肠杆菌重组菌及其应用的制作方法

专利名称：：肠杆菌重组菌及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种重组菌及其应用，特别涉及肠杆菌的重组菌及其应用。
背景技术：
：在发酵工业中，底物在微生物或者酶的作用下生成目的产物的同时往往会有副产物产生，C02就是发酵工业中最常见的副产物之一。在肠杆菌科各属菌株厌氧发酵糖类时，糖类经一系列反应转化为磷酸烯醇式丙酮酸，一部分磷酸烯醇式丙酮酸转化为琥珀酸，另一部分转化为丙酮酸，丙酮酸有三条去路l.在乳酸脱氢酶催化下转化为乳酸；2.通过乙酰乳酸合成酶、乙酰乳酸脱羧酶和3-羟基2-丁酮还原酶(2,3-丁二醇脱氢酶)依次催化反应下经a-乙酰乳酸、3-羟基丁酮最终转化为2，3-丁二醇；3.在丙酮酸甲酸裂解酶催化下分解为乙酰CoA和甲酸，乙酰CoA会进一步生成乙酸和乙醇，甲酸往往又会分解为C02和H2，这就是发酵过程中产生大量C02的原因。C02的产生既造成了底物转化为产物的转化率的降低，又加剧了本来就日益严重的温室效应。温室效应就是由于大气中C02等气体含量增加，使全球气温升高的现象。全球变暖是人类面临的一个重要而又棘手的热点问题，是21世纪人类面临的巨大挑战，直接关系到人类的生存和发展。0)2约占温室气体总量的75%，如果C02含量继续增加，温室效应将使两极地区冰川融化，海平面升高，自然灾害加剧，并在农业、生态、医疗卫生、经济等方面给人类带来许多不良影响。为了减缓温室效应，各国制定了各种措施，主要包括节约能源和提高能源利用率，开发可再生替代能源，植树造林以及采用一些方法来吸收C02。近年来，在保护环境和节约化石能源的同时，发酵工业迅猛发展，在发酵过程中产生的C02也势必会给人类带来不利影响。
发明内容本发明的一个目的是提供一种肠杆菌重组菌，该重组菌在发酵过程中可以在提高产物产量的同时减少副产物C02和H2的生成量。本发明所提供的肠杆菌的重组菌，是将肠杆菌中的丙酮酸甲酸裂解酶基因灭活得到的重组菌。所述灭活具体可以通过同源重组实现。所述同源重组可以是将同源序列片段导入所述肠杆菌中实现的；所述同源序列片段由上游至下游依次为同源臂1、抗性基因和同源臂2;所述同源臂1和同源臂2选自丙酮酸甲酸裂解酶的基因组基因及其上下游序列。所述同源臂1的核苷酸序列具体可以如序列表中序列3所示；所述同源臂2的核苷酸序列具体可以如序列表中序列4所示。具有序列3和4所示同源臂的同源序列片段具体可以是按照如下方法得到的以所述出发菌的基因组DNA为模板，用序列表中序列1和序列2所示引物进行扩增，得到含有所述丙酮酸甲酸裂解酶基因及其上下游序列的PCR扩增产物，再用抗性基因替换所述PCR产物中所述丙酮酸甲酸裂解酶基因的部分基因片段。在上述同源序列片段的制备中，还可以用其它的引物对进行扩增，扩增得到的片段既可以包括整个丙酮酸甲酸裂解酶基因，也可以只含有部分丙酮酸甲酸裂解酶基因，只要被抗性基因替换的部分是丙酮酸甲酸裂解酶基因的序列即可。上述任一所述同源序列片段导入所述肠杆菌的方法可以由以下两步组成1)所述同源序列片段插入自杀质粒的多克隆位点得到重组质粒，再将所述重组质粒导入宿主菌中得到重组宿主菌；2)将所述重组宿主菌与所述肠杆菌杂交；所述自杀质粒含有抗性基因，所述自杀质粒中的抗性基因与所述同源序列片段中的抗性基因不同。其中，所述自杀质粒为具备以下条件的质粒①自杀质粒在受体菌中不能复制；②自杀质粒必须带有一个在整合到染色体内以后可供选择的抗性标记；③自杀质粒带有易于克隆的多克隆位点。所述自杀质粒具体可以为pGPGm质粒、pGPCm质粒或pGPKm质粒；所述pGPGm质粒是按照如下方法得到的用限制性内切酶Pstl酶切pGP704质粒，回收被切除部分Ap基因的质粒片段；用限制性内切酶PstI酶切pUCGm质粒，回收Gm基因片段；将以上两回收片段进行连接，得到pGPGm质粒。所述pGPKm质粒是按照如下方法得到的用限制性内切酶Pstl酶切pGP704质粒，回收被切除部分Ap基因的质粒片段；用限制性内切酶Pstl酶切pUC4K质粒(含有Km抗性基因片段)(GEHealthcareLifeSciences)，回收Km基因片段；将以上两回收片段进行连接，得到pGPKm质粒。所述pGPCm质粒具体可以参见文献赵德华、李季伦.肺炎克氏杆菌固氮酶双突变株的构建及其对底物还原的特性.科学通报，2004，49(15):1512-1518。所述宿主菌为含有J/w'r基因的大肠杆菌，具体可如含有J/w'r基因的大肠杆菌SM10或含有乂p&基因的大肠杆菌S17-1。所述重组质粒可通过热激法或电转化法等常规方法转化宿主菌。所述肠杆菌可以为肠杆菌科克雷伯氏菌属、埃希氏菌属、肠杆菌属、柠檬酸杆菌属、志贺氏菌属、沙门氏菌属或沙雷氏菌属的菌。所述肠杆菌具体可为产酸克氏杆菌(Klebsiellaoxytoca)。