专利名称：：导入外源总dna培育抗旱玉米自交系的方法
技术领域：
：本发明涉及一种通过玉米花丝切面经花粉管渗入胚囊定向导入抗旱植物摩擦禾或高粱或谷子外源总DNA培育新型抗旱性玉米自交系的方法。
背景技术：
：我国1978年首先提出用植物总DNA通过花粉管通道对作物进行DNA片断的转化，并首先用放射自显影的方法在棉花胚珠的花粉管通道和胚囊中看到带有同位素标记的DNA，证明转化时注入的DNA进入了胚囊。随后国内许多育种单位开展了通过花粉管通道将DNA导入植物的研究。通过花粉管通道进行外源DNA导入的技术已越来越多地被用于作物育种，并得到了迅速发展，取得了令人瞩目的成果。已经开展DNA直接导入育种的作物包括主要的大田粮油和经济作物，并扩大到蔬菜、树木等，所采用的供体有品种间的、也有广泛的种、属、科间等的远缘供体，有的甚至用动物DNA。利用花粉管通道向植物导入外源DNA(包括天然DNA大分子，天然DNA片段和经人工改造构建的重组DNA)，现有的方法一般分为注射法和滴加法。注射法是在授粉后一定时间，即在花粉萌发后花粉管穿过雌蕊组织到达胚囊这一时间段内，将外源DNA用注射器注入具有花粉管通道的组织上或组织内部，使DNA进入合子并整合到基因组中，然后通过自然结实获得转化种子。滴加法也是在花粉萌发后花粉管穿过雌蕊组织到达胚囊这一时间段内，将花柱切断，将外源DNA滴加在切面上，或者不切断花柱，将外源DNA直接滴加在柱头上，使DNA沿花粉管通道涌入胚囊，进入合子并整合到基因组中，然后通过自然结实获得转化种子。用注射法和滴加法将外源天然DNA导入棉花的方法。受体材料是棉株上已经自交受精的隔日幼铃。操作方法是，在去除花冠、雄蕊、柱头和花柱后，用微量进样器从幼铃顶端向下插入胎座，将外源DNA注入(注射法)。或者，直接在花柱的切口处滴加外源DNA(滴加法)。其中注射法的结实率为29.3-32.7%，对照结实率91一100%),滴加法的结实率为31-33%(相对结实率接近100%)。通过花粉管通道转化植物的方法具有操作简单，对仪器设备要求低的优点，适宜于所有有性繁殖的被子植物。因为有性繁殖的被子植物，其胚珠是由子房包被的，花粉管通过花柱进入子房包被的胚囊中。而且这种转化方法能够直接得到转化种子，不需要组织培养再生过程，适用的植物种类(品种)广泛。
发明内容本发明的目的是提供一种改进的将外源抗旱物种总DNA通过玉米花粉管通道导入玉米胚囊的操作方法。该方法转化玉米培育抗旱种质目的性强、水平高，导入后的结实率高，并具有较高的稳定性(可重复性)。上述的目的通过以下的技术方案实现:导入外源总DNA培育抗旱玉米自交系的方法，用十六垸基三乙基溴化铵法提取摩擦禾或高粱或谷子外源总DNA，在玉米人工授粉并萌发出花粉管后，从花粉管到达胚囊开始到合子第一次分裂为止的时间段内，沿玉米雌穗苞叶顶部处整齐剪去花丝，并以手术刀将中间的花丝割去，使雌穗包叶与花丝形成1个穴状空间，将含有摩擦禾或高粱或谷子总DNA溶液滴加在穴状空间内，使DNA溶液与花丝的横切面充分接触。所述的导入外源总DNA培育抗旱玉米自交系的方法，所述的将含有摩擦未或高梁或谷子总DNA溶液滴加在穴状空间内的位置是由苞叶与花丝所形成的穴状空间，空间一般直径小于1.511。所述的导入外源总DNA培育抗旱玉米自交系的方法，所述的沿玉米雌穗苞叶顶部处整齐剪去花丝是在人工授粉后6-18小时内进行的。所述的导入外源总DNA培育抗旱玉米自交系的方法，将含有摩擦禾或高粱或谷子总DNA溶液滴加在穴状空间内后，雌穗马上套上硫酸纸袋以防止DNA溶液被风吹干以及挥发。