专利名称：一种用有核红细胞进行唐氏综合症产前基因筛查的方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用有核红细胞(Nucleated red blood cell, NRBC)进行唐氏
综合症产前基因筛查的方法和试剂盒，属于分子细胞生物学检测领域。具体
是涉及一种用孕妇外周血中的胎儿NRBC经分离纯化来检测21号染色体倍性
的荧光定量PCR的试剂盒，可以应用于像唐氏综合症等遗传物质异常的产前筛査。
背景技术：
唐氏综合症(Down Syndrome, DS)，又称为先天愚型，是活产胎儿中最 常见的染色体异常综合征之一，其发病率约为1/600—1/800。 DS的体征非常 多样，通常涉及多种组织器官的异常，但其最突出、最严重的临床表现为精 神发育迟滞。该病的主要临床特征为严重智力低下，且智力低下的表型随 年龄增长逐渐明显，动作发育和性发育迟缓，基本无生活自理能力。DS绝 大多数都是偶发的，每个孕妇都有生患儿的可能，发病无明显的种族差异和 家族聚积现象，各种族之间发病率也几乎相同。
DS的发病机制是染色体减数不分离。正常情况下减数分裂时DNA复制 一次，细胞连续分裂两次，而DS的发病原因大部分是由于第一次减数分裂时 同源染色体不分离，造成子代细胞较正常细胞多一条染色体，第二次减数分 裂时姐妹染色体既使分裂正常，受精后也会成为21三体，导致DS。还有少 数情况是第二次减数分裂时姐妹染色体不分离所至，迄今为止，医学上对此 类疾病尚无有效的预防和治疗措施，唯一可以采取的手段就是通过产前筛查、 产前诊断尽可能早期发现，终止妊娠来防止患儿出生，国外许多国家在八十 年代已将其列为必检项目。因此，开展唐氏综合征产前筛查、产前诊断对于 提高我国人口素质具有重大意义，是优生的重要内容之一。
目前的临床上应用的检测方法是先进行血清标记物含量筛查，通过专业
软件运用统计学方法测算出该孕妇生唐氏综合症患儿的风险率，高于设定值 的孕妇建议作羊水穿刺，作染色体分析，以最终确诊。然而，上述筛查方法
的假阳性率高达99%以上，而漏检率仍超过20%，因此远远不能满足实际需 要。另外，目前确诊唐氏儿方法是传统的羊膜腔穿刺取羊水或绒毛膜细胞培 养，进行染色体分析，这种技术诊断时间长，约3周左右，且具有一定的危 险性。因此，该方法虽被认是一种较安全可靠的诊断方法，诊断精确度较高， 但诊断率低，即使是高龄孕妇也不愿采用此法，病人依从性太差，不能作为 筛查技术应用。
因此建立无创性产前诊断取材方法，降低产前诊断的风险是产前诊断工 作的一项重大课题。利用孕妇外周血胎儿细胞进行产前诊断即是最具前途的 无创性产前诊断方法之一，因对于胎儿没有任何风险，对孕妇无痛苦，易被 接受推广，近年来研究十分活跃，是遗传病产前诊断的发展方向。
孕妇外周血存在胎儿细胞己被国内外许多研究所证实。孕妇外周血中胎 儿细胞包括胎儿有核红细胞、胎儿淋巴细胞、胎儿滋养细胞及粒细胞，可见 通过胎盘屏障进入母体循环的胎儿细胞是一个混合群体。将适宜于进行产前 诊断的耙细胞从母体外周血中分离出来是实施无创伤性产前诊断的前提。目 前国内外学者的研究集中在胎儿有核红细胞上，并一致认为胎儿有核红细胞
是最佳的靶细胞。理由是NRBC具有如下特征(l)可在妊娠早期(早至妊 娠第四周)出现，寿命短(不超过90天)，便于早期诊断；(2)可表达出特殊的 抗原成分，便于富集；(3)可发生特殊的血红蛋白反应，便于鉴定；(4)携带胎 儿全部遗传信息(基因组)，便于遗传学和分子生物学分析。如何对上述细胞 尤其是母体外周血中胎儿有核红细胞加以富集、分离并进行胎儿基因诊断，
是目前产前诊断研究的一个热点。国内外学者大多利用各种胎儿细胞表面特 异抗原的单克隆抗体，经流式细胞计数仪分离纯化胎儿细胞，但这些NRBC 绝大多数为母源性，胎源性NRBC比例很低，Reading等报道在每毫升母用 1.083和1.0卯^/ml两种不同密度梯度的Percoll分离液对母体外周血单个核细 胞进行分离，经FISH和Y珠蛋白单抗标记后进行FACS证实，高密度梯度的 分离液可显著提高胎儿细胞的产量。
