专利名称：一种酪氨酸酶模拟酶的制备方法
技术领域：
本发明涉及的是一种酪氨酸酶模拟酶的制备方法,属于仿生催化技术领域。
背景技术：
酪氨酸酶，多酚氧化酶的一种，它广泛存在于植物、动物、和微生物中。酪氨酸酶具 有加氧酶和脱氢酶两种活性，能催化氧化酪氨酸生成二羟基苯丙氨酸。酶催化与普通化学 催化剂相比，具有高效性、专一性和反应条件温和等优点，而天然酶对环境过于敏感， 对操作条件要求苛刻，易失活，价格昂贵的缺点。
设计合成酪氨酸酶模型，要考虑的因素较多，关键在于配体的选择。过去的研究中， 人们用吡啶基等来模拟酶活性中心的咪唑基，合成了一系列的酪氨酸酶模型物，较好地模 拟了酪氨酸酶的性质。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种催化活性高，不会失活的
酪氨酸酶模拟酶的制备方法，它是A)将环糊精按质量比l : 15 25加入干吡啶中溶解， 然后按环糊精与邻-碘酰基苯甲酸的摩尔比为1:0.2 0.4逐滴加入间苯二磺酰氯；在 25 'C下反应1小时，停止反应，在低于25 'C条件下减压蒸除吡啶，浅褐色残余物在液 氮保护下在低于25 r下真空干燥，得到的粗产物按质量比1 : 8 15溶于40%质量百分 比浓度的乙醇水溶液中，滤去不溶物后按质量比1 : 8 15逐滴加到83%质量百分比浓度 的乙腈水溶液中，抽滤，除去白色沉淀，在30 'C下减压蒸除溶剂，残留物溶于适量20% 质量百分比浓度的乙醇水溶液中，搅拌l小时，在30 。C下蒸除溶剂，在20 3(TC下真 空干燥即得到6位双取代环糊精磺酸酯；B)将6位双取代环糊精磺酸酯按质量比为1 : 30 50加入到N， N-二甲基甲酰胺中，搅拌溶解；然后按6位双取代环糊精磺酸酯与碘 化钠的质量比为1 : 1 1.5加入碘化钠，在60 90。C下搅拌反应2 45h，在4(TC下减压 蒸干N， N-二甲基甲酰胺；在产物中加入丙酮，搅拌、过滤，收集滤饼再加入丙酮，重复 三次，除去未反应的碘化钠；将所得固体溶于水中，加入丙酮得到沉淀，在40 45'C下 真空千燥即得到双碘代环糊精；C)将双碘代环糊精按质量比为1 : 10 15加入到N， N-二甲基甲酰胺中，搅拌溶解；然后按双碘代环糊精与组氨酸的质量比为1:0.8 1.5加 入组氨酸，在80。C下反应24小时；将反应得到的悬浊液抽滤，收集滤液，在40。C下减压蒸馏去除溶剂，所得黄色蜡状物用丙酮洗至丙酮变无色；所得固体溶于水中并重新用丙 酮沉淀，收集沉淀物、干燥后即得到环糊精双组氨酸衍生物；D)将环糊精双组氨酸衍生 物按质量比为l:500 2000投入ra值为7 9的磷酸盐缓冲液中，待完全溶解后，按环 糊精双组氨酸衍生物与硫酸铜的摩尔比为1 : 1 5加入硫酸铜，过滤，除去不溶物，加 入适量丙酮，静置，析出晶体，用丙酮洗涤，在20 4(TC下干燥，得到酪氨酸酶模拟酶。
本发明所述的环糊精为e-环糊精
本发明是以e-环糊精为模型，在制备得到环糊精双组氨酸衍生物的基础上，并将其 与Cu2+络合得到了具有天然酶活性的酪氨酸酶模拟酶，可催化邻苯二酚氧化生成邻苯二 醌；与现有技术相比，它具有催化活性高，不会失活等特点。
具体实施例方式
下面将结合具体实施例对本发明作详细的介绍酪氨酸酶模拟酶的制备方法，它是