所述的导入外源总DNA培育抗旱玉米自交系的方法，含有摩擦未或高粱或谷子总DNA溶液是溶解于10mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐与10mmol/L乙二胺四乙酸缓冲液中的DNA溶液，DNA的浓度为100-500將/ml。所述的导入外源总DNA培育抗旱玉米自交系的方法，外源DNA溶液在穴状空间内重复滴用l次，间隔时间为5—10分钟，所述的剪除花丝与滴加摩擦禾或高粱或谷子总DNA溶液应在充分降雨或灌溉后24小时进行的。这个技术方案有以下有益效果51.在常规育种中，玉米与抗旱的摩擦禾(高粱或谷子)无法进行杂交来转移抗旱特性，本发明则通过抗旱物种总DNA滴加在授粉玉米花粉管上的办法，将摩擦禾(高粱或谷子)抗旱的遗传特性转移到现有玉米自交系中，创造性地培育玉米抗旱新种质，转化效率高。为玉米抗旱育种提供了一个可行的思路与方法。2.本发明转化玉米培育抗旱种质目的性强、水平高，导入后的结实率髙，并具有较高的稳定性(可重复性)。本发明的具体实施例方式实施例l:供试的导入受体材料为玉米自交系R1037(引自加拿大，一般配合力高，不耐旱)。所用供体DNA为摩擦未的总DNA，总DNA为幼嫩叶片经CTAB法提取，纯化后DNA溶于10mmol/L三羟甲基氨基甲垸盐酸盐与10mmol/L乙二胺四乙酸缓冲液(PH8,0的缓冲液中，将浓度调整到500lig/ml)。外源基因导入一、受体的选择选择健壮的自交系植株50株为转化受体，在雄穗散粉前将雄穗以及雌穗套袋，防止串粉。二、授粉雄穗散粉后，人工授粉，记录授粉时间。雌穗继续套袋防止串粉。处理和空白对照均在同一时间进行授粉。三、DNA导入根据天气状况，在授粉6-18小时内，用锐利的剪刀沿苞叶剪齐花丝，用手术刀在花丝中间切去大部分花丝，使苞叶与花丝形成穴状空间。立即滴2-3mlDNA溶液，连续滴加两次，间隔时间约5分钟。空白对照，操作方法同前，但滴加的溶液为不含DNA的10mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐与10mmol/L乙二胺四乙酸缓冲液(pH8.0)缓冲液。四、标记及收获导入操作过的雌穗，处理后继续套袋并且挂牌，写明自交系名称、处理日期及导入DNA类别。及时观察处理的雌穗，防止腐烂，要及时收获。五、抗旱性筛选将DO代种子以雌穗为单位编号进行抗旱性筛选。抗旱性筛选方法采用3种方法连续进行抗旱种质的筛选。1采用萌发期模拟干旱胁迫筛选选择当年导入获得种子数的一半用于萌发期筛选。种子灭菌蒸馏水冲洗3遍，种子萌发于30'C光照培养箱内，放在直径为9cm的灭菌培养皿中，每皿20粒，3次重复，加入20mL(0.6Mpa)的PEG6000水溶液胁迫，以20mL水处理作对照，处理8d后，选择胚根、胚芽较长、初生根条数多、芽势强的种子用苗期下一步的抗旱性处理。2苗期模拟干旱胁迫筛选苗期抗旱的种子播种在高40cm、长100cm的种子箱内，在种子箱底部铺土，播种后浇水，在三叶期定苗，20株/箱，3次重复。同时开始进行干旱胁迫处理。在50%幼苗达永久萎蔫时，浇水使苗恢复，再干旱处理使之萎蔫，重复2-3次，最后筛选苗势中等以上的植株进入大田干旱胁迫筛选。3全生育期模拟干旱胁迫筛选试验设在防雨棚内进行。设2个试验处理，干旱胁迫:全生育期干旱胁迫，用于导入获得另一半种子的筛选(出苗后浇1次水至成熟不灌水);非旱胁迫:全生育期满足水分供应，所用种子为M017对照(全生育期灌水2-3次，总灌水量200mm左右)。