化体细胞与抽提总DNA的方法。
背景技术：
：获得基因组DNA是进行后续分子生物学研究的基础,寻找合适的DNA提取方法是开展大多数分子生物学实验所面临的第一个问题，目前使用无应激方法获得奶牛DNA是研究者面临的一个重要问题，尤其表现在动物福利方面，主要原因是由于采取血样会造成应激反应，降低奶牛生产性能。当前从奶牛个体获得基因组DNA的样本来源主要有血液、肌肉组织、脏器组织、精液等，这几个样本来源使用常规的提取方法，提取的效果较好。目前利用牛奶作为高质量DNA提取来源，存在技术匮乏问题。当前利用奶样作为来源提取DNA的方法主要有盐析法(田雨，从牛奶中分离DNA方法的建立；乳业科学2006，3:112-113。F.d'Angelo，A.Santillo,A.Sevi,andM.Albenzio(2007)采用盐析法提取羊奶总DNA(ASimpleSalting-OutMethodforDNAExtractionfromMilkSomaticCells:InvestigationintotheGoat基因.J.DairySci.90:3550-3552).)和SDS/酚法(E.LIPKIN，ANNESHAL0M，H.KHATIB,M.SOLLER，andA.FRIEDMANN(1993).MilkasaSourceofDeoxyribonucleicAcidandasaSubstrateforthePolymeraseChainReaction.JDairySci76:2025-2032),都是先得到体细胞，然后再用相应的试剂消化抽提。就目前的技术，得到的奶样DNA在纯度和浓度都相对较低，闪此更加需要改进方法，已达到获得较好的奶样DNA样品。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，建立一种从牛奶中抽提总DNA的方法，以达到快速、经济、方便的效果，适用于奶牛分子生物学的技术操作。本发明通过以下技术方案实现—种从牛奶中提取总DNA的方法，其特征在于以下步骤1、一种从牛奶中提取总DNA的方法，其特征在于以下步骤1)采样前准备用碘酒擦洗奶牛乳头，用干净温水布擦干乳头上的碘酒，放弃挤出的前2-3把奶，之后用挤奶器或者人工挤奶方法获取奶样；2)采样预先在离心管中加入lral体细胞闹定液和2(m重铬酸钾0.5ral作为防腐剂，将采取的奶样装入离心管至50ml，于2500转/分，4X:离心30分钟3)弃去步骤2)离心管的上层乳脂和中间层乳液，保留其底部沉淀，向底部加lml灭菌磷酸缓冲液，将底部沉淀捶打悬浮并转移至1.5ral的离心管中，在3500转/分，常温(20-下离心10分钟，弃去上层液体，保留底部沉淀4)向步骤3)的离心管中加入灭菌的磷酸缓冲液悬浮沉淀，用振荡器振荡直到沉淀完全悬浮为止，然后在1000转/分，常温下离心10分钟5)离心后将上清弃去，加乳化剂150ixl，再加灭菌的磷酸缓冲液1350wl，用振荡器振荡至沉淀完全悬浮，401C恒温水浴处理5-10分钟脱去体细胞周围的乳脂；6)水浴后，在3500转/分，常温下离心10分钟，离心后弃上清，加磷酸缓冲液lral悬浮沉淀，将混合液转移至1.5ml的离心管中，于12000转/分离心10分钟使体细胞沉淀，将得到的体细胞置-20X:冻存，或者直接将所述的体细胞进行DNA提取；7)向步骤6)存有体细胞的l.5ml离心管中加入裂解混合液I600ul和裂解混合液II150u1,振荡使其底部沉淀至完全悬浮，置于56"C水浴锅过夜消化，得到消化产物；8)对步骤7)的消化产物加入等体积的无水乙醇，12000转/分离心沉淀，弃掉上面的乙醇，然后分别加M的95%、75%、70%乙酵进行梯度洗涤，分别弃去上层的