专利名称：：小立碗藓抗低温胁迫基因PpDBF2及其蛋白和载体的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物基因工程领域，具体地，本发明涉及一种小立碗藓抗低温胁迫基因/^Z^/^及其编码的蛋白质、含有该基因的载体。
背景技术：
：低温、干旱、高盐是限制植物生长发育、地理分布、形态建成等的重要环境胁迫因素。这些胁迫因素作用的结果均导致植物细胞失水，影响植物细胞的渗透压，进而影响植物正常的生理代谢，严重时导致植物的死亡。通过对一些模式植物的研究发现这三种胁迫因素诱导表达的功能蛋白及转录因子相互交差，因此，寻求同时具有忍耐低温、干旱、高盐胁迫的绿色植物来研究植物的非生物胁迫极有必要。对苔藓植物的基础研究标明苔藓植物是极地低温度环境的先锋植物之一，同时它也分布在极端干旱的沙漠。在漫长的生物进化历程中，苔藓植物形成了一套独特的适应低温干燥等恶劣环境的机制。对小立碗藓非生物胁迫研究发现(Frank等，2005)，与其他高等植物相比，小立碗藓(州j^coyzitre7^paz^s)可以忍耐极端的生态环境。如，拟南芥在100mM的NaCl处理下即受到伤害(Sunkar等，2003)，而小立碗藓可以忍耐350mM的NaCl溶液，在缓慢的逐渐提高的盐处理条件下，小立碗藓可以忍耐600mM的NaCl胁迫。500mM的山梨醇处理三天后，小立碗藓仍可以幸存。当小立碗藓失水92%时仍可恢复正常生长发育。在脱水、盐渍和渗透胁迫条件下，Frank等(2003)分析鉴定了一系列上调基因，其编码的蛋白主要有胆碱脱氢酶(cholinedehydrogenase)、甜菜碱(glycinebetaine)、三氢吡咯羧酸盐(delta11-pyrroline-5-carboxylate)、超氧化物歧化酶(superoxide3disrautase，SOD)、鈣依赖蛋白激酶(calcium-dependentproteinkinase)、促分裂素原活化蛋白激酶(MAPkinase)等。在0。C低温胁迫七天后小立碗藓仍可恢复生长(Minami等，2005)，且在冷驯化过程中激活了LEA(late-embryogenesis-abundant)蛋白的转录，提高了其冰冻耐受能力。因此从苔藓植物中克隆抗逆相关基因并进一步通过转基因等技术应用于提高农作物的抗逆性是目前研究的热点之一。
发明内容为了解决上述问题提出并完成了本发明。本发明的目的是提供高效的抗低温胁迫相关基因。本发明的另一目的是提供上述基因编码的蛋白质。本发明的再一目的是提供含有上述基因的载体。具体地，本发明的发明人将培养至15叶左右的小立碗藓茎叶体在O'C下经过不同时间的处理与非处理小立碗藓茎叶体组成差异材料，通过cDNA-AFLP技术得到差异表达的EST，随后在分子水平进行表达分析或蛋白质水平的分析，挑选出了一种具有显著抗逆特性的基因——小立碗藓抗逆基因Pp/^尸么基因/^"5/^的碱基序列如SEQIDNo.1所示，其cDNA序列如SEQIDNo.2所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示；在本发明的完成过程中，还提供了包含上述基因的载体、以及表达该基因的转基因细胞系。本发明获得的基因具有高效的抗逆性。通过常用的基因工程技术，可以利用该基因培育出优质的转基因农作物，从而提高农作物的抗逆性。图1为/^朋/^基因的cDNA-AFLP图谱，其中，Maker:分子量标记；1、未驯化的24小时的材料；2、未驯化的12小时的材料；3、冷驯化的24小时的材料；4、冷驯化的12小时的材料。图2为尸pZfiPi"基因的Real-timeRT-PCR相对表达量变化图。具体实施例方式1、小立碗藓的培养及冷胁迫处理将小立碗藓培养至15叶左右，移入0。C处理0、3、6、12、24、48、72小时，分别取材用于cDNA-AFLP分析。附小立碗藓培养基配方及制备大量元素Ca(N03)2■FeS047H20MgS047H200.8g/L0.0125g/L0.25g/LCuS045H20ZnS047H20H3B03MnCl24H20CoCl26H20KINa2Mo042H20Glucose酒石酸铵磷酸盐缓冲液0.055mg/L0.055mg/L0.614mg/L0.389mg/L0.055mg/L0.028mg/L0.025mg/L5g/L0.5g/Llml/L微量元素配制成1000X母液，4'C存放。固体基本培养基，加入浓度为0.8%琼脂粉。磷酸缓冲液的配制取25gKH2P04溶解于100ml蒸馏水，用4MKOH调整pH7.0，4'C存放。2、cDNA-AFLP分析cDNA-AFLP方法参照Christian,1998。1)小立碗藓RNA提取(TE3D法)和DNaseI处理52)mRNA的分离mRNA从总RNA中分离，按照Promega公司试剂盒PolyATractmRNAIsolationsystem介绍的方、法进《亍。3)cDNA的合成cDNA按照TaKaRa公司试剂盒cDNASynthesisKit(M-MLVVersion)介绍的方法进行。4)双酶切采用EcoRI和Msel两种限制性内切酶对cDNA进行双酶切。