专利名称：一种利用具有茎环样结构引物通过pcr制备单链dna的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用具有茎环样结构引物通过PCR制备单链DNA的方法，主要特征 是带有茎环结构的引物分子的使用，包括5'端的反向重复序列，GC含量以及二级结构； 涉及PCR反应条件；涉及发明中茎环结构的引物和PCR在单链DNA制备中的应用。
技术背景-
与RNA分子一样，单链DNA (ssDNA)结构灵活易变，三维结构复杂，很容易形成 与靶标结合的口袋结构，因此单链DNA寡核苷酸配基(aptamer)在分子识别、化学分析 及生物医药领域具有广阔应用前景。特别是在SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)技术研究与应用中，ssDNA的制备更是关键。SELEX技术 是通过反复将单链随机DNA文库与耙分子孵育、分离结合的单链DNA、 PCR扩增，最终 获得高亲和力的与靶分子特异结合的ssDNA序列(aptamer) ( Tuerk C， et al. Science 1990:249:505-510)。 SELEX筛选的一个关键步骤是富集后单链DNA文库的再制备，将 PCR产生的双链产物中的负链去除，保留具有结合能力的正链。假设某一ssDNA文库中混 有dsDNA成分，那么随着筛选轮数的增加，文库中dsDNA的比例不仅会增加，而且能形成 稳定的双螺旋结构不与靶分子结合，最终导致特异性的ssDNA配基丢失，SELEX筛选失败。 除了SELEX筛选，其它生物医学领域也常常需要制备单链的DNA。因此，有效的ssDNA制备
方法将便利生物医学研究。
当前，制备ssDNA的方法很多，如直接化学合成、RNA逆转录、不对称PCR、亲和素 标记磁珠分离等。但在实际应用中，这些方法均存在一些问题，例如1、直接化学合成 法是方便简单，但是利用该法只能合成已知序列或事先设计好的随机序列ssDNA文库，对 于经SELEX筛选富集获得的未知序列不适用。2、不对称PCR制备单链产物时产物容易发生 弥散，原因可能与PCR体系离子强度、dNTP浓度等有关，特别是以经过数轮SELEX筛选后 的文库作为模板先PCR扩增成dsDNA，再经不对称PCR制备单链产物时更易出现弥散现象； 另外，不对称PCR在前10-15个循环通常都产生双链产物，因此这种方法制备的单链纯度 不高，存在互补负链干扰的弊端3、亲和素标记磁珠分离制备单链DNA时，生物素标记PCR 产物的负链，亲和素包被的磁珠分离的手段能获得高纯度的正链DNA，但该方法分离前需 要先纯化PCR产物去除生物素化引物的干扰，而且回收效率往往不能满足实验需求。磁珠 价格昂贵也是制约实验的一个因素；另外，如果下游实验要用到生物素标记的正链DNA，则无法应用磁珠的方法制备单链；4、 RNA逆转录制备单链DNA需要先将ssDNA转录成RNA， RNA分子容易降解造成配基的丢失，而且转录模板需要引入转录酶识别序列，这些序列如 果和ssDNA退火，便可能影响筛选，因此操作复杂不实用。
Kelly P. Williams(Nucleic acids research, 1995, 4220-4221)等介绍了一种新的利用特殊 引物PCR制备单链的方法，该反义引物由三个部分组成，5'端加长序列-终止子-互补序列。 互补序列与模板退火，发挥引物的功能；终止子为一个T叫酶不能穿越的非核苷酸物质， 六乙烯乙二醇(HEGL)分子，用于阻止正义链的延伸；5'加长序列为20个dA组成的聚A 尾巴，用于生成长链的PCR产物。因此，反义引物和模板退火并在Taq酶作用下会延伸产 生一个长于模板20个碱基的负链产物，而当正义引物以此反义链为模板延伸时，由于Taq 酶不能越过HEGL，正链的延伸因此终止，故正链的长度与模板一样。在变性的PAGE凝 胶上，两条链可以明显分开进而分离纯化单链DNA。这种方法在单链DNA的制备方面具 有明显的优越性，例如价格低廉、PCR—步获得等，但受修饰的限制，在合成引物时需 要HEGL修饰，很多公司不具备这种能力。单链的加长序列也可能会和模板区退火影响扩 增效率，尤其在体外筛选后期，随机区可能会含有多个dT等富集序列的情况时。