上述任一所述重组菌在生产乳酸和/或琥珀酸和/或2，3-丁二醇中的应用也属于本发明的保护范围。本发明中通过使菌中丙酮酸甲酸裂解酶基因的部分片段被抗性基因取代而使丙酮酸甲酸裂解酶基因灭活，从而得到重组菌。实验表明，与对照相比，本发明的重组菌在发酵过程中产生的副产物C02量显著减少且目的产物的量明显提高，例如，产酸克氏杆菌发酵产生的乳酸、琥珀酸、2，3-丁二醇分别比对照提高30%、9%和23%，而产生的(:02量仅为对照的8.04%，且没有H2产生。所以本发明重组菌有助于缓解温室效应的压力，本发明重组菌将实际工业化生产中发挥重要作用，既能大幅减少C02产量，又能提高底物转化为产物的转化率，具有广阔的应用前景。图1为载体pGPGm或载体pGPKm的构建图。图2为PCR扩增丙酮酸甲酸裂解酶基因及其上下游序列的结果图。图3为丙酮酸甲酸裂解酶基因破坏质粒pGPGPK构建过程图。具体实施例方式下述实施例中所使用方法如无特别说明均为常规方法。实施例1、丙酮酸甲酸裂解酶基因被灭活的产酸克氏杆菌重组菌的构建一、丙酮酸甲酸裂解酶基因p/7及其上下游序列的克隆根据产酸克氏杆菌(Klebsiellaoxytoca)部分基因组序列(GenomeProjectID:12627)和丙酮酸甲酸裂解酶基因p/7序列(EU276019)设计引物pl和p2,PCR扩增丙酮酸甲酸裂解酶基因及其上下游序列，弓I物序列如下pl(上游引物)5，-TCAGGTACCTTGACAGCGATTTGATGGCT-3，(序列表中序列l)，p2(下游引物)5，-AGTGAGCTCGAAGCGTTCATAAAGTGGCG-3，(序列表中序列2);引物由北京赛百盛公司合成。以野生型产酸克氏杆菌M5al(0htaK，BeallDS，MejiaJP，etal.MetabolicengineeringofA7e力57'e27soa^ocsM5A1forethanolproductionfromxyloseandglucose,^p7^>2W>ot必'oroZ^o1991,157:2810—2815.)(清华大学)的基因组DNA为模板，在引物pi和p2的引导下，PCR扩增丙酮酸甲酸裂解酶基因p/7及其上下游序列；PCR扩增条件为先94。C5min;再94°Clmin，60°Clmin，72°C51min，共30个循环；最后72°C10min。将PCR扩增产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示(泳道1为PCR扩增产物，泳道2为marker)，回收并纯化约4kb的目的片段。将回收的PCR产物片段与克隆载体pMD-19TSimple载体(TaKaRa公司)连接，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性转化子，提质粒，用限制性内切酶《p/JI和&cI进行双酶切鉴定，获得正确的含有丙酮酸甲酸裂解酶基因及其上下游序列的重组载体，将其命名为pTP。二、丙酮酸甲酸裂解酶基因破坏质粒pGPGPK的构建构建过程如图3所示。用限制性内切酶尸"I酶切pTP质粒，回收被切除了部分丙酮酸甲酸裂解酶基因片段的pTP质粒片段；再用限制性内切酶尸Wl酶切pUC4K质粒(GE公司)，回收从pUC4K质粒切下的卡那霉素抗性基因片段；将两回收产物用T4DNA连接酶进行连接，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性转化子，提质粒，用限制性内切酶尸WI进行酶切鉴定，将正确的重组载体命名为pTPK。用限制性内切酶1和&cI双酶切pTPK质粒，回收含有卡那霉素抗性基因的杂合丙酮酸甲酸裂解酶基因上下游序列即同源序列片段(其由上游至下游依次为同源臂l、抗性基因、同源臂2)，将同源序列片段进行测序，测得同源臂l的序列如序列表中序列3所示，共1688bp，测得同源臂2的序列如序列表中序列4所示，共1500bp;用限制性内切酶iT/wI和5"acI双酶切pGPGm质粒，回收线性的pGPGm质粒片段；将回收的同源序列片段和线性的pGPGm质粒片段用T4DNA连接酶进行连接，将连接产物转化大肠杆菌S17-l(义AZ'力感受态细胞(SimonR,PrieferU,PilhlerA(1983)Abroad-hostrangemobilizationsystemforinvivogeneticengineering:transposonmutagenesisinGram—negativebacteria.Biotechnology1:784-791.)[也可以转化至SMIO(感受态细胞(MillerVLandMekalanosJJ.Anovelsuicidevectoranditsuseinconstructionofinsertionmutations:OsmoregulationofoutermembraneproteinsandvirulencedeterminaxitsinVibrioCholeraerequirestoxR.JBacteriol1988，170(6):2575-2583.)]