乙酵，在常温T^发乙醇5分钟，得到DNA粗品；9)将步骤8)得到的DNA粗品加500u1去离子灭菌水使其溶解沉淀，再加两倍体积的pH为8.0的Tris饱和酚溶液进行抽提，来回颠倒10分钟，12000转/分，常温卜'离心10分钟，得到上清液10)将步骤9)的上清液转移到另一个1.5ml离心管中，来冋颠倒10分钟，按体积比为25:24:1加入两倍体积的酚氣仿异戊醇，在12000转/分，抽提10分钟，得到上清液11)将步骤10)的上清液转移到另一个1.5ml离心管中，按体积比为24:1加入两倍体积氯仿异戊醇，来冋颠倒10分钟，12000转/分，抽提10分钟，得到上清液；12)将步骤11)的上清液转移到另一个1.5ml离心管中，加入1/10体积的3M/L，pH为5.2的NaAc及2倍体积的预冷过的无水乙醇，来回摇晃离心管，丁一20"C放置30分钟；再于12000转/分，25"下离心10分钟，小心倒掉上层无水乙醇，得到DNA闩色沉淀；13)加入70%的乙醇lml,洗涤步骤12)所述的DNA白色沉淀，于常温下12000转/分离心10分钟，小心弃去乙醇，在常温下挥发残留乙醇，加入的50-100nl三(羟甲基)氨基甲烷-乙二胺四乙酸(Tris-EDTA/TE)过夜溶解DNA,得到DNA纯品；其中，步骤2)所述的体细胞固定液配制如下将35-40%甲醛9.4ml定溶于100ml蒸馏水中；步骤5)所述的乳化剂配制如下在1L乳化剂中90%的聚乙二醇辛基苯基醚(triton-x100)20ml，95%乙醉125ml，0.9g/lNaCl溶液肪5ml:步骤7)所述的裂解混合液I配制如下混合液I:隨1M/L，Tris-Cl0.5M/L，EDTA-Na0.5M/L,调pH至7.5-8.0:步骤7)所述的裂解混合液n配制如下20%十二烷基硫酸钠40w1，20mg/ml的蛋白酶K20u1，乳化剂90u1;步驟13)所述的Tris-EDTA/TE溶液配制如下分别取pH为8.0的1M/LTris-Cl2ml和0.5M/LEDTA0.4ml,将其两种溶液混合均匀，加蒸馏水定容至200ml,调pH至8.0。步骤3)、4)、5)和6)所述的磷酸缓冲液配制如下分别称取NaCl8g,KCL0.2g，N&HPOh1.44g,肌POi0.24g，将各种物质溶解于800ml蒸馏水中，调pH至7.4，加蒸馏水定容至1L。2、《
发明内容》l中所用的牛奶样品是加防腐剂后24小时以内的奶样。本发明的有益效果是本发明对现有技术的贡献主要体现在以下方面本发明在体细胞纯化中加入体细胞固定液、防腐剂和乳化剂，体细胞固定液有效地使乳中的体细胞固定在乳液中，防腐剂可以解决天气炎热时期样品的短时间(24小时内)保存，乳化剂使离心后体细胞周围的乳脂经过40X:恒温5-10分钟而脱去。尽管奶中的体细胞经过纯化，但是其细胞膜周围还有带有其他物质，因此在裂解细胞时，再次添加乳化剂去除体细胞周围乳脂，提高裂解液部分试剂的浓度和使用莆，使体细胞破解更加彻底，以获得较多的DNA。在过夜消化后经过酒精浓度梯度洗涤沉淀，有效的将其中的总DNA以及部分变性后蛋白质物质彻底分离出来，同时也可以帮助清洗DNA，去除杂质。由于乳中蛋白质含量较高，肉此本发明采取两倍体积的酚、氯仿/异戊醇和氯仿溶液对样品混合液进行了单次抽提，而非进行等体积重复抽提的常规思路，有效地节约了时间，同时提髙了抽提效果。本方法与常规方法(苯酚法)提取的奶牛血液基因组DNA的效果比较后，发现效果一样，可以利用本发明技术将奶样作为提取总DNA的来源。并且利用G冊(生长激素受体)基因进行PCR扩增进一步验证所提取的DNA，结果发现奶样来源DNA模板扩增的结果与血液来源DNA模板扩增结果相同，所以从根本上证明了奶样所提取DNA可以用于分子生物学研究，而且本发明技术也是切实可行的。