专利名称：：菌种保藏方法
技术领域：
：本发明涉及一种菌种保藏方法。技术背景根据《中华人民共和国药典》规定，药品的微生物限度检验、无菌检验中菌种的使用为阳性对照的必须品，它是一种特殊的对照品，同样为微生物限度检验、无菌检验方法学验证中所必需。因此长久以来，菌种的使用和保藏历来是微生物实验室的重点。通常使用的菌种有7种，分别为金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、黑曲霉、白色链珠菌。目前，国内药品生产企业一直运用多年前的菌种保藏技术，因为此方法运用多年，比较稳定可靠。此方法为从药检所购买低温斜面保藏的菌种正常使用。购买的菌种通常为第三代菌种，菌种的使用不能超过5代。由于该保藏方法菌种的保存时间短，保存的菌种不稳定。因此要使用一定浓度的菌种每个月需传代一次，即使用一个月后第三代就变为第四代，也就是说购买的菌种仅能使用3个月就要重新购买。每只低温斜面保藏菌种从省药检所购买来的价钱大约100圆左右，7支菌种即700余圆，药品生产企业每年在菌种方面的花费近3000圆。这样的方法非常的浪费，同样菌种使用后废弃物的处理也要非常注意，不小心就会对环境造成污染，甚至会导致没有相关知识的人生病，后果十分的严重。同时国内外相关的文件资料较少，无法解决目前的问题。
发明内容本发明提供了一种菌种保藏方法，可以延长菌种的保存时间的同时使菌种的浓度保持相对的稳定，为生产、试验节约成本，减少菌种使用后废弃物的处理和排放。本发明提供了一种菌种保藏方法，采用半固体、低温密封培养的方法将菌种接种于无菌的半固体培养基中，倒入无菌液体石蜡后竖直存放入68'C的环境温度中保存。所述菌种为金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、黑曲霉或白色链珠菌。具体过程如下(1)根据《中华人民共和国药典》规定，在如下的按质量计的配方的干粉培养基中加纯化水制成半固体培养基，分装、灭菌，然后培养2-3天，确定无菌蛋白胨10氯化钠5牛肉浸粉3琼脂4(2)将菌种穿刺接种于半固体培养基中，平行于培养基平面穿刺接种不少于3点。(3)倒入l2cm高的无菌液体石蜡，用封口膜密封，竖直存放入68'C的环境温度中保存。通过整理研究发现，大多数菌株在缺氧、低温、低养料的情况下并不会立即全部死亡，而是有80%以上的菌种处于休眠状态，一旦生存环境改变为适合其生存的条件，就会立即复苏，经过18小时左右的时间，其菌悬液的浓度即可恢复到休眠以前菌液浓度的95%左右。利用菌种的此种生理特点可以解决菌种保存时间短，保存的菌种不稳定的问题。经过多次试验发现，采用本发明可将菌种的保存时间延长，同时菌种的浓度保持相对的稳定，保存12个月的菌悬液的浓度依然可达到原液的90%左右，保存18个月的菌悬液浓度也在原液的85%以上。此种方法简单易行，对菌种的伤害很低，菌种的成功复苏的几率很大，而且在菌种使用时花费的时间较少，从复苏至使用只需20小时左右，而低温、斜面菌种保藏法则需40小时左右，提高了整个生产效率，为生产、试验节约了大量的成本。我们以药品生产企业为例假如每个菌种以此方法保存12个月，平均需要菌种为7种。原来的方法每年需要购买菌种4次，花费近3000圆。采用这种方法后，每年只需购买一次菌种，只需700圆左右，在菌种购买方面可节省近2100圆。节约生产成本近70%。同时本发明减少了菌种使用后废弃物的处理和排放，减少了废水、废物的排放，减少了对环境的危害。具体实施方式在干粉培养基中加入纯化水制成半固体培养基。按质量计，干粉培养基的组成如下蛋白胨10氯化钠5牛肉浸粉3琼脂4分装、灭菌。每试管中装入1020ml的培养基，竖直放入培养箱中培养23天，观察、试验，确定无菌后进行下一步操作。此步骤是为了保证接种的菌种的纯度不被杂菌破坏。将准备好的菌种用接种针挑取少量，穿刺接种于半固体培养基中，平行于圆形平面上穿刺接种3点，以保证菌种确定被接种至培养基中。倒入l2cm高的无菌液体石蜡，将试管塞牢，用封口膜将瓶口封好，竖直存放入68'C的电冰箱中保存，即可。各菌种保藏不同时间后复苏18-24小时的相对菌液浓度(即复苏的菌悬液浓度与原液菌悬液浓度的比值)如表1所示。表1各菌种保藏不同时间后的相对菌液浓度<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>权利要求1、一种菌种保藏方法，其特征在于采用半固体、低温密封培养的方法将菌种接种于无菌的半固体培养基中，倒入无菌液体石蜡后竖直存放入6～8℃的环境温度中保存。2、如权利要求1所述的菌种保藏办法，其特征在于所述菌种为金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、黑曲霉或白色链珠菌。3、如权利要求1所述的菌种保藏办法，其特征在于将菌种穿剌接种于无菌的半固体培养基中，平行于培养基平面穿刺接种不少于3点。4、如权利要求1或2或3所述的菌种保藏办法，其特征在于所述半固体培养基制备方法如下在如下的按质量计的配方的干粉培养基中加入纯化水制成半固体培养基，分装、灭菌，然后培养2-3天，确定无菌蛋白胨10氯化钠5牛肉浸粉3琼脂45、如权利要求1或2或3所述的菌种保藏办法，其特征在于无菌液体石蜡的高度为1-2cm。6、如权利要求1或2或3所述的菌种保藏办法，其特征在于倒入无菌液体石蜡后用封口膜密全文摘要本发明提供了一种菌种保藏方法，采用半固体、低温密封培养的方法将菌种接种于无菌的半固体培养基中，倒入无菌液体石蜡后竖直存放入6～8℃的环境温度中保存。所述菌种为金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、黑曲霉或白色链珠菌。具体过程为制备半固体培养基，分装、灭菌，然后培养2-3天，确定无菌后将菌种穿刺接种于半固体培养基中，平行于培养基平面穿刺接种不少于3点。倒入1～2cm高的无菌液体石蜡，用封口膜密封，竖直存放入6～8℃的电冰箱中保存。采用本发明可延长菌种的保存时间，同时菌种的浓度保持相对稳定，为生产、试验节约了大量的成本，减少了菌种使用后废弃物的处理和排放，减少了对环境的危害。文档编号C12R1/685GK101307293SQ20081012432公开日2008年11月19日申请日期2008年6月26日优先权日2008年6月26日发明者刘明越,卉王,蔡振利申请人:中国药科大学制药有限公司