综上所述，目前国内外关于这方面的研究都存在胎儿细胞富集、分离的 数量少，纯度不高，操作过程复杂，并且应用于产前诊断的疾病范围非常有 限，使得该项工作没有根本的突破。因此建立一套稳定可靠、操作简便、富 集力强、分离纯度高的富集和分离胎儿有核红细胞的新方法，才能更好地应 用于产前多种遗传性疾病的诊断。
采用不同密度梯度的Percoll分离液对母体外周血单个核细胞进行分离， 再联合应用抗CD71抗体磁珠正筛选，可以从母血中有效分离有核红细胞， 解决胎儿有核红细胞难以分离纯化的问题，为无创取材铺平道路。
实时荧光定量PCR技术是近年来发展起来的能够对极微量特异DNA(基 因)拷贝数'进行精确定量的最先进的基因剂量定量新技术。由于唐氏综合征 的每个体细胞中21号染色体为3条，而其它常染色体为2条，因此21号染 色体上的单拷贝基因剂量是其它常染色体上的单拷贝基因剂量的1.5倍，因此
可以选择21号染色体上的单拷贝基因如DSCR1和常染色体上的单拷贝基因 如GAPDH基因，通过荧光定量技术来检测出它们的相对拷贝数的比值来判 断21号染色体的倍性，从而从微量DNA标本中检测出DS。
将分离出的胎儿有核红细胞进行纯化，提取DNA后，再釆用实时荧光定 量PCR技术精确检测其21号染色体基因剂量，从而诊断DS，必将使该遗传 病的产前歸査和诊断更加快速准确和易于推广。
发明内容
本发明目的在于提供一种操作简便，能够快速分离纯化孕妇外周血存在 胎儿NRBCs，进而用双色荧光定量共扩增聚合酶链反应技术进行唐氏综合症 产前基因筛査的方法。
本发明的另一 目的是提供其相应的试剂盒。
本发明解决问题的技术方案是
一种用有核红细胞进行唐氏综合症产前基因筛查的方法，其特征是，它 包括以下步骤(a)胎儿NRBC的分离纯化和DNA提取；(b)用21号染色体 特异序列DSCR区段序列和16号染色体上的GAPDH基因序列分别合成其引 物和双色Taqman荧光探针；(c)在扩增缓冲反应体系中，双色荧光定量PCR
反应，实现两对引物的共扩增，测得荧光定量PCR的曲线。
所述的用有核红细胞进行唐氏综合症产前基因筛査的方法，其中步骤(a) 为取适量孕期在10—18周的孕妇外周静脉血，EDTA抗凝，采用不连续密 度梯度离心方法离心，分离提取1.070 g/ml至1.090 g/ml密度区间的外周血 有核细胞组分，再用抗CD71抗体磁珠正筛选，磷酸缓冲盐溶液(PBS)充分 洗涤，获得胎儿NRBC;去净PBS后，加入适量超纯水，98。C下裂解细胞5 min， 释放DNA，'置一2(TC冰箱保存备用。
所述的步骤(a)，其中的孕期在10—14周的孕妇外周静脉血取量为2ml， 孕期在14一18周的孕妇外周静脉血取量为5ml。
所述的用有核红细胞进行唐氏综合症产前基因筛查的方法，其中步骤(c) 为反应体系在多色荧光定量热循环仪上进行94。C预变性2min ; 94"€变性 10sec， 52—58-C复性30sec, 6(TC延伸40sec，共45个循环，并在60。C延伸 时检测荧光强度，使两对引物分别同时引导新链合成，实现两对引物的共扩 增；同时通过检测扩增过程中由于降解T叫man探针获得的荧光信号的强弱， 获得各自的扩增曲线图，进而得出各个基因的Ct值。
步骤(c)得到的样品的Ct值与标准曲线结合，利用以下公式 Nx =No*YCto_ctx 其中Nx为样本x的耙基因的起始拷贝数；
Y为扩增效率，相当于Ct值减少1个循环对应的模板DNA的增加的 倍数，由公式Y=101/AQ (ACt =靶DNA每稀释10倍，平均增加的Ct 值数)计算获得； Ctx为扩增管x的靶基因的Ct值； Cto为标准曲线上靶基因拷贝数为No时的Ct值； No'为起始拷贝数。 分别计算DSCR区段序列和16号染色体上的GAPDH基因序列含量；根 据以下公式计算二者的比值R: R=Nd/Ng，其中Nd为DSCR拷贝数，Ng 为GAPDH拷贝数；最后根据二者的比值R判断21号染色体的倍性。
一种用有核红细胞进行唐氏综合症产前基因筛查的试剂盒，它包括有核