图l:是使用本发明方法提取奶样总DNA和利用常规方法提取血样总咖A凝胶电泳结果间比较图中泳i!M为100bpladderMarker,1、2、3为血样提取总DNA,4、5、6为奶样提取总DNA，100bpladderMarker购自广州东盛生物科技有限公司；图2:应用PCR扩增fiffl基因第九外显子凝胶结果图中泳道MMarkerI，1、2、3、4、5以奶样DNA模板扩增fflS"第9外显子片段，6、7、8、9为以血样DNA模板扩增GfflP第9外显子片段，10为阴性对照。MarkerI购自广州东盛生物科技有限公司。具体实施例方式实施例l1、总DNA提取，包括从牛奶中总DNA的提取和奶牛血液中总DNA的提取；(1)奶样总DNA的提取，步骤如下l)采样前准备用碘酒擦洗奶牛乳头，用干净温水布擦干乳头上的碘酒，放弃挤出的前2-3把奶，之后用挤奶器或者人工挤奶方法获取奶样2)采样预先在离心管中加入lml体细胞同定液和2(m重铬酸钾0.5ral作为防腐剂，将采取的奶样装入离心管至50ml，于2500转/分，4"C离心30分钟3)弃去步骤2)离心管的上层乳脂和中间层乳液，保留其底部沉淀，向底部加lml灭菌磷酸缓冲液，将底部沉淀捶打悬浮并转移至1.5ml的离心管中，在3500转/分，常温下离心10分钟，弃去上层液体，保留底部沉淀；4)向步骤3)的离心管中加入灭菌的憐酸缓冲液lml，悬浮沉淀，用振荡器振荡直到沉淀完全悬浮为止，然后在1000转/分，常温下离心10分钟；5)离心后将上清弃去，加乳化剂150U1,再加灭菌的磷酸缓冲液1350nl，用振荡器振荡至沉淀完全悬浮，401C恒温水浴处理5-10分钟脱去体细胞周围的乳脂；6)水浴后，在3500转/分，常温下离心10分钟，离心后弃上淸，加磷酸缓冲液lml悬浮沉淀，将混合液转移至1.5ml的离心管中，于12000转/分离心10分钟使体细胞沉淀，将得到的体细胞置-201C冻存，或者直接将所述的体细胞进行DNA提取；7)向步骤6)存有体细胞的1.5ml离心管中加入裂解混合液I600ul和裂解混合液ni50ul，振荡使其底部沉淀至完全悬浮，置于56TC水浴锅过夜消化，得到消化产物；8)对步骤7)的消化产物加入等体积的无水乙醇，12000转/分离心沉淀，弃掉上面的乙醇，然后分别加lral的95%、75%、7096乙醇进行梯度洗涤，分别弃去上层的乙醇，在常温下蒸发乙醇5分钟，得到DM粗品；9)将步骤8)得到的DNA粗品加500u1去离子灭菌水使其溶解沉淀,再加两倍体积的pH为8.0的Tris饱和酚溶液进行抽提，来回颠倒10分钟，12000转/分，常温下离心10分钟，得到上清液10〉将步骤9)的上清液转移到另一个1.5ml离心管中，来回颠倒10分钟，按体积比为25:24:l加入两倍体积的酚氯仿异戊醇，在12000转/分，抽提10分钟，得到上清液11)将步骤lO)的上清液转移到另一个1.5ml离心管中，按体积比为24:l加入两倍体积氯仿异戊醇，来回颠倒10分钟，12000转/分，抽提10分钟，得到上淸液12)将步骤11)的上清液转移到另一个1.5ml离心管中，加入1/10体积的3M/L，pH为5.2的NaAc及2倍体积的预冷过的无水乙醇，来冋摇晃离心管，于-20X:放置30分钟再于12000转/分，251C下离心10分钟，小心倒掉上层无水乙酵，得到DNA白色沉淀13)加入70%的乙醇lml，洗涤步骤12)所述的DNA白色沉淀，于常温下12000转/分离心10分钟，小心弃去乙醇，在常温下挥发残留乙醇，加入的50-100nl三(羟甲基)氨基甲烷-乙二胺四乙酸(Tris-EDTA/TE)过夜溶解DNA，得到DNA纯品；其中，步