专利名称：一种单增李斯特菌与志贺氏菌的荧光定量pcr检测方法
技术领域：
本发明涉及定量检测方法领域，特别是涉及一种单增李斯特菌与志贺氏菌的荧光定量PCR检测方法。
背景技术：
单增李斯特菌a"ter/a;wo"oqytoge"M)与志贺氏菌(幼/ge/to)是重要的食源性病原菌，其中单增李 斯特菌导致的李斯特菌病("WenVM")可引起脑膜炎、败血症和流产，孕妇、新生儿、老年人和免疫缺陷 病人是易感人群。动物性食品是其主要传播源，该菌在4'C仍5J以生长，对冷冻产品和速食食品构成潜在 威胁。志贺氏菌是危害严重的肠道致病菌，在我国感染性腹汚致病菌中居宵位，其导致的志贺氏菌性痢疾 (^ 'ge//0A，)是世界上，尤其是发展中国家重要的传染病之-。
单增李斯特菌能够引起致病是由丁'其产生多个毒力闪子，分别为李斯特菌溶血素O，侵袭性蛋白P60， 内化素A、 B和转录调节子基因prfA等。由hly基因编码的李斯特菌溶血素O是单增李斯特幽最重要的致
病因子，大多数PCR检测方法都将其作为靶基因，体现出r很强的特异性。志贺氏菌致病性主要由3;力质
粒介导，侵袭性质粒抗原H基囚ipaH以多个拷贝形式同日、j存在—f质粒和染色体上，将其作为PCR检测靶 基因具有灵敏度高、特异性强的特点。
发明内容
本发明的目的在于-克服上述技术的缺陷，而提供一种争增李斯特菌与志贺氏菌的荧光定量PCR检测方 法，并提供一种用于荧光定量PCR才仓测单核细胞增生李斯4争菌和志贺氏菌的特异性引物与探针序列。
本发明公开了一种食源性病原il中单增李斯特菌(/力fm'amo"oqytoge"M)与志贺氏菌(幼Zge/fe^p) 同步荧光定量PCR检测方法。
本发明的目的是通过以"F技术力案来实现的。这种单增李斯特菌与志贺氏菌的荧光定量PCR检测方法，
包括以F步骤-
(I. l)、 PCR模板DNA提取
(I. I. l)、待测样品DNA提取取lml待测rf.品进行DNA提取，取其中4个稀释度的O.lml
菌液涂布BHI平板，于37'C培养24h,进行菌落记数；hrd恃测样品-l2000rpm, 2min，弃上清-沉淀用PBS
洗两次-200ial TE重悬-加入8(il溶菌酶(10mg/ml)及2pl RNaseA (10mg/ml) ， 37'C水浴30min-按照UMQ-10
DNA提取试剂盒加入裂解液与蛋白酶K, 55'C水浴30min-后参照UNIQ-10 DNA提取试剂盒说明f 提取
DNA;(1. 1. 2)、菌液DNA提取取过夜培养的菌液，采用UNIQ-10DNA提取试剂盒提取； (1. 2)、 hly与ipaH质粒标准品的构建
(1. 3)、荧光定量PCR扩增及分析将己经计算出原始拷贝数的单增李斯特菌与志贺氏菌质粒DNA， 按10倍梯度稀释，取数量级105copies/nl到1(^c叩ies/nl作为模板加入25nl反应体系，在IQTM5荧光定量 PCR仪上进行PCR扩增，得到标准曲线；其中PCR扩增反应体系(25pl):模板DNA各1^1; 2^PremixEx TaqTM12.5jil; 10pmol/L引物各10〖unol/L探针各0.5|J;加灭菌超纯水至25^il,反应条件95°C 3min; 95°C 15s; 58.5'C lmin， 45个循环。
所述的单增李斯特菌与志贺氏菌的荧光定量PCR检测方法，所述的hly与ipaH质粒标准品的构建，具 体步骤为
(1. 2. 1)、分别通过hly与ipaH引物扩增单增李斯特菌hly与忐贺氏菌ipaH基因，扩增体系 (25|il):模板DNA l(xl; 10xTaq缓冲液2jil; Mg2+ 1.5mmol/L; dNTPs 0.25mmol/L;上、下游引物500nmol/L; TaqDNA聚合酶2U;加灭菌超纯水至25^1,反应条件预变性94°C 4min;变性94°C 30s;退火59°C 30s; 延伸72'C 20s;共35个循环，最后72'C 10min:
(1. 2. 2)、扩增产物先进行1.8%琼脂糖凝胶电泳，再经PCR产物纯化试剂盒纯化后，将其连 入pGEM-T载体，将所得重组质粒转化DH5a菌(空质粒大肠杆菌，感受态细胞)，挑单克隆菌落培养， 用质粒提取试剂盒提取质粒，进行PCR检测、电泳鉴定，DNA测序；
(1. 2. 3)、重组质粒进行EcoRI单酶切线性化，通过切胶回收得到的线性重组质粒经紫外分光 光度计测定浓度与纯度，-2(TC保存备用。
所述的单增李斯特菌与志贺氏菌的荧光定量PCR检测方法，所述hly基因的引物l (hlyl)的序列为
5'-ACAACTTCAAAAGCTTATACAGATGGA-3，，产物大小188bp;引物2 ( hly2 )的序列为5'-
GGCAAATAGATGGACGATGTGAAAT -3'; 探针 1 (probel) 的序歹ij 为
5' -TCG ATC ACTCTGGAGG ATACGTTGCTC-3'。
所述的单增李斯特菌与志贺氏菌的荧光定量PCR检测方法，所述ipaH基因的引物2 (ipaHl)的序列
为5'- TGCCTCTGCGGAGCTTCG -3'， 产物大小129bp ;弓|物2 ( ipaH2 )的序列为5'-
CCTTCTGATGCCTGATGGACCA-3' ; 探针 2 ( probe2 ) 的 序 歹U 为
5 ， -TTCGCTGTTGCTGCTGATGCCACTGA-3'。
本发明的有益效果本发明运用双重荧光定量PCR (T叫M肌探针)同步定暈检测单增李斯特菌hly 基闵和志贺氏菌ipaH基因，为食品卫生行业提供一种特异、快速、定量准确的同步定量检测单增李斯特 菌和志贺氏菌的方法。
4图1是本发明的pGEM-T Vector (T载体)图谱示意图2是本发明的双重荧光定量PCR检测单增李斯特菌重组质粒DNA的扩增曲线与标准曲线图； 图3是本发明的双重荧光定量PCR检测志贺氏菌重组质粒DNA的扩增曲线与标准曲线图； 图4是本发明的双重荧光定量PCR同步检测单增李斯特菌与志贺氏菌重组质粒DNA的扩增曲线与标 准曲线图5是本发明的双重荧光定量PCR检测人工污染脱脂灭菌乳的扩增曲线图；
具体实施例方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步地详细 描述
这种单增李斯特菌与志贺氏菌的荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤
(1. 1)、 PCR模板DNA提取
(1. 1. 1)、待测样品DNA提取取lml待测样品进行DNA提取，取其中4个稀释度的0.1ml 菌液涂布BHI平板，于37'C培养24h，进行菌落记数；1ml待测样品-12000rpm， 2min，弃上清-沉淀用PBS 洗两次-200pl TE重悬-加入8nl溶菌酶(10mg/ml)及2^RNaseA(10mg/ml) ，37。C水浴30min-按照UNIQ-10 DNA提取试剂盒加入裂解液与蛋白酶K， 55'C水浴30min-后参照UNIQ-10 DNA提取试剂盒说明书提取 DNA;
(1. 1. 2)、菌液DNA提取取过夜培养的菌液，采用UNIQ-10DNA提取试剂盒提取；
(1. 2)、 hly与ipaH质粒标准品的构建:
(1. 2. 1)、分别通过hly与ipaH引物扩增单增李斯特菌hly与志贺氏菌ipaH基因，扩增体系 (25(Al):模板DNA 1^1; 10xT叫缓冲液2pl; Mg2+ 1.5mmol/L; dNTPs 0,25mmol/L;上、下游引物50Onmol/L; TaqDNA聚合酶2U;加灭菌超纯水至25pl，反应条件预变性94°C 4min;变性94°C 30s;退火59°C 30s; 延伸72'C 20s;共35个循环，最后72'C 10min;