每个处理分别重复3次。种植密度为60000株/hm2。收获时选取干旱胁迫处理区的植株，测定单株产量，以非旱胁迫处理平均单株产量为对照，用抗旱指数(DRI)表示各基因型的抗旱性来筛选抗旱性植株。导入结果与筛选结果导入结果滴加外源DNA处理雌穗的结实率低于未处理的空白对照，但仍能得到足够用于筛选的种子。结实率达32%以上。每穗平均结实粒数为89.5个。2005年共获得导入种子粒数4021个、2006年获得导入种子粒数3548个。筛选结果(见表l):2006年筛选芽期抗旱种子数496个(占筛选种子数的24.7。/。，2010个导入种子用于筛选)；芽期抗旱苗数268个(占芽期抗旱种子数的54.03%)，收获期按照抗旱性指数筛选，最终收获雌穗52个；全生育期干旱胁迫抗旱植株数为69个，2006年筛选最终获得抗旱植株121个，占总导入种子数的3.00%。2007年筛选芽期抗旱种子数457个(占筛选种子数的25.7%,1774个导入种子用于筛选)；芽期抗旱苗数201个(占芽期抗旱种子数的43.98%)，收获期按102个，2006年筛选最终获得抗旱植株134个，占总导入种子数的3.78%。2007年继续对2006年筛选获得的抗旱植株种子进行抗旱性鉴定，以高抗旱性自交系自330为对照，全生育期继续进行干旱胁迫用于进一步抗旱性的稳定性筛选。综合2006与2007年两年的筛选以及经过海南加代，2008年共计获得稳定抗旱性自交系新种质58份，部分性状优良的自交系已经进行了一般配合力的测定，进行了杂交组合的配制，杂交种表现极强的抗旱能力。从初始导入雌穗与最终获得的稳定抗旱自交系来看，平均导入l个玉米雌穗，可以获得0.58份稳定自交系，效率很高。表12006年与2007年抗旱性筛选结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实施例2:导入外源总DNA培育抗旱玉米自交系的方法，其特征是用十六垸基三乙基溴化铵法提取摩擦未或高粱或谷子外源总DNA，在玉米人工授粉并萌发出花粉管后，从花粉管到达胚囊开始到合子第一次分裂为止的时间段内，沿玉米雌穗苞叶顶部处整齐剪去花丝，并以手术刀将中间的花丝割去，使雌穗包叶与花丝形成1个穴状空间，将含有摩擦未或高粱或谷子总DNA溶液滴加在穴状空间内，使DNA溶液与花丝的横切面充分接触。实施例3:所述的导入外源总DNA培育抗旱玉米自交系的方法，其特征是所述的将含有摩擦禾或高粱或谷子总DNA溶液滴加在穴状空间内的位置是由苞叶与花丝所形成的穴状空间，空间一般直径小于l.Scm。实施例4:所述的导入外源总DNA培育抗旱玉米自交系的方法，其特征是所述的沿玉米雌穗苞叶顶部处整齐剪去花丝是在人工授粉后6-18小时内进行的。实施例5:所述的导入外源总DNA培育抗旱玉米自交系的方法，其特征是将含有摩擦禾或高粱或谷子总DNA溶液滴加在穴状空间内后，雌穗马上套上硫酸纸袋以防止DNA溶液被风吹干以及挥发。实施例6:所述的导入外源总DNA培育抗旱玉米自交系的方法，其特征是含有摩擦禾或高粱或谷子总DNA溶液是溶解于10mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐与10mmol/L乙二胺四乙酸缓冲液中的DNA溶液，DNA的浓度为100-500照/ml。实施例7:所述的导入外源总DNA培育抗旱玉米自交系的方法，其特征是外源DNA溶液在穴状空间内重复滴用l次，间隔时间为5—10分钟。