模板cDNA(200ng/n1)125u1缓冲液(10X)2ulEcoRI5U/u11y1Msel5U/ulltilddH2014.75li1总体积20ul混匀离心，37°C酶切至少3个小时，最好过夜直至cDNA被完全酶切；酶切完全后，反应混合物置65""C加热15min,使限制性内切酶失火，之后将反应管置冰上冷却；1.5%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果,呈现均匀弥散为较好酶切效果。5)接头连接采用EcoRIadaptor和Mseladaptor两种接头连接，所用接头见表2.1。酶切反应液20ul缓冲液(10X)2HiT4-连接酶(10U/u1)0.lulATP(lOmM)0.2til6EcoRI接头50pmol/ulMsel接头50pmol/iUddH20总体积-<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>混合离心，37。C至少连接3小时，-20。C可长期保存。6)预扩增以EO和MO为引物做预扩增，所用引物见表2.1。加入以下试剂于反应管中:模板DNA(连接反应液)缓冲液(10X)MgCl2(25mM)EcoRI引物(E0，50ng/ix1)Msel引物(MO，50ng/u1)Taq酶(5U/u1)dNTP(10mM)H20总体积PCR反应程序94°C、3min;94°C环；68°C、10min;4'C保存。取5ul预扩增产物加入95ulTE稀释，其余扩增产物-2(TC保存。表2.1:cDNA-AFLP实验的接头序列和预扩增、选择性扩增引物序列2.0u12.On11.2u10.6u10.6u10.2u10.2u113.2u120u130s，56°C、30s，72°C、lrain，15个循<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>7)选择性扩增以El、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8和Ml、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8为引物做选择性扩增，所用引物见表2.1。加入以下试剂于反应管中模板DNA(预扩稀释物)5.0ul缓冲液(10X)2.0"1MgCl2(25mM)L2uld證(10mM)0.2iilEcoRI引物(Ex，50pmol/ul)0,6ulMsel引物(Mx，50pmol/p1)0.6ulTaq酶(5U/ul)0.2u1H2010.2u1总体积20ulPCR反应采用"touchdown"策略。程序如下94°Clmin94°C30s65°C30s7个循环(每个循环降低0.7'C)72°Clmin94°C30s20个循环56°C30s72°Clmin68°ClOmin4°C保存8)电泳检测——银染技术记录试验结果拍照或扫描，统计检测位点数及其多态性位点。以冷驯化3h，6h，12h，24h，48h，72h和未驯化Oh的小立碗藓为材料，进行cDNA-AFLP分析。统计200bp-1000bp之间的可读带，结果表明小立碗藓冷驯化和未冷驯化的基因表达存在着明显差异。有些cDNA片段在冷驯化后表达量逐渐增加，有些cDNA片段表现出先增加后降低，有些cDNA片段表达量先降低后增加，还有少数表达量明显降低。3、尸p"5/^全长基因的获得1)RT-PCR分析将由cDNA-AFLP分析得到的差异片段与P.patensEST数据库(http:〃moss.nibb.ac.jp/blast/blast.html)进行BLAST比对后，进行聚类分析和功能分类，显示小立碗藓在冷驯化过程中细胞内的代谢活性和生长状态发生了极大的变化。基因的表达分析显示尸/^9/^在冷驯化中上调表达，且该基因的表达受ABA的诱导，表明该基因参与了植物的抵抗非生物胁迫途径。通过同源序列设计引物，通过RT-PCR反应扩增得到尸p傲尸么尸p尸pZ^/^基因的上游引物序列为AGGAATCTGGTGGAGAACAGATTGCAATGGTGAATTCACCGATTAAACCTTGAATACGTTGTAAA。PCR反应体系如下cDNA10XLAPCR缓冲液d酵(2.5mM)primerF(50pmol/ul)primerF(50pmo1/u1)U\PolymeraseddH20总体积PCR反应程序下游物序列为95°C95°C65°C68。C72。C4°Clmin45s45s2minlOmin保存32个循环3u12u11.6u10.15u10.15u10.In113u120u12)纯化后的差异片段与pGEM-Teasy(Promega)载体连接3)连接产物的转化5)阳性克隆的测序以载体两端的T7或SP6引物进行序列测定。测序仪为ABI3100(AppliedBiosystems)。