红细胞分离纯化的试剂，根据21号染色体特异序列DSCR区段序列和16号 染色体上的GAPDH基因序列合成的引物和双色Taqman荧光探针，还包括用 于进行PCR反应的扩增缓冲反应试剂。
所述的试剂盒中用21号染色体特异序列DSCR区段序列和16号染色体 上的GAPDH基因序列合成的引物和双色Taqman荧光探针，其序列分别如下
DSCR上游引物序列表中SEQIDNo.l;
DSCR下游引物序列表中SEQIDNo.2;
DSCRTaqMan探针序列表中SEQ IDNo.3 ;
GAPDH上游引物序列表中SEQIDNo.4;
GAPDH下游引物序列表中SEQIDNo.5;
GAPDHTaqMan探针序列表中SEQIDNo.6;
所述的试剂盒中进行PCR反应的扩增缓冲反应试剂包括耐热DNA聚合 酶、dNTPs、模板DNA、镁离子、PCR缓冲液、超纯水。
所述的试剂盒中成分的浓度含量为DSCR的引物10pmol/50ul、 GAPDH 的引物10pmol/50ul、双色荧光Taqman探针0.1-0.5umol/L、 TaqDNA聚合酶 l-3U/50ul、 dNTPs底物0.1-0.5 mmol、模板DNA若干、镁离子1.5-3.5 mmol/L、 缓冲液0.5-1.5 XPCR;其中IXPCR缓冲液包括50 mmol/L KCl、 10 mmol/L Tris,HClPH8.3、 0.01%明胶。
本发明提供的用有核红细胞进行唐氏综合症产前基因筛查的方法和试剂 盒与其它产前筛查检测DS的技术方法相比具有以下优点
1、 操ft简便快速，结果准确度高，可以在5-6小时内获得较准确的筛查 结果；
2、 闭管检测，不会造成扩增产物污染；
3、 自动化程度高，人工成本低，还可以高通量检测，每次检测可以检测 90个以上标本；
4、 需要的检测样本材料微量，每个反应仅需要待检外周血2—5ml，便于 取材。
具体实施例方式
实施例l
(1) 胎儿NRBC的分离纯化和DNA提取
取2ml孕期在10—14周的孕妇外周静脉血，EDTA抗凝，轻轻加入到含 2ml Percoll细胞分离液(Pharmaci公司)的10ml离心管中的Percoll上方，300g 离心30 min，收集提取1.075 g/ml至1.085 g/ml Percoll密度区间的外周血有核 细胞组分，与100ul (约含有10E6抗体磁珠)含抗CD71抗体磁珠的PBS混 合均匀，4。C旋转孵育lhr，置磁分离器上静置5 min，弃液体，加入磷酸缓冲 盐溶液(PBS) lml充分洗漆2min，置磁分离器上静置5 min，弃液体，再用 500ul PBS充分洗涤2min，置磁分离器上静置5 min，弃尽液体，获得胎儿 NRBC。
上述胎儿NRBC加入30ul超纯水，98'C裂解细胞5min，释放DNA，置 一2(TC冰箱保存备用。
(2) 荧光定量PCR检测 (i)引物和操针的设计
根据genebank中DSCRl[gi:7768679]的序列设计DSCR的引物如下 上游引物DSCRF:5 ，-CAGAAATCCCAGTTCATGTTGCT画3, 下游引物DSCRR:5 ，-CATTCCCGGGTGCCATGAACAGT-3 ， TaqMan探针DSCRTM:5，-[FAM]CAAGGCCGTGTCCCCTTGTTC[TAMRA]-3， 扩增产物96bp，在基因中的位置见下
cacgcgacga ggacgcattc caaatcatac tcacgggagg aatcttttac34812197 tgtggaggtg gctggtcacg acttcttcgg aggtggcagc cgagatcggg34812147
gtggc|agaaa tcccagttca tgttgct[cag aagagaaljca a故cc;劲^ | 34812097
eccttgUc|t aatgctgcac accagttjact gttcatggca cccgggaatgl 34812047
根据genebank中[gi: 32891804]设计内对照GAPDH [ glyceraldehyde
3-phosphate dehydrogenase,三磷酸甘油醛脱氢酶]的引物如下