实施例8:所述的导入外源总DNA培育抗旱玉米自交系的方法，其特征是所述的剪除花丝与滴加摩擦禾或高粱或谷子总DNA溶液应在充分降雨或灌溉后24小时进行的。实施例9:在玉米人工授粉后6-18小时萌发出花粉管后，从花粉管到达胚囊开始到合子第一次分裂为止的时间段内，在雌穗上部沿苞叶整齐剪齐花丝，再由苞叶与花丝组成的平面上用手术刀将中间的花丝切除2-5mm,形成一个由苞叶与花丝组成的穴状空间，将摩擦禾(高粱或谷子)总DNA溶液滴在其中，然后使玉米自然结实，其中的外源总DNA是具有抗旱特性的种质摩擦禾(高粱或谷子)的DNA，含有抗旱特性的遗传物质。剪除花丝以及滴加DNA溶液的操作是在15-25'C条件下进行的，所述的总DNA溶液滴加在苞叶与花丝组成的穴状空间，重复滴加l次。所述的受体植物是玉米，切除花丝的操作是在授粉后6-18小时内进行的，所述的防止液滴滑落的措施是沿苞叶剪平花丝，用手术刀切中间的花丝，使苞叶与花丝形成一个穴状空间，然后将DNA溶液滴加在穴中。所用的外源总DNA溶液为溶解于10mmol/L三羟甲基氨基甲垸盐酸盐与10mmol/L乙二胺四乙酸缓冲液中的DNA溶液，DNA的浓度范围为100-500ug/ml。将人工授粉后6-18小时的玉米花丝用剪刀沿雌穗苞叶剪齐，DNA溶液滴在其上面，DNA分子通过花粉管萌发的途径到达胚囊，也可以通过花粉管腔进入胚囊，与合子整合并整合到基因组中，通过自然结实直接得到转化种子。选用具有自交系特征明显的健壮植株。剪除花丝以及滴加DNA溶液的操作环境温度，最好是在15-25'C之间。温度过高，花丝褐化速度快、胚囊组织中DNA酶的活性强，对外源DNA的破坏作用强，转化效率低；温度过低，花粉管生长受阻，授精延迟，也不易得到有效转化。所以超出该温度范围都容易造成转化率下降。剪除花丝的操作是在玉米人工授粉并且萌发出花粉管后，从花粉管到达胚囊开始到合子第一次分裂为止的时间段内进行的。这一时期一般情况下为授粉后6-18小时。上述时期是指在正常的土壤温度、湿度和气候条件下。如土壤潮湿，可以推后6-10小时，即在12-28小时以后再剪除花丝进行导入操作，以适应花粉管生长以及受精的滞后。所述的穴状空间是由雌穗苞叶以及花丝组成的凹状穴、花丝横切面低于苞叶。剪切工具为锋利的剪刀以及手术刀等锐利工具，以保证花粉管腔等组织在切断后保持其原来固有的形状。穴状空间做成后，迅速将待转化的DNA溶液滴加到该空间内。由于在这一操作过程中容易受到自然因素如风力、露水或人为触碰等影响，造成DNA溶液蒸发、稀释变化，最好重复滴加一次。滴加到穴状空间上的外源DNA的浓度范围最好为100-50(Hig/ml。浓度低导入效果差，浓度过高则DNA在花粉管中运动速度慢，不能在合子第一次分裂时同基因组DNA整合，转化效果差。为了防止DNA液体蒸发过快，可以补充滴加一次DNA溶液。所述的外源总DNA为摩擦未(高梁和谷子)的天然总DNA或天然总DNA片段，这些DNA应配制成10mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐与10mmol/L乙二胺四乙酸缓冲液溶液为溶剂的液体供导入操作。10权利要求1.一种导入外源总DNA培育抗旱玉米自交系的方法，其特征是用十六烷基三乙基溴化铵法提取摩擦禾或高粱或谷子外源总DNA，在玉米人工授粉并萌发出花粉管后，从花粉管到达胚囊开始到合子第一次分裂为止的时间段内，沿玉米雌穗苞叶顶部处整齐剪去花丝，并以手术刀将中间的花丝割去，使雌穗包叶与花丝形成1个穴状空间，将含有摩擦禾或高粱或谷子总DNA溶液滴加在穴状空间内，使DNA溶液与花丝的横切面充分接触。