/57"5/^基因组序列如下，SEQIDNo.1:tcaacccatggaatatatgtttatatccatctctataggtaacgccagctgctacatcat60tcaaactacaaagctcgaacccccacccgaggcagcctcttcccgtgctgccagtgtgaa120cacggaacgcccccctgcttgcttccccccagctcacatagccgccactggaccacgacc180ggccgacgtggcagctacgtgccgatttttcgtaggaccaagtgtgagagctcgcaagat240gatgtcgatgtggcacgtctatccgtcgccgctattttcctacgtggcggacacgctggc300aatttcatagcagacgtccggcagttccaccgggtctgtccgtcacgtccggtaatatcg360gtttccgtcttcgttgccctgggggttctcaaggtggaattgaagcgctagattttgtg已420gttggtggatcagataatttctgaaaggcgctgatctggaggcttttgacgcgctcccat480gaacggtcgccgtccccaaacgatcgtgatctcgaagaaaacagcacaaaaagggggcaa540gtgtgatgagatttaactgaggcaggactttttattatatatattccgtaaagtagacgc600gattctgcagttctagatattaagttggcacaacgtgtcgacatattatgggcactagca660cacttgcagttggcctgggcccattggagcactcgcataatatatttgttggccctcttc720ctggcctcattcactttgtgtcatctttcgtaccgtttctgttttttaacttctagactt780cacgggaaccgtccagcgctttgtaaatagcctgagagccatcatccttgttgaacgaat840tcacaactcatcacacccaccacctgctgggcatgattgttgcagttgtatcaaaaatat900agttgttgtagtggtagaagtagtaactgaactgcggccgctccgtttctctgagatcgt兆Octttcttgtggcattcactactgtcaggtagagtagggttccagttgacgcttgaacttg1020gatacgaaagaggctttgtggaattgagaatttgtagtgtaggtgttgcgaaggattttg1080gtcccggttctgtgaagggcaggaggaatctggtggagaacagattgcaatggtggataa1140gaacagaacccagagagctgcgatggaggttagggcaggggcacggcattgcctagctcc1200agtgaaggaggaggagactccttctgcaagccccaagtatagaggagttcgcatgcggca1260atgggggaaatgggtttcgg卿ttcgggaaccgaacaagaggtcgaggatttggttggg1320atccttccctacggcggaaatggcagctagagcgtatgatgctgctgtggtatgcttgag1380aggtcctcatgctgctttaaatttccctgactcacctccccaatcacttcctgaatgcca1440ctcgccgaaggatatccaagtggccgctgctgcggctgccgcagtcgctgagccttgtac1500tcctgtgacgctccccttcaatggggaagcgcaatcacttgatgcgcaacttaggagcat1560taagaatgagacgaatttgacgcctagatcgcaccaaaggcctgcggaatcggaaaactc1620tggtacttcggcggagcgatcttggaaaagcgcttcgaaatctgaggttgtcgtggatga1680ggagcttgattgcacaggggagtcgacaccccacgccggagtggagtttgttagcttgga1740agatgtgggattggcctgggacggaatgaagtctgatgacatcaaattcttggaaggctt腦Oggaggacattg犯tttcctggttctaacctctacggccacgctgatgatgcgccaagaaa1860acttatgaaatcattctctggacgtcgcgttgtgccacaatactgtcgtcaattttcggg1920caggtttgagcccttaggcaacgtgccggacgtttacaacgtattcaaggtttaatcggt1980gaattcatcgtgcccacgttcaacattagaatctgaattagaggcgatattgtggcgttg2040gtcttcgacagaaaccatttcttcagaggtgcagcctgcggcggcaatcacacaagataa2100cctctcatttgagtgtagcatagacaggagcttctgctagaaagctcggccatctttctt2160cagtattgtgcagaaatcgatggatctctacaaacaaacgtaaaattctttggatggtaa2220cttctagctgatttttgacagatcatagcgccatgatatgttcggagtgctcttcgttcc2280gatagtaatatacaacactgcactgaaagaaaaagaaaagcacattgcgaatcgaa^cct2340gtaaataaatctcggatagcatcctatgggtgctgcagttcccatccacttttttgtgca2400tgtttgtcaccccagcctacacctgaatacgaccatgtattaatcttcattttactagcg2460atgaaagttatcctgattgtgcttaatgcttctatgaactgcaaggcctttgcatcaaaa2520aaatctatctttcttcttgtgaagtatcattgtttctttatgacgatcacaggtgtttta2580ttcgtcaacaatcaaaaaaacagatttgatgtgtggaatgctctacttgcaacca犯tga264012tggacgatggtgctgcactgtcaatcatgtcagacagacgtcagccgtatatcaagcttc2700tgcatcaggtcctcttcccgcttcgtttttcggggctgacgattact2747尸/7/^/^基因的cDNA序列如下，SEQIDNo.2:ATGGTGGATAAGAACAGAACCCAGAGAGCTGCGATGGAGGTTAGGGCAGGGGCACGGCATTGCCTAGCTCCAGTGAAGGAGGAGGAGACTCCTTCTGCAAGCCCCAAGTATAGAGGAGTTCGCATGCGGCAATGGGGGAAATGGGTTTCGGAGATTCGGGAACCGAACAAGAGGTCGAGGATTTGGTTGGGATCCTTCCCTACGGCGGAAATGGCAGCTAGAGCGTATGATGCTGCTGTGGTATGCTTGAGAGGTCCTCATGCTGCTTTAAATTTCCCTGACTCACCTCCCCAATCACTTCCTGAATGCCACTCGCCGAAGGATATCCAAGTGGCCGCTGCTGCGGCTGCCGCAGTCGCTGAGCCTTGTACTCCTGTGACGCTCCCCTTCAATGGGGAAGCGCAATCACTTGATGCGCAACTTAGGAGCATTAAGAATGAGACGAATTTGACGCCTAGATCGCACCAAAGGCCTGCGGAATCGGAAAACTCTGGTACTTCGGCGGAGCGATCTTGGAAAAGCGCTTCGAAATCTGAGGTTGTCGTGGATGAGGAGCTTGATTGCACAGGGGAGTCGACACCCCACGCCGGAGTGGAGTTTGTTAGCTTGGAAGATGTGGGATTGGCCTGGGACGGAATGAAGTCTGATGACATCAAATTCTTGGAAGGCTTGGAGGACATTGAATTTCCTGGTTCTAACCTCTACGGCCACGCTGATGATGCGCCAAGAAAACTTATGAAATCATTCTCTGGACGTCGCGTTGTGCCACAATACTGTCGTCAATTTTCGGGCAGGTTTGAGCCCTTAGGCAACGTGCCGGACGTTTACAACGTATTCAAGGTTTAA其编码的蛋白质的氨基酸序列为SEQIDNo.3:MVDKNRTQRAAMEVRAGARHCLAPVKEEETPSASPKYRGVRMRQWGKWVSEIREPNKRSR60IWLGSFPTAEMAARAYDAAVVCLRGPHAALNFPDSPPQSLPECHSPKDIQVAAAAAAAVA120EPCTPVTLPFNGEAQSLDAQLRSIKNETNLTPRSHQRPAESENSGTSAERSWKSASKSEV80VVDEELDCTGESTPHAGVEFVSLEDVGLAWDGMKSDDIKFLEGLEDIEFPGSNLYGHADD240APRKLMKSFSGRRVVPQYCRQFSGRFEPLGNVPDVYNVFKV28113尸pZ^/^基因的Real-timeRT-PCR分析利用real-timeRT-PCR方法研究了尸pZ^/^基因在冷驯化过程中的表达变化。1)RNA提取和反转录利用RNA反转录试剂盒进行RNA反转录。试剂盒使用TaKaRa公司的RNAPCRkit，参照试剂盒的说明书，以试剂盒提供的反应体系进行反转录反应。2)预实验反转录产物稀释10倍用以做模板，用目的基因的引物，使用HSExTaqDNApolymerase,进行PCR反应。PCR反应条件如下94°C2min94°C30s61°C30s72°C20s30个循环20°C5minPCR反应产物用琼脂糖凝胶电泳检测。选择反应产物专一，没有二聚体等杂带的样品进行下一步定量PCR反应。3)定量PCR反应利用TaKaRa公司的SYBRPremixExTaq(PerfectRealTime)kit进行荧光定量PCR反应，引物序列见表2.2。PCR仪使用CorbetResearch公司的RotorGene3000Real-TimeThermalCycler。实验结果利用软件Rotor-Gene6.0(Donaldetal.，2005)以及Excel7.0进行数据分析处理。