，筛选阳性转化子，提质粒，用《/wI和5"acI酶进行酶切鉴定，得到正确的丙酮酸甲酸裂解酶基因破坏质粒，命名为pGPGPK。pGPGm质粒的构建方法如下(图1，图中所用的中间质粒中，含有Gm抗性基因的为pUCGm质粒，含有Km抗性基因的为pUC4K质粒；所得到的最终质粒中，含有Gm抗性基因的为pGPGm质粒，含有Km抗性基因的为pGPKm质粒)用限制性内切酶Pstl酶切pGP704质粒，回收被切除部分Ap基因的质粒片段；用限制性内切酶PstI酶切pUCGm质粒，回收Gm基因片段；将以上两回收片段进行连接，经转化、筛选后得到pGPGm质粒。其中，pUCGm质粒参见文献SchweizerHD.Smallbroad-host-rangegentamycinresistancegenecassettesforsite—specificinsertionanddeletionmutagenesis.肠:Tec/w细es1993，15:831—834.(清华大学);pGP704质粒参见文献MillerVLandMekalanosJJ.Anovelsuicidevectoranditsuseinconstructionofinsertionmutations:OsmoregulationofoutermembraneproteinsandvirulencedeterminantsinKz'Ztt/oC力o7araerequirestorv./5s"en'o71988，170(6):2575-2583.(清华大学)；三、产酸克氏杆菌丙酮酸甲酸裂解酶基因灭活重组菌的构建将携带有破坏载体pGPGPK的大肠杆菌S17-l(/l/w>)(供体菌)和野生型产酸克氏杆菌(受体菌)进行双亲本杂交，具体方法为在LB液体培养基中分别过夜培养供体菌和受体菌；供体菌和受体菌按3:1培养的菌液体积比比例混合于10mM的MgS04溶液中，过滤，菌体都位于滤膜上，然后将滤膜置于LB平板上，37。C培养8-12小时；用10mM的MgSO,溶液洗下长在滤膜上的菌苔，梯度稀释后涂布于含卡那霉素的LB平板上，37"C培养，长出的单菌落分别接种于含庆大霉素和卡那霉素的LB平板上，37X:培养，最终得到具有卡那霉素抗性但没有庆大霉素抗性的菌株，即为丙酮酸甲酸裂解酶基因被灭活的产酸克氏杆菌重组菌。实施例2、丙酮酸甲酸裂解酶基因被灭活的产酸克氏杆菌重组菌的葡萄糖厌氧发酵产酸克氏杆菌以葡萄糖为底物进行发酵，能够产生乳酸、琥珀酸，2，3-丁二醇和副产物C02、H2。本实验用实施例1构建的重组菌进行厌氧发酵，以野生型菌株(即出发菌)为对照，比较其产物和副产物的结果。具体方法如下一、种子培养从平板上挑取野生型产酸克氏杆菌(出发菌)单菌落或实施例1中得到的产酸克氏杆菌重组菌的单菌落，接入到装有100毫升LB培养基的500毫升三角瓶中，37°C、180r/min培养12小时，得到种子培养液。二、发酵将l50微升步骤一得到的种子培养液接入装有3O毫升发酵培养基的厌氧瓶中，37。C、180r/min培养16小时，检测产生的0)2和H2的量，以及产生的乳酸、琥珀酸，2，3-丁二醇的量。其中，所用的发酵培养基的组成如下每升培养基中含有K2HP04(磷酸氢二钾)3.5g，KH2P04(磷酸二氢钾)1.4g，glucose(葡萄糖)30g，(NH4)2S04(硫酸铵)2.Og，MgS047仏0(硫酸镁)0.2g，yeastextract(酵母粉)1.5g。实验设3次重复，结果取平均数。结果如表l所示。结果表明，本发明重组菌发酵过程中没有H2产生，产生的0)2的量仅为野生型菌株的8.04%;乳酸、琥珀酸、2，3-丁二醇较野生型菌株分别提高30%、9%和23%。表l、野生型和重组菌的发酵结果比较<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>序列表<160>4<210〉1〈211>29<212〉謹<213〉人工序列<220〉〈223><400〉1tcaggtaccttgacagcgatttgatggct29〈210>2<211〉29<212〉DNA〈213〉人工序列<220><223><400>2agtgagctcgsagcgttcataaagtggcg29<210>3〈211〉1688<212>赚<213〉产酸克氏杆菌CS:/e6wW/aoxytoca)<400〉3ttgacagcgatacagcgcgctsacaggggggct3tas3gttatttgtaaatttgatggctttcccggctcatcagtcgttattgaaggcctatgaaaagc60gaaagccgcattttgggctaaataaagcgtttcttccgttaasatgacga120tcgactgcgacccctttttcctgttttgcactatttccgccgatgttgta180taattagtggtgagaaataataaaatactgccgcsaatattgttaatttt240ccccattttaattasccgasaaacgggggcasaatgaaaataatcsscat300tttts33attt3tttttttstta33333C3S333gtt3cct3333333tai360agcaaacccacacsctaaasaggcctatagttccggtaggatatgatctacatcaaattc420CCttct3t33aaagctgacagcgggcgtctggtgtcttcaatgccattcgtgcgtt3tttctgattggttgttgaagccgagttactccgtttgttgccsgttatccgcgttctctcsccgacgaccatctgttacatgtgactggcagaggtgacgagtatggaaggcggcgtccsccaggcctgcatgctttgttaacccttttgatctctatcgcgggttgccasgcggtgccgstcscatgggggcttsctgttggggsctta3tgtgcctggggccgtagcctgcgggtttgaactttgcssgtgaccgtcatgcggtggtctactaagggttccgagcttaaacgaagtcaaccttcctggcttasacaggatC3CttCtC3gtatctcacctctttteictcttttgttttcactgsttgggcctgtttacctcaactggcgtgtattgctgcgttctgcaatatcctggcagcatsgtatccccggasttcgaacttcatcgctggttggggtttcaggcatgaaaagttacgtacgcgactggcgcaactaaaccgcacttgacgctggcgccaacttaccctgctgccat3tsttaccgggcstctgcttc3sccgttcatgtggctttaccgccgaccaacctgatgggccatgattagcgaacatgttggaccgcsgsctgat33ccttgacatactgccacagcctttcstccsgagacgcgsccacacgcgcctgtacatcgagatggcgaaagttttatctggccgacaaccggtctcactgggttatcgttgttcaacgtatacaggcgaatatctgccttgctggttttaccttatgatcccttggttcaactgattccggtgggtcattt3gggsaggtttaaaactatacccaagctgtgttgattttgaaaggtctcgaagttagtgtgcgccgaagaatatcsccgcacscggccgggtttgattctccgcgsssgcctgttggtaactatgactgccCC3t3Cttttggtatggatgggtggcaatggctgggtatctccggsasgt3sct3tcgggcctgcgtggcagaaggtaggtgcg333ggtcccgtacgaaggacaccgt3tscttccctt4805406006607207808409009601020108011401200126013201380144015001560162016801688<210〉4<211〉1500〈212〉DNA〈213〉产酸克氏杆菌(《/eZwW/a<400〉4agtacgagaagctgcgtasgttggtcctaagcstggatcaactacatgcattatccgcaccaatcaastaaaatcgaaggttgacctggttcccgactcaacacccctgaggtcgtcacctacgcgaaaggacgaagtgcccatcgaagggttttasctcccatgtaatgagtggggccttatggataaccggstgggcctgwtcctgtcctgatgcgcgattaccgttcgatgatctgcccgatggttcstgctgtsc3tctgsaccgcttcatggsccgacaagtaccatggcatgctgcgsaagtttgwtacccgtgaacgtttcgtccgagctgcggtcgtcgcagaaaggtgcatggtatttccggtcagcatcccggaaaaacctgactaaagtsttgactgttttagcaataasttcggagggcsccgtcgtgcctctattgaagagctgaatgcgtcctggttggtsagcgcaatcaacgstcaaaggcgtggctggctaggtatcgcag3d3ccgsttccagtttggta3CC3tC3CCtgctggctgtttgttgcctcttt3C3CCttCcctcgccggcctgaacgtcatatccgcagcaaatcgtacastcstcctgtgactcgacat3tstcsccgcstggcccggggccscaaccgtgaaagsggt3cttc3aca33S3tgcagttgcggcgttgsacgtcctgaaa3csgt3cgtcttc3ctg3tgtctgtccgt3C3acgsctcttcagaaactct33cgttgtccgttcggacctgacctccgtctatcgtgcctgatggatgacgtcatgaatgaccatccgaggacgtgatgtaataagcgcccagtctctagcctttgaggstccgctttcgscacctggggtgacctstcgatgactatcttcggtgcttgaaasactgcttcgacgaacactgcgctgggcgctgcactgcggctgaccggtctggcttcgcgtcgatgcac3cctscgtatggtaagcaggtgctsattgcgaaactcgs3cgcgctgttsttccscccgcgagatgcgt3tccggctactcgtacctttgtctgctctgtgcatctattggtcgca3tC3CCttCtgatacccacgcgcc3ctttsgctatcgcttcgcgctaaccgtgstggagcsacatcatccgaccgtgstgtccctgtccggtcgacttcggatatggccgcgcsacgctaaaaaccggtacccgatgcacgccgtttgctgggcs3agaccacgaagcgtctgctcgacgtscgcagt3cttcactcsgagctccacgcagtctatactt3c3t3ggcccttcsctcctttccagggctggcggcassgatgascgcttc60120180240300360420480540600660720780840900960102010801140120012601320138014401500权利要求1、肠杆菌的重组菌，是将肠杆菌中的丙酮酸甲酸裂解酶基因灭活得到的重组菌。2、根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于所述灭活是通过同源重组实现的。3、根据权利要求2所述的重组菌，其特征在于所述同源重组是将同源序列片段导入所述肠杆菌中实现的；所述同源序列片段由上游至下游依次为同源臂1、抗性基因和同源臂2;所述同源臂1和同源臂2选自丙酮酸甲酸裂解酶的基因组基因及其上下游序列。4、根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于所述同源臂l的核苷酸序列如序列表中序列3所示；所述同源臂2的核苷酸序列如序列表中序列4所示。5、根据权利要求3或4所述的重组菌，其特征在于所述同源序列片段导入所述肠杆菌的方法由以下两步组成1)所述同源序列片段插入自杀质粒的多克隆位点得到重组质粒，再将所述重组质粒导入宿主菌中得到重组宿主菌；2)将所述重组宿主菌与所述肠杆菌杂交；所述自杀质粒含有抗性基因，所述自杀质粒中的抗性基因与所述同源序列片段中的抗性基因不同。6、根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于所述宿主菌为含有Jp介基因的大肠杆菌。7、根据权利要求1-6中任一所述的重组菌，其特征在于所述肠杆菌为克雷伯氏菌属、埃希氏菌属、肠杆菌属、柠檬酸杆菌属、志贺氏菌属、沙门氏菌属或沙雷氏菌属的菌。8、根据权利要求7所述的重组菌，其特征在于所述肠杆菌为产酸克氏杆菌(Klebsiellaoxytoca)。9、权利要求1-8中任一所述重组菌在生产乳酸和/或琥珀酸和/或2，3-丁二醇中的应用。全文摘要本发明公开了一种肠杆菌的重组菌及其应用。本发明所提供的重组菌，是将肠杆菌中的丙酮酸甲酸裂解酶基因灭活得到的重组菌。实验表明，与对照相比，本发明的重组菌在发酵过程中产生的副产物CO₂量显著减少且目的产物的量明显提高，例如，产酸克氏杆菌发酵产生的乳酸、琥珀酸、2，3-丁二醇分别比对照提高30％、9％和23％，而产生的CO₂量仅为对照的8.04％。所以本发明重组菌有助于缓解温室效应的压力，本发明重组菌将实际工业化生产中发挥重要作用，既能大幅减少CO₂产量，又能提高底物转化为产物的转化率，具有广阔的应用前景。文档编号C12N1/21GK101348775SQ20081011953公开日2009年1月21日申请日期2008年9月2日优先权日2008年9月2日发明者曹竹安,光杨申请人:清华大学