A) 将环糊精按质量比l : 15 25加入千吡啶中溶解，然后按环糊精与邻-碘酰基苯甲酸的 摩尔比为1 : 0.2 0.4逐滴加入间苯二磺酰氯；在25 'C下反应1小时，停止反应，在低 于25 'C条件下减压蒸除吡啶，浅褐色残余物在液氮保护下在低于25 'C下真空干燥，得 到的粗产物按质量比1 : 8 15溶于40%质量百分比浓度的乙醇水溶液中，滤去不溶物后 按质量比1 : 8 15逐滴加到83%质量百分比浓度的乙腈水溶液中，抽滤，除去白色沉淀， 在30 。C下减压蒸除溶剂，残留物溶于适量20%质量百分比浓度的乙醇水溶液中，搅拌l 小时，在30 'C下蒸除溶剂，在20 30'C下真空干燥即得到6位双取代环糊精磺酸酯；
B) 将6位双取代环糊精磺酸酯按质量比为1 : 30 50加入到N， N-二甲基甲酰胺中，搅 拌溶解；然后按6位双取代环糊精磺酸酯与碘化钠的质量比为1 : 1 1.5加入碘化钠， 在60 90。C下搅拌反应2 45h，在40。C下减压蒸干N， N-二甲基甲酰胺；在产物中加入 丙酮，搅拌、过滤，收集滤饼再加入丙酮，重复三次，除去未反应的碘化钠；将所得固 体溶于水中，加入丙酮得到沉淀，在40 45'C下真空干燥即得到双碘代环糊精；C)将 双碘代环糊精按质量比为1 : 10 15加入到N， N-二甲基甲酰胺中，搅拌溶解；然后按双 碘代环糊精与组氨酸的质量比为1 : 0.8 1.5加入组氨酸，在8(TC下反应24小时；将反 应得到的悬浊液抽滤，收集滤液，在40。C下减压蒸馏去除溶剂，所得黄色蜡状物用丙酮洗 至丙酮变无色；所得固体溶于水中并重新用丙酮沉淀，收集沉淀物、干燥后即得到环糊 精双组氨酸衍生物；D)将环糊精双组氨酸衍生物按质量比为1:500 2000投入PH值为 7 9的磷酸盐缓冲液中，待完全溶解后，按环糊精双组氨酸衍生物与硫酸铜的摩尔比为1 : 1 5加入硫酸铜，过滤，除去不溶物，加入适量丙酮，静置，析出晶体，用丙酮洗涤， 在20 4(TC下干燥，得到酪氨酸酶模拟酶。本发明所述的环糊精为环糊精
实施例i，本发明所述的酪氨酸酶模拟酶的制备方法，它是a)将e-环糊精按质量
比1 : 15加入干吡啶中溶解，然后按3-环糊精与邻-碘酰基苯甲酸的摩尔比为1 : 0.2 逐滴加入间苯二磺酰氯；在25 r下反应l小时，停止反应，在低于25 。C条件下减压蒸 除吡啶，浅褐色残余物在液氮保护下在低于25 'C下真空干燥，得到的粗产物按质量比l :8溶于40%质量百分比浓度的乙醇水溶液中，滤去不溶物后按质量比1 : 8逐滴加到83% 质量百分比浓度的乙腈水溶液中，抽滤，除去白色沉淀，在30 'C下减压蒸除溶剂，残留 物溶于适量20 %质量百分比浓度的乙醇水溶液中，搅拌l小时，在30 。C下蒸除溶剂， 在2(TC下真空干燥即得到6位双取代环糊精磺酸酯；B)将6位双取代环糊精磺酸酯按质 量比为1 : 30加入到N， N-二甲基甲酰胺中，搅拌溶解；然后按6位双取代环糊精磺酸酯 与碘化钠的质量比为1 : 1加入碘化钠，在60'C下搅拌反应2小时，在4(TC下减压蒸干N， N-二甲基甲酰胺；在产物中加入丙酮，搅拌、过滤，收集滤饼再加入丙酮，重复三次， 除去未反应的碘化钠；将所得固体溶于水中，加入丙酮得到沉淀，在4(TC下真空干燥即 得到双碘代环糊精；C)将双碘代环糊精按质量比为1 : IO加入到N，N-二甲基甲酰胺中， 搅拌溶解；然后按双碘代环糊精与组氨酸的质量比为1 : 0.8加入组氨酸，在8(TC下反应 24小时；将反应得到的悬浊液抽滤，收集滤液，在4(TC下减压蒸馏去除溶剂，所得黄色 蜡状物用丙酮洗至丙酮变无色；所得固体溶于水中并重新用丙酮沉淀，收集沉淀物、干 燥后即得到环糊精双组氨酸衍生物；D)将环糊精双组氨酸衍生物按质量比为1:500投入 PH值为7的磷酸盐缓冲液中，待完全溶解后，按环糊精双组氨酸衍生物与硫酸铜的摩尔 比为l: l加入硫酸铜，过滤，除去不溶物，加入适量丙酮，静置，析出晶体，用丙酮洗 涤，在20 4(TC下干燥，得到酪氨酸酶模拟酶。