(1.2. 2)、扩增产物先进行1.8%琼脂糖凝胶电泳，再经PCR产物纯化试剂盒纯化后，将其连入 pGEM-T载体(图1 ，购自Promega公司)，将所得重组质粒转化DH5a菌(空质粒大肠杆菌，感受态细胞)， 挑单克隆菌落培养，用质粒提取试剂盒提取质粒，进行PCR检测、电泳鉴定，DNA测序；DNA测序结果 与GenBank序列比对显示，重组质粒所含的hly基因序列与Genbank公布的DQ844159进行核酸序列比对， 同源性为100%,而ipaH基因序列与Genbank公布的CP000035同源性为99%。通过DNAMAN软件分析 EcoRI酶切位点，显示在hly及ipaH扩增片段中均没有该位点，可以进行酶切线性化。
(1. 2. 3)、重组质粒进行EcoRI单酶切线性化，通过切胶回收得到的线性重组质粒经紫外分光光度
计测定浓度与纯度，-20^保存备用。
(1.3)、荧光定量PCR扩增及分析将已经计算出原始拷贝数的单增李斯特菌与志贺氏菌质粒DNA，
5按10倍梯度稀释，取数量级105copies/nl到10、opies/nl作为模板加入25^1反应体系，在IQTM5荧光定量
PCR仪上进行PCR扩增，得到标准曲线；其中PCR扩增反应体系(25^1):模板DNA各l^il; 2xPremixEx
TaqTM 12.5^1; 10nmol/L引物各10|iimol/L探针各0.5^1;加灭菌超纯水至25nl，反应条件95°C 3min;
95°C 15s; 58.5'C lmin， 45个循环。
将10倍梯度稀释至终浓度10Scopies尔l到10Vopies4d的单增李斯特菌和志贺氏菌线性重组质粒DNA进 行双重荧光定量PCR扩增。反应结束后IQm5荧光定量PCR仪进行结果分析，分析软件进行数据分析。根 据各反应管所测Ct值00与所含质粒DNA拷贝数浓度(x)之间的对应关系，得到双重荧光定量PCR检测 单增李斯特菌的标准曲线y=-3.4821ogO) +41.275 (i 2 = 0.999)见图l;双重荧光定量PCR检测志贺氏菌 的标准曲线_^=-3.577log(;c) +41.494 (f = 0.999)见图2;双重荧光定量PCR检测同步检测单增李斯特菌 与志贺氏菌的标准曲线分别为尸-3.7801og( jc) + 43.320 (i 2 = 0.998);产-3.574Iog(x) + 42.068 (i 2 - 0.999) 见图3。双重荧光定量PCR同步检测单增李斯特菌与志贺氏菌的扩增效率、检测低限及定量线性范围与双重 荧光定量PCR单独检测其中一种细菌相当，并且10、邻ies的C询〈40，只有单增李斯特齒hty基因的扩增效 率有所下降，但检测低限及定量线性范围未受到影响。
图2双重荧光定量PCR检测单增李斯特菌重组质粒DNA的扩增曲线与标准曲线1-5: 105; 104; 103; 102; 104考贝数FAM单增李斯特菌为荧光标记。
图3双重荧光定量PCR检测志贺氏菌重组质粒DNA的扩增曲线与标准曲线1-5: 105; 104; 103; 102; 10!拷贝数HEX为志贺氏菌为荧光标记。
图4双重荧光定量PCR同步检测单增李斯特菌与忐贺氏菌重组质粒DNA的扩增曲线与标准曲线 1-5: 105; 104; 103; 102; 10]拷贝数FAM单增李斯特菌为荧光标记HEX为志贺氏菌为荧光标记。
人工污染的脱脂灭菌乳双重荧光定量PCR检测 将菌量为10、1(^CFU/ml的人工脱脂灭菌乳提取DNA进行双重荧光定量PCR检测，结果显示双重荧光定 量PCR检测单增李斯特菌与志贺氏菌的检测低限均为1(^CFU/ml，而10'CFU/ml及阴性对照未见荧光信号 产生，见图5，双重荧光定量PCR检测人工污染脱脂灭菌乳的扩增曲线1-5: 106; 105; 104; 103; 102CFU/ml; 6: lO'CFU/ml; 7:阴性对照，PCR base line subtracted Curve Fit RFU , Cycle循环数