驟2)所述的体细胞固定液配制如下将35-40%甲醛9.4ml定溶于100ml蒸馏水中步骤5)所述的乳化剂配制如下在1L乳化剂中90%的triton-x10020ml,95%乙醇125ml，0.9g/lNaCl溶液855ml;步骤7)所述的裂解混合液I配制如下混合液I:NaCl1M/L,Tris-Cl0.5M/L,EDTA-Na0.5M/L,调pH至7.5-8.0;步骤7)所述的裂解混合液n配制如下20%十二烷基硫酸钠40P1，20mg/ml的蛋A酶K20u1，乳化剂90w1;步骤13)所述的Tris-EDTA溶液配制如下分别取pH为8.0的1M/LTris-Cl2ml和0.5M/LEDTA0.4ml,将其两种溶液混合均匀，加蒸馏水定容至200ml,调pH至8.0。步骤3)、4)、5)和6)所述的磷酸缓冲液配制如下分别称取NaCl8g,KCL0.2g，N&HPO,1.44g，KItJU0.24g,将各种物质溶解于800ml蒸馏水中，调pH至7.4，加蒸馏水定容至1L。(2)奶牛血液中提取总DNA，具体方法参考《分子克隆实验指南》第三版，J.萨姆布鲁克,D.M,拉塞尔著，黄培唐等译。2、奶样和奶牛血液DNA提取结果进行对比检测检测方法制备1.29t琼脂糖凝胶，吸取1.5nlDNA样品，加入lyl上样缓冲液，在100V稳压下电泳15分钟，电泳完毕，置凝胶于紫外透射仪下观测，以100bpladder作为参照，检测结果见附图l.从图l可以看出，所提取的奶样DNA片段人小与从奶牛血液提取的DNA—样，带型整齐一致，表明所提取的奶样DNA纯度较高，没有明显拖尾及弥散现象，表明提取的DNA完整性比较好。其中，步驟2中所述的上样缓冲液的配制如下4.1796溴酚兰，4.17%二甲苯青，2.596Ficoll聚蔗糖实施例2本实例从湖北省武汉市武汉惠尔康扬子江乳业有限公司武湖牧场随机采取了5头奶牛的新鲜奶样，按照本发明的方法提取奶样中的总DNA,取4nL奶样DNA稀释50倍后，在Beck咖n-DU800型紫外分光光度计上测定OD靴湖值和DNA浓度。所采用的浓度计算公式为A260+稀释倍数+50ug/ul。得到如表1所示的数据表l奶样DNA纯度及浓度測定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>从表1可以看出，DNA纯度OD2抑/28o值在1.8-2.0范围之内，其DNA纯度符合要求。浓度在个体之间差异突出，原因是由于不同个体奶样中所含体细胞不同所致。实施例3PCR检测DNA提取和纯化效果本实例利用牛奶提取的总DNA和血液提取的总DNA作为PCR模板扩增生长激素受体(fiflRO基因第9外显子，对比检测扩增效果。1、引物序列正向引物5，-TAGGAGTTCCTTTTAGAGGATAGGTGC-3，反向引物5，-GCCTTGTGGAGAAGTTGACAAA-3，所用引物参考文献BlottS,KimJJ,MoisioS,etal.MolecularDissectionofaQuantitativeTraitLocus:APHenylalanine-to-TyrosineSubstitutionintheTransmembraneDomainoftheBovineGrowthHormoneRec印torIsAssociatedWithaMajorEffectonMilkYieldandComposition.J.Genetics,2003,163:253~266。