采用Pp-actin3基因作对照，尸p/^/^基因的上游引物序列为GAGAGCTGCGATGGAGGTTAGGGCA;下游引物序列为ATTGCCGCATGCGAACTCCTCTATACTT4)标准曲线的生成将预试验的PCR产物按照10倍浓度梯度进行稀释，选择1/1,000，1/10，000，1/100，000，1/1,000,000浓度的稀释产物作为标准品模版，进行荧光定量PCR反应。通过这四个标准品生成的反应数据，软件Rotor-Gene5.0根据反应的荧光实时监控数据和标准品的浓度关系，生成标准曲线(尸p"^^参见图2)实验结果证明尸p/^Z^在冷胁迫诱导下基因表达量明显上调，序列分析该基因与拟南芥的DBF转录因子具有高度同源性，且该基因的表达受ABA的诱导，因此该基因是参与小立碗藓低温胁迫应答的一类重要的转录因子，与其低温抗性密切相关。〈110〉首都师范大学〈120>小立碗藓抗低温胁迫基因PpDBF2及其蛋白和载体〈160〉3<210〉1<211>2747<212>DNA〈213〉小立碗藓(PhyscomytrellaPateuts)〈400〉1tcaacccatggaatatatgtttatatccatctctataggtaacgccagctgctacatcat60tcaaactacaaagctcgaacccccacccgaggcagcctcttcccgtgctgccagtgtgaa120cacggaacgcccccctgcttgcttccccccagctcacatagccgccactggaccacgacc180ggccgacgtggcagctacgtgccgatttttcgtaggaccaagtgtgagagctcgcaagat240gatgtcgatgtggcacgtctatccgtcgccgctattttcctacgtggcggacacgctggc300aatttcatagcagacgtccggcagttccaccgggtctgtccgtcacgtccggtaatatcg360gtttccgtcttcgttgccctgggggttctcaaggtggaattgaagcgctagattttgtga420gttggtggatcagataatttctgaaaggcgctgatctggaggcttttgacgcgctcccat480gaacggtcgccgtccccaaacgatcgtgatctcgaagaaaacagcacaaaaagggggcaa540gtgtgatgagatttaactgaggcaggactttttattatatatattccgtaaagtagacgc600gattctgcagttctagatattaagttggcacaacgtgtcgacatattatgggcactagca660cacttgcagttggcctgggcccattggagcactcgcataatatatttgttggccctcttc720ctggcctcattcactttgtgtcatctttcgtaccgtttctgttttttaacttctagactt780cacgggaaccgtccagcgctttgtaaatagcctgagagccatcatccttgttgaacgaat840tcacaactcatcacacccaccacctgctgggcatgattgttgcagttgtatcaaaaatat900agttgttgtagtggtagaagtagtaactgaactgcggccgctccgtttctctgagatcgt960ctttcttgtggcattcactactgtcaggtagagtagggttccagttgacgcttgaacttg1020gatacgaaagaggctttgtggaattgagaatttgtagtgtaggtgttgcgaaggattttg1080gtcccggttctgtgaagggcaggaggaatctggtggagaacagattgcaatggtggataa1140gaacagaacccagagagctgcgatggaggttagggcaggggcacggcattgcctagctcc1200agtgaaggaggaggagactccttctgcaagccccaagtatagaggagttcgcatgcggca1260atgggggaaatgggtttcgg卿ttcgggaaccgaacaagaggtcgaggatttggttggg1320atccttccctacggcggaaatggcagctagagcgtatgatgctgctgtggtatgcttgag1380aggtcctcatgctgctttaaatttccctgactcacctccccaatcacttcctgaatgcca1440ctcgccgaaggatatccaagtggccgctgctgcggctgccgcagtcgctgagccttgtac1500tcctgtgacgctccccttcaatggggaagcgcaatcacttgatgcgcaacttaggagcat1560taagaatgagacgaatttgacgcctagatcgcaccaaaggcctg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