引物与探针
根据Genbank公布的单增李斯特菌Wy基因(单增李斯特菌溶血素O基因)序列(序列号DQ844159) 和志贺氏菌ipaH基因(志贺氏菌侵袭性质粒抗原H基因)序列(序列号CP000035),利用Beacon Designer 2.0设计引物和探针，均由上海生工合成。hly探针5'端标记FAM， 3'端标记TAMRA; ipaH探针5'端 标记HEX, 3，端标记TAMRA，设计的引物和探针序列见表1。 表1引物、探针序列及扩增产物
扩增 序列 序列 产物
基因 名称 大小(序列)(bp)
hlyhlyl5'-ACAACTTCAAAAGCTTATACAGATGGA-3'188
基因(引物l)
hly25，- GGCAAATAGATGGACGATGTGAAAT -3'
(引物2)
probe15'-TCGATCACTCTGGAGGATACGTTGCTC-3'
(探针l)
ipaHipaHl5'- TGCCTCTGCGGAGCTTCG -3'129
基因(引物1)
ipaH25，- CCTTCTGATGCCTGATGGACCA -3'
(引物2)
probe25'-TTCGCTGTTGCTGCTGATGCCACTGA-3'
(探针2)
在实验中待测样品中制作方法如下
1、 细菌培养
将-70'C保存于15%甘油中的单增李斯特菌和志贺氏菌接种到营养肉汤中复苏培养16h。单增李斯特菌 划线接种于PALCAM琼脂，志贺氏菌划线接种于SS琼脂，37°C, 48h。分别挑取单增李斯特菌、忐贺氏 菌单菌落接种于LB1和LB， 37°C、 200r/min振荡培养12-16h收集菌体用于DNA提取。
PALCAM琼脂、SS琼脂、LB1和LB均为专用培养基名称。其中，PALCAM琼脂培养基用F单增李 氏菌的选择性分离(FDA'BAM、 ISO); SS琼脂用于沙门氏菌，志贺氏菌的选择性分离培养；LB1用丁-李 氏菌二步增菌；LB肉汤用于细菌培养。
2、 人工污染样品
用0.9%生理盐水将过夜培养的单增李斯特菌与志贺氏菌菌液10倍梯度稀释，将各个稀释菌液人工污 染食品(购自当地超市的脱脂灭菌乳)，取lml脱脂灭菌乳进行DNA提取，取其中4个稀释度的0.1ml菌 液涂布BH1平板，于37'C培养24h,进行菌落记数。
上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围
内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
权利要求
1、一种单增李斯特菌与志贺氏菌的荧光定量PCR检测方法，其特征在于包括以下步骤(1. 1)、PCR模板DNA提取(1. 1.1)、待测样品DNA提取取1ml待测样品进行DNA提取，取其中4个稀释度的0.1ml菌液涂布BHI平板，于37℃培养24h，进行菌落记数；1ml待测样品-12000rpm，2min，弃上清-沉淀用PBS洗两次-200μl TE重悬-加入8μl溶菌酶(10mg/ml)及2μl RNaseA(10mg/ml)，37℃水浴30min-按照UNIQ-10 DNA提取试剂盒加入裂解液与蛋白酶K，55℃水浴30min-后参照UNIQ-10 DNA提取试剂盒说明书提取DNA；(1. 1.2)、菌液DNA提取取过夜培养的菌液，采用UNIQ-10DNA提取试剂盒提取；(1. 2)、hly与ipaH质粒标准品的构建(1. 3)、荧光定量PCR扩增及分析将已经计算出原始拷贝数的单增李斯特菌与志贺氏菌质粒DNA，按10倍梯度稀释，取数量级105copies/μl到101copies/μl作为模板加入25μl反应体系，在IQTM5荧光定量PCR仪上进行PCR扩增，得到标准曲线；其中PCR扩增反应体系(25μl)模板DNA各1μl；2×Premix ExTaqTM12.5μl；10μmol/L引物各1μl；10μmol/L探针各0.5μl；加灭菌超纯水至25μl，反应条件95℃ 3min；95℃ 15s；58.5℃ 1min，45个循环。