上游弓I物GAPDF:5，-ctccctctttctttgcagcaat-3，，
下游引物GAPDR:5 ，-cagctctcataccatgagtcct-3 ，，
TaqMan探针GAPDTM:5，-[HEX] ctgcaccaccaactgcttagc ， 扩增产物U2bp，在基因中的位置如下-gggtgtgaac catgagaagt atgacaacag cctcaagatc atcaggtgag 6516648 gaaggcaggg cccgtggaga agcggccagc ctggcaccct atggacacgc 6516698 tcccctgact tgcgccccgc tccctctttc tttgcagcaa tgcctc|^^| 6516748 accaccaa站gcli&g|jacc cctggccaag gtcatccatg acaactttgg 6516798 tatcgtgga|a ggactcatgg tatgagagct dgggaatggg actgaggctc 6516848 (ii )双色荧光定量PCR反应
混合50ul反应体系，内含两引物各lOpmol，各探针lOpmol， DNA10ul， 1 X PCR缓冲液，Taq DNA聚合酶2u， Mg2+终浓度2 mmol/L，然后在FTC2000 实时荧光定量PCR仪上96。C下变性2min，随后按94。C变性10 see, 52。C复 性30sec， 6(TC延伸40sec，共45个循环，并在6(TC延伸时照相。每一个标 本重复三次实验。
(iii) 双色荧光定量PCR检测
将DNA模板10倍、100倍、1000倍、10000倍等比稀释做DSCR1和GAPDH 基因的标准'曲线，以比较和得出两个基因的扩增效率。
(iv) 结果分析
实验表明唐氏综合征患儿的GAPDH与DSCR1的差值为0.62±0.28，而 正常人的GAPDH与DSCR1的差值为0.08±0.29，用2—^GT方法计算换成拷 贝数的比值约为1/1.86 1.27与1/1.29 0.86，两者间的差异有统计学差异
实施例2
(1)胎儿NRBC的分离纯化和DNA提取
取5ml.孕期在14一18周的孕妇外周静脉血，EDTA抗凝，轻轻加入到含 5ml Percoll细胞分离液(Pharmaci公司)的10ml离心管中的Percoll上方，300g 离心30 min，收集提取1.075 g/ml至1.085 g/ml Percoll密度区间的外周血有核 细胞组分，与100ul (约含有10E6抗体磁珠)含抗CD71抗体磁珠的PBS混 合均匀，4'C旋转孵育lhr，置磁分离器上静置5 min，弃液体，加入磷酸缓冲 盐溶液(PBS)'lml充分洗涤2min，置磁分离器上静置5 min，弃液体，再用
500ul PBS充分洗涤2min，置磁分离器上静置5 min，弃尽液体，获得胎儿 NRBC。
上述胎儿NRBC加入30ul超纯水，98。C裂解细胞5min，释放DNA，置一20 'C冰箱保存备用。
(2)荧光定量PCR检测
(i)引物和探针的设计
根据genebank中DSCRl[gi:7768679]的序列设计DSCR的引物如下 上游引物DSCRF:5，-CAGAAATCCCAGTTCATGTTGCT-3， 下游引物DSCRR:5，-CATTCCCGGGTGCCATGAACAGT誦3， TaqMan探针DSCRTM:5,-[FAM]CAAGGCCGTGTCCCCTTGTTC[TAMRA]-3， 扩增产物96bp，在基因中的位置见下
cacgcgacga ggacgcattc caaatcatac tcacgggagg aatcttttac34812197 tgtggaggtg gctggtcacg acttcttcgg aggtggcagc cgagatcggg34812147
34812097 34812047
gtgg(jag幼a tcccagttca tgttgct[cag aagagaat[ca aggccgit^
cccttgttc[t aatgctgcac accagttjact gttcatggca cccgggaatg