2、PCR反应体系总体积为10n1的PCR反应体系中分别加入ddH:O7,2ia110*PCRbufferl.Ow110mmol/LdNTPs0.3ul2.5UTaq酶0.2ul50mmol/LMg2.0.4u1100ng/ul止向引物0.2ul100ng/nl反向引物0.2u1DNA模板0.5"1总体积10.0w13、PCR反应程序94"预变性5min,接着94T变性30s、59.7TC退火30s、72iC连接30s循环35次，最后72TC延伸5rain,161C保温5min。以提取的奶样和血样DNA为模板进行PCR反应，扩增GfflP基肉第九外显子,其扩增产物片段大小为307bp。所扩增的fflW基因第九外显子序列如下TAGGAGTTCCTTTTAGAGGATAGGTGCAATTTTAGTTTTGAAAAGAAAGAAAAAAGMGAGAATTTTTGTGAGGTTGGGCCAGGTCACATGTTGACATTTTGAAAATGAGAATGTAACAAGGTCACATCAGACCATTTTTCACAGGGGTGACTAATGGGTTTTTTCCCCTCTTTGTCTTTCAGCCACACCAGCTTTCCTTGTCAGAGCATCTCAGAGTCTGCAGATACTATATCCAGTCCTAGAGACAAGTAAGAATTTCAGTCCTTTTTCTGCCTTTGGCGATAATGTTCAGATTTTACTGCAGTTCAAGCTACTGTTCTTACTCTGTTTTATTTAGGATATGGTAACTGGATGAATTAATMCTGAAATTGTAGGGGCAAACTAAAAAAATTTTTTrnTCAGAATTTGTCAACTTCTCCACAAGGC4、PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测检测方法制备l.2%的琼脂糖凝胶，吸取5ulPCR产物，加入lul上样缓冲液(与实施例l步骤2中所述的相同)，在100V稳压下电泳15分钟，电泳完毕，置凝胶于紫外透射仪下观测，以MarkerI作为参照，进行PCR产物鉴定，检测结果见附图2。以本发明提取的奶样DNA为模板，PCR扩增产物片段的大小是307bp,由图2所示，明显可以证明奶样DNA可以成功扩增出fiffl基因第9外显子，扩增效果和以血样DNA为模板扩增结果一样。表2本发明所涉及英文縮写的说明<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>权利要求1、一种从牛奶中提取总DNA的方法，其特征在于以下步骤1)采样前准备用碘酒擦洗奶牛乳头，用干净温水布擦干乳头上的碘酒，放弃挤出的前2-3把奶，之后用挤奶器或者人工挤奶方法获取奶样；2)采样预先在离心管中加入1ml体细胞固定液和20％重铬酸钾0.5ml作为防腐剂，将采取的奶样装入离心管至50ml，于2500转/分，4℃离心30分钟；3)弃去步骤2)离心管的上层乳脂和中间层乳液，保留其底部沉淀，向底部加1ml灭菌磷酸缓冲液，将底部沉淀捶打悬浮并转移至1.5ml的离心管中，在3500转/分，常温下离心10分钟，弃去上层液体，保留底部沉淀；4)向步骤3)的离心管中加入灭菌的磷酸缓冲液1ml，悬浮沉淀，用振荡器振荡直到沉淀完全悬浮为止，然后在1000转/分，常温下离心10分钟；5)离心后将上清弃去，加乳化剂150μl，再加灭菌的磷酸缓冲液1350μl，用振荡器振荡至沉淀完全悬浮，40℃恒温水浴处理5-10分钟脱去体细胞周围的乳脂；6)水浴后，在3500转/分，常温下离心10分钟，离心后弃上清，加磷酸缓冲液1ml悬浮沉淀，将混合液转移至1.5ml的离心管中，于12000转/分离心10分钟使体细胞沉淀，将得到的体细胞置-20℃冻存，或者直接将所述的体细胞进行DNA提取；7)向步骤6)存有体细胞的1.5ml离心管中加入裂解混合液I600μl和裂解混合液II150μl，振荡使其