2、 根据权利要求1所述的单增李斯特菌与志贺氏菌的荧光定量PCR检测方法，其特征在于所述的hly与ipaH质粒标准品的构建，具体步骤为(1. 2. 1)、分别通过hly与ipaH引物扩增单增李斯特菌hly与志贺氏菌ipaH基因，扩增体系 (25mJ):模板DNA l|il; 10xT叫缓冲液2^1; Mg2+ 1.5mmol/L; dNTPs 0.25mmol/L;上、下游引物500nmol/L; TaqDNA聚合酶2U;加灭菌超纯水至25^il，反应条件预变性94°C 4min;变性94°C 30s;退火59°C 30s; 延伸72。C 20s;共35个循环，最后72'C 10min;(1. 2. 2)、扩增产物先进行1.8%琼脂糖凝胶电泳，再经PCR产物纯化试剂盒纯化后，将其连 入pGEM-T载体，将所得重组质粒转化DH5a菌(空质粒大肠杆菌，感受态细胞)，挑单克隆菌落培养， 用质粒提取试剂盒提取质粒，进行PCR检测、电泳鉴定，DNA测序；(1. 2. 3)、重组质粒进行EcoRI单酶切线性化，通过切胶回收得到的线性重组质粒经紫外分 光光度计测定浓度与纯度，-20'C保存备用。
3、 根据权利要求1所述的单增李斯特菌与志贺氏菌的荧光定量PCR检测方法，其特征在于所述hly基因的引物l (hlyl)的序列为5'-ACAACTTCAAAAGCTTATACAGATGGA-3'，产物大小188bp;引物2 (hly2 )的序列为5'- GGCAAATAGATGGACGATGTGAAAT -3';探针1 ( probel )的序列为 5 ， -TCGATC ACTCTGG AGGATACGTTGCTC-3'。
4、 根据权利要求1所述的单增李斯特菌与志贺氏菌的荧光定量PCR检测方法，其特征在于所述ipaH 基因的引物2 (ipaHl)的序列为5，-TGCCTCTGCGGAGCTTCG-3',产物大小129bp;引物2 (ipaH2) 的序列为5'- CCTTCTGATGCCTGATGGACCA-3';探针 2 ( probe2 )的序列为 5，-TTCGCTGTTGCTGCTGATGCCACTGA-3，。
全文摘要
本发明涉及一种单增李斯特菌与志贺氏菌的荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤(1)PCR模板DNA提取(1.1)待测样品DNA提取取1ml待测样品进行DNA提取，1ml待测样品-12000rpm，2min，弃上清-沉淀用PBS洗两次-200μl TE重悬-加入8μl溶菌酶(10mg/ml)及2μl RNaseA(10mg/ml)，37℃水浴30min-按照UNIQ-10DNA提取试剂盒加入裂解液与蛋白酶K，55℃水浴30min-后参照UNIQ-10DNA提取试剂盒说明书提取DNA；(1.2)菌液DNA提取；(2)hly与ipaH质粒标准品的构建(3)荧光定量PCR扩增及分析。本发明的有益效果本发明运用双重荧光定量PCR(TaqMan探针)同步定量检测单增李斯特菌hly基因和志贺氏菌ipaH基因，为食品卫生行业提供一种特异、快速、定量准确的同步定量检测单增李斯特菌和志贺氏菌的方法。
文档编号C12Q1/04GK101434992SQ20081012142
公开日2009年5月20日 申请日期2008年9月28日 优先权日2008年9月28日
发明者军 刘, 伟 徐, 李素芳 申请人:中国计量学院;李素芳