根据genebank中[gi: 32891804]设计内对照GAPDH [ glyceraldehyde
3-phosphate dehydrogenase,三磷酸甘油醛脱氢酶]的引物如下
上游引物GAPDF:5 ，-ctccctctttctttgcagcaat-3 ，，
下游引物GAPDR:5，-cagctctcataccatgagtcct-3，，
TaqMan探针GAPDTM:5，-[HEX] ctgcaccaccaactgcttagc [TAMRA〗-3，，
扩增产物112bp,在基因中的位置如下
gggtgtgaac catgagaagt atgacaacag cctcaagatc atcaggtgag 6516648 gaaggcaggg cccgtggaga agcggccagc ctggcaccct atggacacgc 6516698 tcccctgact tgcgccccg c tccctctttc tttgcagcaa t gcctc^^ 6516748 accLaccaact.gettagc|acc cctggccaag gtcatccatg acaactttgg 6516798 tatcgtgga[a ggactcatgg tatgagagct gfeggaatggg actgaggctc 6516848 (ii)双色荧光定量PCR反应 混合50ul反应体系，内含两引物各10pmo1，各探针10pmo1， DNA10ul，
1 X PCR缓冲液，Taq DNA聚合酶2 u， Mg2+终浓度2 mmol/L,然后在 FTC2000实时荧光定量PCR仪上96℃。下变性2 min,随后按94℃变性10 see, 52℃复性30sec， 6℃延伸40sec，共45个循环，并在60℃延伸时照相。每 一个标本重复三次实验。
(iii) 双色荧光定量PCR检测
将DNA模板10倍、100倍、1000倍、10000倍等比稀释做DSCR1和GAPDH 基因的标准曲线，以比较和得出两个基因的扩增效率。
(iv) 结果分析
实验表明唐氏综合征患儿的GAPDH与DSCR1的差值为0.65±0.18,而正常 人的GAPDH与DSCR1的差值为0.15±0.21，用2^"7方法计算换成拷贝数 的比值约为1/1.77 1.39与1/1.28 0.96，两者间的差异有统计学意义。
序列表
<110〉 山东亚大药业有限公司
<120>—种用有核红细胞进行唐氏综合症产前基因筛査的方法和试剂盒
<160> 6
<210> 1 <211>23 <212>DNA <213>人工序列
<220〉 <223〉
<400〉 1
cagaaatccc agttcatgtt get 23
<210>2 <211〉23 <212〉DNA <213>人工序列
<220> <223〉
<400> 2
cattcccggg tgccatgaac agt 23
<210>3 <211>21 <212>DNA <213>人工序列
<220> <223>
<400> 3
caaggccgtg tccccttgtt c 21
<210>4 <211>22 . <212>DNA <213>人工序列
<220> <223>
<400〉 4
ctccctcttt ctttgcagca at 22
<210>5 <211>22 <212>DNA <213>人工序列
<220> <223>
<400> 5
cagctctcat accatgagtc ct 22
<210>6 <211>21 <212>DNA <213>人工序列
<220> <223>
<400>6
ctgcaccacc aactgcttag c 2权利要求
1、一种用有核红细胞进行唐氏综合症产前基因筛查的方法，其特征是，它包括下列步骤(a)胎儿核红细胞NRBC的分离纯化和DNA提取；(b)用21号染色体特异序列DSCR区段序列和16号染色体上的GAPDH基因序列分别合成引物和双色Taqman荧光探针；(c)在扩增缓冲反应体系中，双色荧光定量PCR反应，实现两对引物的共扩增，测得荧光定量PCR的曲线。
