专利名称：一种构建生产外源蛋白用的转基因用模型鸡的方法
技术领域：
本发明涉及一种构建生产外源蛋白用的转基因用模型鸡的方法。
背景技术：
上个世纪70年代DNA重组技术的建立，使异源DNA可以被引入到真核细胞 中，这种基因转移技术为人类提供了从遗传上改变高等动物细胞的能力，并成为制 备转基因动物和进行基因治疗的基础。应用DNA重组技术，目前人们已经成功地 获得了包括小鼠、牛、猪、兔、鸡、鱼、线虫和海胆等多种转基因动物，1990年， 转基因方法也被用于人类基因治疗的研究中。对于许多高等动物，特别是具有完善 的免疫系统的脊椎动物而言，基因传递系统存在潜在的免疫刺激性，异源基因的表 达容易引起宿主产生免疫应答。通常情况下，无论是制备转基因动物还是进行基因 治疗，其目的就是为了高效的获得外源基因的表达产物。由于宿主本身并没有这些 蛋白，自然将其识别为非自身抗原而加以清除，造成转基因蛋白的瞬时表达，甚至 引发炎症反应。为了避免这种情况的发生，需要宿主对特定的外源蛋白产生免疫宽 容，不发生免疫排斥反应，即形成免疫耐受。
免疫耐受是指免疫系统与机体固有成分或被引入的抗原不发生破坏性免疫反 应的一种生理状态，这种状态可以通过将抗原引入发育中的免疫系统而人为诱导。 根据抗体产生的克隆选择学说，正常情况下，胚胎与外部抗原刺激是隔离开的，胚 胎的淋巴系统只会遇到自身抗原，从而导致了自身免疫反应的消除(免疫宽容)。 免疫系统在发育过程中学会了耐受，它的任务是通过T细胞和B细胞抗原受体基因 的重排产生随机的结构多样性，识别不期而遇的分子并作出反应，因而是一种获得 性现象，需要抗原诱导才能产生，即便是对自身抗原的耐受也是如此。但是对于大 多数转基因动物，特别是作为生物反应器的转基因动物，外源基因通常在免疫系统 已发育完全的成年动物中表达，因此需要建立一种通过向发育早期的胚胎中引入外 源抗原诱导免疫耐受的方法。
抗原性物质进入机体后能否诱导产生免疫耐受，主要取决与抗原和机体两方面 的原因， 一般而言，小分子可溶性、非聚合状态的抗原，如血清蛋白、多糖和脂多 糖等多为耐受原。这些小分子可溶性抗原在体内不易被吞噬细胞摄取，有可能以最 适浓度通过直接与淋巴细胞作用的方式诱导机体产生免疫耐受。而大分子颗粒性物 质和蛋白质聚合物，如血细胞、细菌或人丙种球蛋白聚合物等为良好的免疫原。这 些大分子物质易被吞噬细胞摄取，经加工处理后可有效刺激淋巴细胞产生免疫应 答。诱导耐受所需的抗原剂量随抗原种类、耐受细胞类型、动物属种、品系和年龄 而异。 一般而言，抗原经静脉注射最易产生免疫耐受，腹腔注射次之，皮下和肌肉 注射最难，但不同部位静脉注射引起的结果也不相同。例如人丙种球蛋白经肠系膜 静脉注入可引起耐受，经颈静脉注入则引起免疫应答；IgG或白蛋白注入门静脉能 引起耐受，注入周围静脉则引起免疫应答。诱导免疫耐受形成的难易还与机体免疫 系统的发育程度有关， 一般在胚胎期最容易，新生期次之，成年期最难。体外实验 证实，未成熟免疫细胞易于诱导产生免疫耐受，成熟免疫细胞则难以诱导产生耐受； 诱导成熟免疫细胞耐受所需的抗原量比诱导未成熟免疫细胞耐受所需的抗原量高 数十倍。目前大量的实验证据表明，免疫耐受的形成与免疫系统初次接触抗原时所 处的发育阶段密切相关，免疫耐受可以通过对胚胎或新生幼雏接种抗原而诱导。
与哺乳动物不同的是，禽类的胚胎发育是在离开母体的密闭蛋壳内独立完成 的，这为胚胎期接种抗原提供了更为方便的条件。
发明内容
本发明的目的是提供一种构建生产外源蛋白用的转基因用模型鸡的方法。 本发明所提供的构建生产外源蛋白用的转基因用模型鸡的方法包括以下步骤
1) 将外源蛋白导入种蛋的卵黄囊内；
2) 将上述步骤l)的种蛋静置孵育46 — 50小时后，再继续孵化至出雏，得到生 产外源蛋白用的转基因用模型鸡。