2.根据权利要求1所述的导入外源总DNA培育抗旱玉米自交系的方法，其特征是所述的将含有摩擦禾或高粱或谷子总DNA溶液滴加在穴状空间内的位置是由苞叶与花丝所形成的穴状空间，空间一般直径小于1.5cm。3.根据权利要求1或2所述的导入外源总DNA培育抗旱玉米自交系的方法，其特征是所述的沿玉米雌穗苞叶顶部处整齐剪去花丝是在人工授粉后6-18小时内进行的。4.根据权利要求1或2所述的导入外源总DNA培育抗旱玉米自交系的方法，其特征是将含有摩擦未或高粱或谷子总DNA溶液滴加在穴状空间内后，雌穗马上套上硫酸纸袋以防止DNA溶液被风吹干以及挥发。5.根据权利要求3所述的导入外源总DNA培育抗旱玉米自交系的方法，其特征是将含有摩擦禾或高粱或谷子总DNA溶液滴加在穴状空间内后，雌穗马上套上硫酸纸袋以防止DNA溶液被风吹干以及挥发。6.根据权利要求1或2或5所述的导入外源总DNA培育抗旱玉米自交系的方法，其特征是含有摩擦未或高粱或谷子总DNA溶液是溶解于lOmmol/L三羟甲基氨基甲垸盐酸盐与10mmol/L乙二胺四乙酸缓冲液中的DNA溶液，DNA的浓度为100-500jig/ml。7.根据权利要求3所述的导入外源总DNA培育抗旱玉米自交系的方法，其特征是含有摩擦禾或高粱或谷子总DNA溶液是溶解于10mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐与10mmol/L乙二胺四乙酸缓冲液中的DNA溶液，DNA的浓度为100-500jig/ml。8.根据权利要求4所述的导入外源总DNA培育抗旱玉米自交系的方法，其特征是含有摩擦禾或高粱或谷子总DNA溶液是溶解于10mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐与10mmo!/L乙二胺四乙酸缓冲液中的DNA溶液，DNA的浓度为100陽500將/ml。9.根据权利要求l或2或5或7或8所述的导入外源总DNA培育抗旱玉米自交系的方法，其特征是外源DNA溶液在穴状空间内重复滴用1次，间隔时间为5—10分钟，所述的剪除花丝与滴加摩擦禾或高粱或谷子总DNA溶液应在充分降雨或灌溉后24小时进行的。10.根据权利要求3所述的导入外源总DNA培育抗旱玉米自交系的方法，其特征是外源DNA溶液在穴状空间内重复滴用1次，间隔时间为5—10分钟，所述的剪除花丝与滴加摩擦禾或高粱或谷子总DNA溶液应在充分降雨或灌溉后24小时进行的。全文摘要导入外源总DNA培育抗旱玉米自交系的方法。我国1978年首先提出用植物总DNA通过花粉管通道对作物进行DNA片断的转化，并首先用放射自显影的方法在棉花胚珠的花粉管通道和胚囊中看到带有同位素标记的DNA，证明转化时注入的DNA进入了胚囊。用十六烷基三乙基溴化铵法提取摩擦禾或高粱或谷子外源总DNA，在玉米人工授粉并萌发出花粉管后，从花粉管到达胚囊开始到合子第一次分裂为止的时间段内，沿玉米雌穗苞叶顶部处整齐剪去花丝，并以手术刀将中间的花丝割去，使雌穗包叶与花丝形成1个穴状空间，将含有摩擦禾或高粱或谷子总DNA溶液滴加在穴状空间内，使DNA溶液与花丝的横切面充分接触。本发明用于培育新型抗旱性玉米自交系。文档编号C12N15/00GK101638649SQ20081013681公开日2010年2月3日申请日期2008年7月30日优先权日2008年7月30日发明者刘丽艳,刘昭军,铁李,王勇斌,王广金,宏邸申请人:刘昭军