2、 按照权利要求1所述的方法，其特征是，其中的步骤(a)为取适 量孕期在10—18周的孕妇外周静脉血，EDTA抗凝，采用不连续密度梯度 离心方法离心，分离提取1.070 g/ml至1.090 g/ml密度区间的外周血有核细 胞组分，再用抗CD71抗体磁珠正筛选，磷酸缓冲盐溶液(PBS)充分洗涤， 获得胎儿NRBC;去净PBS后，加入适量超纯水，98。C下裂解细胞5min, 释放DNA，置一2(TC冰箱保存备用。
3、 按照权利要求2所述的方法，其特征是，所述的步骤(a)，其中的 孕期在10—14周的孕妇外周静脉血取量为2ml，孕期在14一18周的孕妇外 周静脉血取量为5ml。
4、 按照权利要求1所述的方法，其特征是，其中的步骤(c)为反应 体系在多色荧光定量热循环仪上进行94'C预变性2min ; 94'C变性10sec， 52—58""C复性30 sec， 60。C延伸40 sec，共45个循环，并在6(TC延伸时检 测荧光强度，使两对引物分别同时引导新链合成，实现两对引物的共扩增。
5、 一种用有核红细胞进行唐氏综合症产前基因筛査的试剂盒，其特征 是，它包括有核红细胞分离纯化的试剂，根据21号染色体特异序列DSCR 区段序列和16号染色体上的GAPDH基因序列合成的引物和双色Taqman荧 光探针，还包括用于进行PCR反应的扩增缓冲反应试剂。
6、 按照权利要求5所述的试剂盒，其特征是，其中用21号染色体特异序 列DSCR区段序列和16号染色体上的GAPDH基因序列合成的引物和双色 Taqman荧光探针，其序列分别为DSCR上游弓I物:5 ，-CAG AAA TCC CAG TTC ATG TTG CT-3 ，； DSCR下游引物:5，國CATTCC CGG GTG CCATGAACAGT誦3，； DSCRTaqMan探针5，-[FAM]CAAGGCCGTGTCCCCTTGTTC[TAMRA]-3，；GAPDH上游引物:5，國ctc cct ctt tct ttg cag caa t画3，；GAPDH下游弓I物:5，-cag etc tea tac cat gag tec t画3 ，；GAPDHTaqMan探针:5，-[HEX] ctg cac cac caa ctg ctt age [TAMRA] -3,。
7、 按照权利要求5所述的试剂盒，其特征是，其中进行PCR反应的扩 增缓冲反应试剂包括耐热DNA聚合酶、dNTPs、模板DNA、镁离子、PCR 缓冲液和超纯水。
8、 按照权利要求5所述的试剂盒，其特征是，其中成分的浓度含量为 DSCR的引物10 pmol/50ul、 GAPDH的引物10 pmol/50ul、双色荧光Taqman 探针0.1-0.5umol/L、 Taq DNA聚合酶l-3U/50ul、 dNTPs底物0.1-0.5 mmol、 模板DNA若干、镁离子1.5-3.5 mmol/L、缓冲液0.5-1.5 XPCR。
9、 按照权利要求8所述的试剂盒，其特征是，其中1XPCR缓冲液包 括50mmol/LKCl、 10 mmol/LTris.HCl PH8.3、 0.01%明胶。
全文摘要
本发明涉及一种用有核红细胞进行唐氏综合症产前基因筛查的方法和试剂盒。它是用包括有核红细胞分离纯化的试剂、用21号染色体特异序列DSCR区段序列和16号染色体上的GAPDH基因序列合成的引物和双色Taqman荧光探针、还有PCR反应的扩增缓冲反应试剂的试剂盒，通过下列步骤实现(a)胎儿NRBC的分离纯化和DNA提取；(b)用21号染色体特异序列DSCR区段序列和16号染色体上的GAPDH基因序列分别合成其引物和双色Taqman荧光探针；(c)在扩增缓冲反应体系中，双色荧光定量PCR反应，实现两对引物的共扩增，测得荧光定量PCR的曲线。本发明操作简便，检测通量高，属无创性产前诊断方法。
文档编号C12Q1/68GK101358241SQ20081013945
公开日2009年2月4日 申请日期2008年9月16日 优先权日2008年9月16日
发明者夏庆杰, 林 杨 申请人:山东亚大药业有限公司