上述方法中，所述种蛋的胚龄为5-7天。
所述外源蛋白为牛血清白蛋白、牛乳酪蛋白或人血清白蛋白，优选为牛血清白 蛋白；所述牛血清白蛋白的浓度为0.8 —1.2g/L，导入的剂量为每只种蛋80 — 120pl。
具体操作时，可在种蛋的气室上打两个孔，其中一个孔位置在于气室边缘下方 0.3-0.5cm处，通过气室上的窗孔将外源蛋白导入卵黄囊中。
本发明在鸡胚胎发育早期，其免疫系统尚未完善之前，通过向种蛋的卵黄囊中 导入外源蛋白，使其与卵黄营养物质一起被发育中的胚胎吸收，进入到胚胎的血液 循环系统，随着血液循环经过胸腺时与正在发育的免疫细胞相互作用，诱导鸡胚免 疫系统产生对外源蛋白的免疫沉默，最终获得对特定外源蛋白免疫耐受的转基因用
模型鸡。
在对种蛋卵黄囊导入外源蛋白时，要尽量縮短时间，平均每只种蛋的操作时间 控制在1-1.5分钟。整个过程需在超净工作台中进行，封闭蛋壳上的针孔时不能出 现渗漏的情况。整个操作过程可以在室温条件下完成，为縮短操作时间，可一人扎 孔、 一人导入外源蛋白、 一人封蛋，尽量縮短每只种蛋在孵化器外的时间，以减少 环境变化对鸡胚孵化的影响，大大提高其孵化率，进而提高免疫耐受率。
本发明的方法具有操作条件简单易得、成本低廉、可操作性强、外源蛋白的导 入剂量低、可重复性好、耐受率和孵化率高及维持耐受的时间久等优点，且本发明
方法对鸡胚胎发育的影响较小，可以获得73-83%的孵化率，成功地解决了转基因 产物可能引起生物个体免疫应答的问题，并且免疫耐受维持的时间较久，60日龄的 转基因用模型鸡仍然存在对特定外源蛋白抗原的免疫耐受。本发明方法为解决转基 因产物引起的免疫应答提供了一个简单、高效的解决方案，为在转基因动物研究中 高效获得外源基因产物，建立对基因产物免疫耐受的禽类模型和提高鸡输卵管生物 反应器的应用价值提供了科学依据和有效的方法。
图1为对孵化3 — 7天的种蛋胚胎导入牛血清白蛋白后获得的转基因用模型鸡 的血清ELISA检测结果
具体实施例方式
下面通过具体实施例对本发明做进一步的说明。 实施例l、对不同胚龄的种蛋导入外源蛋白-牛血清白蛋白(BSA) 取胚龄分别为3、 4、 5、 6和7天的白莱航鸡种蛋(购自中国农业大学种鸡场) 各30枚，用酒精棉擦拭蛋壳表面消毒后，通过显微光源照蛋确定胚胎所处的位置， 然后用铅笔在胚胎对侧的蛋壳上标注出气室的边缘，这样在打孔时可以有效的避开 胚胎血管网，避免导入外源蛋白时对胚胎血管的机械损伤。在标注的气室边缘下方 0.3-0.5cm处做一个打孔标记，为了保持气室和胚室的气压平衡，在气室顶部再做一 个打孔标记，用酒精棉擦拭打孔标记处，使用解剖针在种蛋打孔标记处快速扎两个 小孔(孔径为lmm)。
用lml—次性注射器，使用1号针头，针头内径为0.1mm，吸取100pl浓度为 lg/L的外源蛋白-牛血清白蛋白溶液，自气室边缘下方0.3-0.5cm处的小孔处垂直种 蛋蛋壳切面扎入蛋内直至针头完全没入种蛋中，轻推注射器活塞将外源蛋白-牛血
清白蛋白溶液导入卵黄囊内。维持原角度缓缓地抽出注射器，用液体石蜡封闭两孔。
将封闭后的种蛋放回孵化器中，在不转蛋的条件下静置孵育48小时后，再在 常规条件下继续孵化直至出雏，得到转基因用模型鸡。
统计孵化率，结果表明，不同胚龄接种牛血清白蛋白的转基因用模型鸡的孵化 率分别为76.67%、 80.00%、 83.33%、 80.00%和73.33%，孵化率在73%-83%之间。
实施例2、利用酶联免疫反应(ELISA)检测不同胚龄接种牛血清白蛋白的转 基因用模型鸡的免疫耐受结果