实施例2，它是a)将e-环糊精按质量比i: 25加入干吡啶中溶解，然后按e-环
糊精与邻-碘酰基苯甲酸的摩尔比为1 : 0.4逐滴加入间苯二磺酰氯；在25 'C下反应1 小时，停止反应，在低于25 'C条件下减压蒸除吡啶，浅褐色残余物在液氮保护下在低于 25 E下真空干燥，得到的粗产物按质量比1 : 15溶于40%质量百分比浓度的乙醇水溶液 中，滤去不溶物后按质量比l : 15逐滴加到83%质量百分比浓度的乙腈水溶液中，抽滤， 除去白色沉淀，在30 "C下减压蒸除溶剂，残留物溶于适量20 %质量百分比浓度的乙醇 水溶液中，搅拌l小时，在30 'C下蒸除溶剂，在3(TC下真空干燥即得到6位双取代环
糊精磺酸酯；B)将6位双取代环糊精磺酸酯按质量比为1 : 50加入到N， N-二甲基甲酰 胺中，搅拌溶解；然后按6位双取代环糊精磺酸酯与碘化钠的质量比为1 : 1.5加入碘化 钠，在9(TC下搅拌反应45小时，在4(TC下减压蒸干N， N-二甲基甲酰胺；在产物中加入 丙酮，搅拌、过滤，收集滤饼再加入丙酮，重复三次，除去未反应的碘化钠；将所得固 体溶于水中，加入丙酮得到沉淀，在45'C下真空干燥即得到双碘代环糊精；C)将双碘 代环糊精按质量比为1 : 15加入到N， N-二甲基甲酰胺中，搅拌溶解；然后按双碘代环糊 精与组氨酸的质量比为1 : 1.5加入组氨酸，在80。C下反应24小时；将反应得到的悬浊 液抽滤，收集滤液，在4(TC下减压蒸馏去除溶剂，所得黄色蜡状物用丙酮洗至丙酮变无色； 所得固体溶于水中并重新用丙酮沉淀，收集沉淀物、干燥后即得到环糊精双组氨酸衍生 物；D)将环糊精双组氨酸衍生物按质量比为1:2000投入PH值为9的磷酸盐缓冲液中， 待完全溶解后，按环糊精双组氨酸衍生物与硫酸铜的摩尔比为1 : 5加入硫酸铜，过滤， 除去不溶物，加入适量丙酮，静置，析出晶体，用丙酮洗涤，在4(TC下干燥，得到酪氨 酸酶模拟酶。
实施例3，它是A)将环糊精按质量比l : 20加入干吡啶中溶解，然后按环糊精与邻 -碘酰基苯甲酸的摩尔比为1 : 0. 3逐滴加入间苯二磺酰氯；在25 'C下反应1小时，停止 反应，在低于25 'C条件下减压蒸除吡啶，浅褐色残余物在液氮保护下在低于25 'C下真 空干燥，得到的粗产物按质量比1 : 10溶于40%质量百分比浓度的乙醇水溶液中，滤去不 溶物后按质量比l : 12逐滴加到83%质量百分比浓度的乙腈水溶液中，抽滤，除去白色沉 淀，在30 C下减压蒸除溶剂，残留物溶于适量20 %质量百分比浓度的乙醇水溶液中， 搅拌l小时，在30 'C下蒸除溶剂，在25X:下真空干燥即得到6位双取代环糊精磺酸酯； B)将6位双取代环糊精磺酸酯按质量比为1 : 40加入到N， N-二甲基甲酰胺中，搅拌溶 解；然后按6位双取代环糊精磺酸酯与碘化钠的质量比为1 : 1.3加入碘化钠，在75。