专利名称：微生物制备木糖醇的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种微生物制备木糖醇(xylite)的方法。
背景技术：
木糖醇是五碳多元醇，是天然存在的糖醇。由于它的甜度高且其代谢不依赖胰岛素、抗龋齿等特性，是糖尿病、牙病患者理想的蔗糖代用品。木糖醇的制备可以有三条途径(1)直接从植物中提取；(2)化学法或生物法用木糖催化加氢；(3)利用微生物的方法。由于木糖醇在植物中天然存在的含量太低，直接提取很不经济。现有技术中木糖醇经化学路线合成，高压高温下在镍催化剂上还原木糖，平均生产率为所用木糖的50至60 % ，这种方法工艺复杂，成本很高，尤其是镍催化剂的使用会导致环境保护方面的问题。
生物技术方法在现有技术中己有描述，其在将木糖转化为木糖醇的过程中提供了非常高的生产率。但缺点是在强烈地表达过木糖还原酶并且同时消除了参与木糖醇天然代谢的酶的情况下，无法足够有效地提高木糖醇的生产率，以便成本有效地通过生物技术的方法路线制备木糖醇。
发明内容
本发明的目的就在于克服现有技术存在的上述不足，提供一种生产率较高的微生物制备木糖醇的方法。 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案，本发明包括如下工序 1)修饰微生物从而减少或消除除木糖还原酶以外的酶对NADH的氧化； 2)在含有木糖和5 50g/L亚硫酸盐(例如亚硫酸氢钙，亚硫酸钠，亚硫酸钾)的
底物中培养微生物； 3)在需氧生长期和限氧木糖醇生成期培养微生物；
4)自底物中富集和提取木糖醇。
本发明的有益效果 本发明使用可再生的原料并且与常规的化学方法相比，不存在因使用镍催化剂而引起的环境损害。此外，生物技术方法自身固有反应条件相对温和的特点，因此通常较化学方法更易于与环境相容。 本发明与其他生物技术相比，关键在于还原酶可以循环使用，而不用加过量还原酶，因而木糖醇的转化率更高。
具体实施方式
实施例1 描述表达异种木糖还原酶的制备酵母株 酵母中异种木糖还原酶的表达是现有技术的一部分，描述于例如W091/15588中。Pichia stipitis在100ml YPD (11培养基中包含10g酵母提取物，20g蛋白胨和20g葡萄
3糖，pH二6.5)中于3(TC培养过夜。10ml培养基中的细胞经离心成团并分离染色体DNA， 参照Kaiser等1994)的试验设计。这一 DNA用作XYL1基因956bp无内含子(introne — free)开放读码框PCR扩增的模板(Amore等1993)。所得片断在1%琼脂糖凝胶中分离并 使用Genomed的"JETQUICK Gel Extraction Spin Kit"进行纯化。质粒经相应的限制性 核酸内切酶处理并经上述方法纯化。使用P425GPD作为载体以在酿酒酵母菌中的表达。此 载体是多拷贝质粒且包含作为选择标记物的酿酒酵母菌LEU2基因(Mumberg等1995)。此 载体经相同的限制性核酸内切酶切为片断并相应地纯化。XYLI基因的开放读码框扎结于 载体中，通过质粒制备和限制性分析鉴定重组质粒。在使用此方法制备的质粒(p425GPD — PsXYLl)中，XYLI的转染易于受强GPD启动子的控制，并确保酿酒酵母菌中外源xR的高表 达。酿酒酵母菌株K0Y50 (MATa ;his3 A 1 ;leu2 A ;ura3 A 0)被p425GPD 一 PsXYLl转化，参 照Schietstl和Gietz的方法(1989)。分离并分析了 Leucin —原养型转化体。
实施例2通过基因NDE1和NDE2基因替换失活NADH脱氢酶 位于线粒体的细胞溶质的NADH脱氢酶与XR竞争辅因子NADH。为了减少细胞溶 质的NADH消耗，通过适宜的DNA片断基因替换使得基因NDE1和NDE2失活。与NDEI起始 密码子5'端40bp同源和终止密码子3'端40bp同源的替换片断经PCR扩增。此片断包含 裂殖酵母属程酒的hiss+基因和补充有酿酒酵母菌的his3突变(Wach等1997)。扩增后， 如上述方法分离纯化此片断。根据Schiestl和Gietz (1989)的方法使用替换片断转化酿 酒酵母菌株K0YS0。分离组氨酸原养型转化体。使用诊断PCR证实此片断正确整合与NDEI 取代。这一菌株(K0Y50 Andel)经p425GPD — PoXYLl转化，如实施例1所述，并用于制备 木糖醇。 如上述方法构建NDE2同源替换片断，用以制备ndel/nde2双突变体。此时使用 kanMX组件(Wach等1994)作为选择性标记物。此组件使转化体可耐受G418 (geneticine)。 转化后，K0Y50 Andel细胞置于包含G418的培养基上。杭性克隆经诊断PCR测试以确定正 确插入了替换片断并使NDE2失活。所得菌株(K0Y50 Andel Ande2)经p425GPD — PsXYLl 转化，如实施例1所述，并用于制备木糖醇。
实施例3 编码磷酸甘油脱氢酶的基因GPD1和GPD2的基因替换 细胞质的磷酸甘油脱氢酶GPDlp和GPD2p利用NADH作为辅因子。它们的失活优 先导致通过使用XR将木糖还原为木糖醇对细胞溶质的NADH的氧化。在基因替换时，使用 了酿酒酵母菌株K0Y50 A nde 1禾P /或KOYSO A nde 1 A nde2 。 这两菌株均负有ura3 AO突变。为了此分裂作用，使用了含有与GPD1和GPD2同 源的片断，如实施例2中对于NDE1的描述。包含白色假丝酵母URA3基因的片断作为选择 性标记物。此选择性标记物侧翼的DNA部分彼此相同。白色假丝酵母的URA3补充酿酒酵 母菌中ura3突变。 尿嘧啶代谢未受损的细胞与ura3突变细胞相反，对于5 — Forodica aid(5 — FOA)敏感。将分裂盒整合入基因组后，在重复DNA部分上生成自发同源重组并因此失去 URA3标记物。发生这样的重组的克隆可被简便的分离，因为它们能耐受5 — F0A。
上述DNA片断经PCR扩增并纯化。CPD1基因替换片断根据Schiestl和Cietz(1989)在酿酒酵母K0Y50 A ndel和/或K0Y50 A ndel A nde2中的方法转化。
尿嘧啶原养型转化体在相应的选择培养基上分离。通过诊断PCR替换GPD1。接 着，此方法构建的菌株经5 — FOA耐受选择。在5 — FOA耐受的菌株中，通过诊断PCR检 测URA3标记物的损失。最后，如上所述，在进一步的工作中失活GPD2。这样构建的菌株经 p425GPD-PsXYLl转化，如实施例1所述，并用于制备木糖醇。
实施例4 通过四分体分析(tetrad analysis)脱氢酶失活的菌株的制备为了制备几种脱氢 酶失活的菌株，首先分别失活各相关基因，如实施例2中所述。随后杂交育种各突变体并因 此形成d印loid菌株的袍子，进行四分体分析。 双突变体可在非亲代双型(NPD)中简便地鉴定。K0Y50株用于失活GPD1和GPD2， 如实施例2中对于NDEI的描述，各自被基因替换。杂交相反配对型的转化体，所得菌株在 相应培养基上导致袍子形成(s porilate)。四分体测试组氛酸原养型。NPD四分体GPD1/ GPD2双零突变体作为组氨酸一原养型单袍子的克隆而被分离，经p425GPD — PsXYLl转化， 并用于制备木糖醇。
权利要求
微生物制备木糖醇的方法，其特征在于本发明包括如下工序1)修饰微生物从而减少或消除除木糖还原酶以外的酶对NADH的氧化；2)在含有木糖和5～50g/L亚硫酸盐的底物中培养微生物；3)在需氧生长期和限氧木糖醇生成期培养微生物；4)自底物中富集和提取木糖醇。
2. 根据权利要求1所述的微生物制备木糖醇的方法，其特征在于所述的亚硫酸盐可为 亚硫酸氢钙，亚硫酸钠，亚硫酸钾中的一种或其混合物。
全文摘要
微生物制备木糖醇的方法属于生物技术领域，涉及一种微生物制备木糖醇(xylite)的方法。本发明提供一种生产率较高的微生物制备木糖醇的方法。本发明包括如下工序1)修饰微生物从而减少或消除除木糖还原酶以外的酶对NADH的氧化；2)在含有木糖和5～50g/L亚硫酸盐(例如亚硫酸氢钙，亚硫酸钠，亚硫酸钾)的底物中培养微生物；3)在需氧生长期和限氧木糖醇生成期培养微生物；4)自底物中富集和提取木糖醇。本发明与其他生物技术相比，关键在于还原酶可以循环使用，而不用加过量还原酶，因而木糖醇的转化率更高。
文档编号C12P19/02GK101705266SQ20081013215
公开日2010年5月12日 申请日期2008年7月21日 优先权日2008年7月21日
发明者郑春辉 申请人:郑春辉