受上述思路启发，本发明巧妙地利用了二级结构的DNA模板阻止Taq酶延伸的特性， 改进反义引物，不需要特殊修饰即可产生不同长度的PCR产物。反义引物含有两部分， 除了3'端的模板互补序列，5'端引进能形成茎环二级结构的一段反向重复序列，由于反 向重复序列富含GC碱基，具有较高的Tm值，在T叫酶能较好的发挥作用的温度范围内(55 °C-65°C)仍然会保持二级结构，从而阻止正链的延伸。因此，PCR产物的两条链长度不 同，相差反向重复序列的长度，在变性的PAGE凝胶上两条单链可以明显地分开进而分离 纯化ssDNA。
本发明所述制备ssDNA的方法，除了可用于SELEX技术中，在基础医学、医药学 中均可得到广泛应用。
发明内容
本发明目的在于设计带有茎环结构的引物，利用PCR产生不同长度的正、负链产物， 提出通过茎环结构引物和PCR制备单链DNA的方法。 本发明通过以下技术方案实现
首先设计带有茎环结构的下游引物Pstemloop。其3'端为与模板互补的20个碱基，5' 端为富含GC碱基的一段反向重复序列，能够产生一段长的互补茎和小的环结构，阻止 Taq酶延伸，从而导致下游引物延伸产物长。上游引物为与模板互补的碱基序列。PCR反应变性程序与通常PCR同，退火条件根据引物序列互补区碱基序列而定，
延伸温度适当降低，设定在55'C-65'C之间，延伸时间适度延长，视模板长度而定。 PCR扩增后，通过变性胶鉴定两条产物链，切胶回收目的单链DNA。
本发明优点
1) 本发明通过设计具有稳定茎环结构的引物和优化PCR反应条件，引物无需修饰，通 过PCR反应即可获得不同长度的单链产物，直接切胶回收目的单链DNA。因此，操 作简单、省时、廉价，获得的单链DNA纯度高，回收效率高。
2) 本发明解决了传统SELEX操作中的单链DNA制备中的瓶颈问题，在其它涉及到单 链DNA制备的生物医学领域也有广泛的应用价值，因而将有广阔的市场前景和经济 效益。
图1本发明设计的引物产生的茎环结构。
图2茎环结构引物PCR扩增产生不同长度延伸产物原理图。
图3不同模板单链DNA经茎环结构引物扩增产生不同长度单链产物的电泳图。
1、 GP45 ssDNA模板；2、 GP45 ssDNA经茎环结构引物PCR扩增的产物；3、 LG45 ssDNA
经茎环结构引物PCR扩增的产物；4、 LG45 ssDNA模板；M、双链DNA分子量标准。
图4引物的延伸产物放射性自显影图。
具体实施方式
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下面通过分别针对不同的单链DNA模板设计的茎环结构下游引物及PCR来详细说 明本发明。
1.针对不同的单链DNA模板设计茎环结构的下游引物-GP45模板(88nt):
5' -GCAATGGTACGGTACTTCC(45N)CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3' 引物
上游引物(Plong-1):5， -GCAATGGTACGGTACTTCC-3' 下游引物(P11): 5' -TTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTTG-3'
茎环结构下游引物(Pstemlo叩)(图l):
5 ， - -3'LG45模板(81nt):
5， -GCCTGTTGTGAGCCTCCT (45N) CGCTTATTCTTGTCTCCC-3， 引物
上游引物(LGP5): 5， -GCCTGTTGTGAGCCTCCT
茎环结构下游引物(LGP3stemloop)(图l):
注下划线序列为含反向重复序列的萃:环结构部分。
上述模板及引物序列由Iiwitrogen公司合成后，分别用双蒸水溶解，引物稀释成50 uM， -20°。存放，备用。
2. 放射性同位素标记引物