C下 搅拌反应15小时，在40'C下减压蒸干N， N-二甲基甲酰胺；在产物中加入丙酮，搅拌、 过滤，收集滤饼再加入丙酮，重复三次，除去未反应的碘化钠；将所得固体溶于水中， 加入丙酮得到沉淀，在42'C下真空干燥即得到双碘代环糊精；C)将双碘代环糊精按质 量比为1 : 13加入到N， N-二甲基甲酰胺中，搅拌溶解；然后按双碘代环糊精与组氨酸的 质量比为1 : 1加入组氨酸，在8(TC下反应24小时；将反应得到的悬浊液抽滤，收集滤液， 在4(TC下减压蒸馏去除溶剂，所得黄色蜡状物用丙酮洗至丙酮变无色；所得固体溶于水 中并重新用丙酮沉淀，收集沉淀物、干燥后即得到环糊精双组氨酸衍生物；D)将环糊精
双组氨酸衍生物按质量比为1:1200投入PH值为8的磷酸盐缓冲液中，待完全溶解后， 按环糊精双组氨酸衍生物与硫酸铜的摩尔比为1 : 3加入硫酸铜，过滤，除去不溶物，加 入适量丙酮，静置，析出晶体，用丙酮洗涤，在3(TC下干燥，得到酪氨酸酶模拟酶。
权利要求
1一种酪氨酸酶模拟酶的制备方法，该方法是A)将环糊精按质量比1∶15～25加入干吡啶中溶解，然后按环糊精与邻-碘酰基苯甲酸的摩尔比为1∶0.2～0.4逐滴加入间苯二磺酰氯；在25℃下反应l小时，停止反应，在低于25℃条件下减压蒸除吡啶，浅褐色残余物在液氮保护下在低于25℃下真空干燥，得到的粗产物按质量比1∶8～15溶于40％质量百分比浓度的乙醇水溶液中，滤去不溶物后按质量比l∶8～15逐滴加到83％质量百分比浓度的乙腈水溶液中，抽滤，除去白色沉淀，在30℃下减压蒸除溶剂，残留物溶于适量20％质量百分比浓度的乙醇水溶液中，搅拌1小时，在30℃下蒸除溶剂，在20～30℃下真空干燥即得到6位双取代环糊精磺酸酯；B)将6位双取代环糊精磺酸酯按质量比为1∶30～50加入到N，N-二甲基甲酰胺中，搅拌溶解；然后按6位双取代环糊精磺酸酯与碘化钠的质量比为l∶1～1.5加入碘化钠，在60～90℃下搅拌反应2～45h，在40℃下减压蒸干N，N-二甲基甲酰胺；在产物中加入丙酮，搅拌、过滤，收集滤饼再加入丙酮，重复三次，除去未反应的碘化钠；将所得固体溶于水中，加入丙酮得到沉淀，在40～45℃下真空干燥即得到双碘代环糊精；C)将双碘代环糊精按质量比为1∶10～15加入到N，N-二甲基甲酰胺中，搅拌溶解；然后按双碘代环糊精与组氨酸的质量比为1∶0.8～1.5加入组氨酸，在80℃下反应24小时；将反应得到的悬浊液抽滤，收集滤液，在40℃下减压蒸馏去除溶剂，所得黄色蜡状物用丙酮洗至丙酮变无色；所得固体溶于水中并重新用丙酮沉淀，收集沉淀物、干燥后即得到环糊精双组氨酸衍生物；D)将环糊精双组氨酸衍生物按质量比为1:500～2000投入PH值为7～9的磷酸盐缓冲液中，待完全溶解后，按环糊精双组氨酸衍生物与硫酸铜的摩尔比为1∶1～5加入硫酸铜，过滤，除去不溶物，加入适量丙酮，静置，析出晶体，用丙酮洗涤，在20～40℃下干燥，得到酪氨酸酶模拟酶。
全文摘要
一种酪氨酸酶模拟酶的制备方法，它是以β-环糊精为模型，在制备得到环糊精双组氨酸衍生物的基础上，将其与Cu2+络合得到具有天然酶活性的酪氨酸酶模拟酶，可催化氧化酪氨酸生成二羟基苯丙氨酸；与现有技术相比，它具有催化活性高，不会失活等特点。
文档编号C12N9/02GK101363013SQ200810120478
公开日2009年2月11日 申请日期2008年9月8日 优先权日2008年9月8日
发明者秉 王, 胡智文, 陈文兴 申请人:浙江理工大学