牛血清白蛋白经弗氏佐剂(弗氏完全佐剂用于第一次免疫时抗原乳化，弗氏不 完全佐剂用于其他日龄阶段的抗原乳化)乳化后，在上述实施例1获得的不同胚龄 接种牛血清白蛋白的转基因用模型鸡孵出后的第20天、第30天、第40天和第50 天分别用lOOiil浓度为lg/L的牛血清白蛋白溶液，进行4次皮下注射，第4次皮下 注射后的第7天，取转基因用模型鸡的血清，进行ELISA检测。同时以胚胎期未经 处理的小鸡出生后按照上述剂量进行四次免疫后的鸡血清作为阳性对照，以采用无 特定病原菌(SPF)处理的鸡血清作为阴性对照。
在检测各组鸡血清样本前，需要先通过系列倍比稀释实验组、阳性对照组和阴 性对照组的鸡血清，以确定抗原抗体的最佳反应浓度。选取阳性对照组OD值在1. 0 左右，且与同样稀释度下的阴性对照组OD值差异最大时对应的抗原包被浓度以及 血清稀释倍数作为检测实验组血清样本时使用的抗原浓度和稀释倍数。当实验组样
本的0D值大于阴性对照组0D值的2. l倍时，判定该样本为阳性，反之则为阴性。 所有实验数据采用SPSS 11.5统计软件进行统计分析。数据用平均值士标准差 (mean士SEM)的方式表示。采用独立样本t检验(双尾)，P<0. 05时认为差异显 著。
具体检测结果如图1所示。从图1中可以看出，对胚龄为3天或4天的种蛋接 种牛血清白蛋白的转基因用模型鸡血清中的抗-牛血清白蛋白抗体的平均水平分别 为1.03±0.13 (n=21)和0.92土0.12 (n=20)，与阳性对照(1.02±0.04， n=6)相 比差异不显著(p=0.984， p=0.636)，表明在胚龄为3天或4天时导入牛血清白蛋 白对诱导鸡的耐受性的效果不好，其血液中仍具有较高水平的抗-牛血清白蛋白抗 体；而对胚龄为5天、6天或7天的种蛋接种牛血清白蛋白的转基因用模型鸡血清 中的抗-牛血清白蛋白抗体的平均水平分别为0.55±0.08 (n=21) 、 0.66±0.08 (n =20)和0.44士0.04 (n=16)，显著低于阳性对照(p=0.003， 5天组;p=0.020， 6
天组；p<0.001， 7天组)，表明在胚龄为5天、6天或7天时导入牛血清白蛋白对 诱导鸡的耐受性的效果较好。进一步分析比较这五组数据，结果发现，胚龄为5天、 6天或7天组的鸡血清中抗-牛血清白蛋白抗体的平均水平显著低于胚龄为3天或4 天组的转基因用模型鸡血清中抗-牛血清白蛋白抗体的平均水平(p<0.05)，说明只 有在特定的发育时期接种外源抗原才能使鸡血清中抗-牛血清白蛋白抗体的水平最 低，并非时间越早越好，在胚龄为5-7天时导入外源蛋白的效果最好。
实验组的转基因用模型鸡经过四次免疫后，此时小鸡已达60日龄，其体内抗-牛血清白蛋白抗体的平均水平显著低于阳性对照(p=0.003， 5天组；p=0.020， 6天 组；pO.OOl， 7天组)，说明耐受期限可维持较长时间。
权利要求
1、一种构建生产外源蛋白用的转基因用模型鸡的方法包括以下步骤1)将外源蛋白导入种蛋的卵黄囊内；2)将上述步骤1)的种蛋静置孵育46-50小时后，再继续孵化至出雏，得到生产外源蛋白用的转基因用模型鸡。
全文摘要
本发明公开了一种构建生产外源蛋白用的转基因用模型鸡的方法。本发明的方法包括以下步骤1)将外源蛋白导入种蛋的卵黄囊内；2)将上述步骤1)的种蛋静置孵育46-50小时后，再继续孵化至出雏，得到生产外源蛋白用的转基因用模型鸡。本发明的方法具有操作条件简单易得、成本低廉、可操作性强、外源蛋白的导入剂量低、可重复性好和孵化率高等优点，且本发明方法对鸡胚胎发育的影响较小，可以获得73-83％的孵化率，并且免疫耐受维持的时间较久，60日龄的转基因用模型鸡仍然存在对特定外源蛋白抗原的免疫耐受。
文档编号C12N15/09GK101352157SQ20081011843
公开日2009年1月28日 申请日期2008年8月15日 优先权日2008年8月15日
发明者李赞东, 晨 赵 申请人:中国农业大学