利用T4 Polynucleotide Kinase禾卩[y-32P] ATP ，通过磷酸化反应对合成的寡核苷酸 引物的5'端进行放射性标记。按DNA5'末端标记试剂盒(MEGALABELKit， TaKaRa Biotechnology Co.,Ltd, D6070)说明进行。10^1体系中含有5-10pmole引物，50uCi [Y-32P] ATP及10U T4 PNK。 37°C磷酸化反应40min， 70°C 10min灭活酶。乙 醇沉淀的方法去除大部分未反应的[Y，P] ATP，纯化标记的引物。
3. PCR扩增
PCR体系100ul体系中含有10ul IOX缓冲液，0.2mMdNTPs， 0.5 y M上游及下 游引物，10nM模板，2UTaqDNA聚合酶。
PCR条件:95。C预变性5min; 94'C变性lmin， 37。C退火30sec， 58。C延伸40sec，扩 增30个循环；最后58'C终延伸2min。
4. 鉴定
7M尿素10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、Goldview染色或银染鉴定(图3)。或者放 射性自显影分析引物延伸位置(图4)。
5. 目的单链切胶回收
(1) 将染色后的胶放在长波紫外灯上，打开紫外灯，观察DNA电泳条带；
(2) 在防护罩防护下，锐利刀片切取目的条带，并移入1.5ml离心管中。
(3) 加入400^1凝胶洗脱缓冲液(0.5mol/LNH4Ac， 0.2%SDS， lm mol/L EDTA， pH8.0， 7M尿素)，于37。C洗脱6hr以上；
(4) 吸取洗脱液到新的1.5ml离心管中，不要将凝胶吸出；
(5) 加入1/100体积的1M MgC12， 1/10体积的3 mol/LNaAc(pH5.2)， 2.5倍体积的 无水乙醇，-70卩放置6111以上；(6) 4°C， 14000r/m，离心30min;
(7) 弃去上清，沉淀用4。C预冷的70。/。乙醇冲洗后离心同6;
(8) 弃去上清，沉淀于室温干燥；
(9) 将干燥好的DNA溶于适量三蒸水中。-20匸保存备用。 实验结果-
利用茎环结构下游引物经PCR扩增产生了两条长度不等的正、负链产物，在变性 胶上可明显得到分离。
由图3可以得到结论茎环结构引物经PCR扩增产生了两条长度不等的正、负链 产物，且该结构引物适用于不同的DNA模板。
由图4可以得出结论茎环结构下游引物延伸产物为长链，较模板多出茎环结构部 分的序列，因而迁移慢；上游引物延伸产物绝大部分与模板位置相同，为目的正链，
少量由于下游引物茎环结构解链而产生长链。
权利要求
1.一种利用具有茎环样结构的引物通过PCR方式制备单链DNA的方法。其特征在于通过PCR可以产生两条长度不同的正、负ssDNA链，在变性的PAGE凝胶上两条单链可以明显地分开和分离。
2. 根据权利要求1中所述方法，茎环结构的下游引物5'端是含有一段富含GC 碱基的反向重复序列，具有较高的Tm值并形成稳定的茎环结构。
3. 根据权利要求1中所述方法，茎环结构的下游引物5'端在Taq酶能较好的 发挥作用的温度范围内仍然会保持二级结构。
4. 根据权利要求1中所述方法，PCR的延伸温度可以为55'C-65'C任一数目。
5. 权利要求1所述利用茎环结构的引物通过PCR产生不同长度正、负链产物的 方法，在制备单链DNA领域中的应用。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，涉及一种利用茎环样结构的引物经PCR制备不同长度的正、负链产物，切胶回收制备单链DNA的方法。通过针对不同的DNA模板设计的下游茎环结构引物，改进PCR条件，证实PCR产物均为预期的长、短两条链，可以很容易的通过变性胶分离、纯化。本发明在涉及单链DNA制备的生物医学研究领域包括SELEX技术方面具有广泛的应用前景。
文档编号C12P19/34GK101619335SQ20081013291
公开日2010年1月6日 申请日期2008年7月1日 优先权日2008年7月1日
发明者丁红梅, 刘农乐, 曹晓晓, 李少华, 沈倍奋, 邵宁生 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所