底部沉淀至完全悬浮，置于56℃水浴锅过夜消化，得到消化产物；8)对步骤7)的消化产物加入等体积的无水乙醇，12000转/分离心沉淀，弃掉上面的乙醇，然后分别加1ml的95％、75％、70％乙醇进行梯度洗涤，分别弃去上层的乙醇，在常温下蒸发乙醇5分钟，得到DNA粗品；9)将步骤8)得到的DNA粗品加500μl去离子灭菌水使其溶解沉淀，再加两倍体积的pH为8.0的Tris饱和酚溶液进行抽提，来回颠倒10分钟，12000转/分，常温下离心10分钟，得到上清液；10)将步骤9)的上清液转移到另一个1.5ml离心管中，来回颠倒10分钟，按体积比为25∶24∶1加入两倍体积的酚∶氯仿∶异戊醇，在12000转/分，抽提10分钟，得到上清液；11)将步骤10)的上清液转移到另一个1.5ml离心管中，按体积比为24∶1加入两倍体积氯仿∶异戊醇，来回颠倒10分钟，12000转/分，抽提10分钟，得到上清液；12)将步骤11)的上清液转移到另一个1.5ml离心管中，加入1/10体积的3M/L，pH为5.2的NaAc和2倍体积的预冷过的无水乙醇，来回摇晃离心管，于-20℃放置30分钟；再于12000转/分，25℃下离心10分钟，小心倒掉上层无水乙醇，得到DNA白色沉淀；13)加入70％的乙醇1ml，洗涤步骤12)所述的DNA白色沉淀，于常温下12000转/分离心10分钟，小心弃去乙醇，在常温下挥发残留乙醇，加入的50-100μl三(羟甲基)氨基甲烷-乙二胺四乙酸过夜溶解DNA，得到DNA纯品；其中，步骤2)所述的体细胞固定液配制如下将35-40％甲醛9.4ml定溶于100ml蒸馏水中；步骤5)所述的乳化剂配制如下在1L乳化剂中90％的聚乙二醇辛基苯基醚(triton-x100)20ml，95％乙醇125ml，0.9g/lNaCl溶液855ml；步骤7)所述的裂解混合液I配制如下混合液INaCl1M/L，Tris-Cl0.5M/L，EDTA-Na0.5M/L，调pH至7.5-8.0；步骤7)所述的裂解混合液II配制如下20％十二烷基硫酸钠40μl，20mg/ml的蛋白酶K20μl，乳化剂90μl；步骤13)所述的Tris-EDTA溶液配制如下分别取pH为8.0的1M/LTris-Cl2ml和0.5M/LEDTA0.4ml，将其两种溶液混合均匀，加蒸馏水定容至200ml，调pH至8.0。步骤3)、4)、5)和6)所述的磷酸缓冲液配制如下分别称取NaCl8g，KCL0.2g，Na2HPO41.44g，KH2PO40.24g，将各种物质溶解于800ml蒸馏水中，调pH至7.4，加蒸馏水定容至1L。2、根据权利要求l所述的的方法，其特征在于，所用的牛奶样品是加防腐剂后24小时以内的奶样。3、权利要求l所述的方法在奶牛分子生物学操作中的应用。全文摘要本发明属于奶牛分子生物学技术研究领域，具体涉及奶牛总DNA制备
技术领域：
。公开了一种从牛奶中提取总DNA的方法。针对奶牛属于经济性动物，为了避免因采血和采取活体奶牛组织而引起的应激，克服提取奶样总DNA含有较高的蛋白质污染障碍等问题，提出了更方便的获取DNA来源，研制出从纯化奶样体细胞到提取高质量DNA的关键技术，通过实验制备出纯化奶样体细胞的试剂和提取DNA的裂解混合液，之后先用不同酒精浓度梯度洗涤，再用酚法抽提去除蛋白质和多糖等其他物质，最后用无水乙醇洗涤，晾干后溶于TE。本发明采样简单方便，抽提的总DNA样品质量较高；本方法经济、稳定、方便，为奶牛的分子生物学的应用提供了新的方法。文档编号C12N15/10GK101338311SQ20081011582公开日2009年1月7日申请日期2008年6月27日优先权日2008年6月27日发明者张军伟,易建明申请人:华中农业大学