专利名称：一种分离严格厌氧产甲烷古菌的方法
技术领域：
本发明涉及到微生物菌种选育、废水治理和生物能源领域。本发明通过 控制严格厌氧产甲烷古菌厌氧生长的环境，提供一种分离严格厌氧产甲垸古 菌的方法。
背景技术：
厌氧甲烷古菌是一类在地球生命起源中出现极早的特殊微生物，这与当 时的原始地球大气环境及其地球环境的生物转化有着紧密联系。由于受环境 条件的限制，使得这一物种仅分布于河底淤泥，海洋底部等极端严格厌氧的 狭窄环境或生命出现初期的自然环境中，在常规条件下分离培养及其困难， 为其生理生化性质的研究和工艺开发与利用造成了很大的难度，使得目前关 于甲烷古菌的有关知识非常贫乏。也因为生长环境的狭窄及单调性，与其相 应的物种多样性也受到极大限制。 与生长条件简单，分布广泛的真细菌及其 他物种相比，其种属非常少，种质资源稀缺而宝贵。
厌氧甲垸古菌的最大生理特征是代谢简单有机物而产甲烷，这一特征因 而赋予了该类微生物在环境有机污染物的生物处理，生物质能源的转化利用 方面被广泛利用而受到关注。然而他们通常是与其他厌氧微生物处于一个有 机的微生物生态群落中以共栖互利方式才得以发挥作用，加上分离纯培养极 为困难，因而对他们的利用和认识都是从复杂微生物群落体系的整体上进行 的。这种认识由于其他相关微生物的广泛存在难免受到干扰，使得其认识无 法深入甚至不够准确。
发明内容
为了充分利用厌氧甲烷古菌在环境和生物能源领域的潜能，本发明提供 一种分离严格厌氧甲烷古菌的方法。
一种分离严格厌氧产甲烷古菌的方法，在平皿上铺设上、下两层固体培 养基，其中下层为选择性固体培养基，主要提供被分离微生物生长的营养基 质，上层为隔氧固体培养基，主要起隔绝氧的作用。
隔氧固体培养基主要由水和2-3% (W/V)琼脂粉构成的无营养基质。下层选择性固体培养基组成含量为NHXl: 0.7-L2g/1， MgCl2: 0.08-0. 14g/l， NaCl: 17-22g/l， CaCl2: 0.2-0.4g/l， K2HP04: 0.3_0.5g/l， K跳:0.3-0.5g/l，酵母膏0.8-1.2g/l ，蛋白胨0.8-1.2g/l，碳源h 甲酸钠1. 7-2. 4 g/1,碳源2:乙酸钠1. 7-2. 4g/l，碳源3:甲醇1. 7-2. 4g/l， 蒸馏水lOOOmL，琼脂2-3% (W/V)， pH: 7.0-7.2 (用盐酸调节)；按1L 选择性培养基时加入微量元素母液1ml 。
微量元素母液组成为
所述微量元素母液组成为FeCl3'4H20: 2000 mg/1; CoCl2'6H20: 2000 mg/1 ， MnCl2.4H20: 500 mg/1 ， CuCl2. 2H20: 30 mg/1 , ZnCl2: 50 mg/1 ， H3B03 : 50 mg/1 ， Na2Se03-5H20: 100mg/l， NiCl2'6H20: 50 mg/1 ， EDTA: 1000mg/l， 36%HC1: 1 ml。
本发明利用甲垸菌对能量谱很窄，通过在下层培养基中分别加入甲酸钠， 乙酸钠，甲醇几种有限碳源， 一方面可以通过这种由于碳源利用的不同带来 的选择压力而尽量抑制其他厌氧菌的生长，另一方面，单独加入这几种碳源 中某一种可定向分离到不同的产甲烷菌属。
对上下层培养基分别配制和灭菌后，先向平皿中倒入下层选择性培养基， 冷却凝固后，将带分离样品涂布其上，再加入较低温度的上层隔氧培养基， 冷却凝固，将其置于玻璃干燥器中，充氮气后置于恒温箱培养。
具体操作过程如下
1. 视被分离样品中微生物浓度大小，将其微生物浓度调节至O. 5X107-1. 5 X10Vml，用于涂布平皿。
2. 将上层选择性培养基和下层隔氧培养基分别按以上提供的配方配制 后，115r高温蒸汽灭菌20min。
3. 将下层选择性培养基在无菌操作台快速倒入平皿中，其厚度大概在 0.4-0. 7cm左右，冷却凝固后，将预先调整好微生物浓度的样品取lOOul均匀 涂布在该培养基上。
4. 将上层隔氧培养基冷却到4(TC左右，快速倒入涂有样品的上述平皿中， 其厚度大概在0. 6-0. 7cm左右。冷却凝固后倒置于玻璃干燥器中。
5. 将玻璃干燥器盖边缘均匀涂上凡士林(用于密封干燥器)，盖上盖子， 然后将氮气管通过盖子顶部的开口插入干燥器底部，充气10min。密闭开口，将这个装置置于37。C恒温箱培养3-5天后即可观察到甲烷菌单菌落，可用接 种针小心挖取菌落块进行扩大培养及后续研究。
本发明利用双层平皿培养基和外加氮气的双重隔氧保护机制，在上述基 础上，再利用甲烷菌属之间及与其他厌氧微生物在碳源利用上的差异性，限 制性的加入有限的碳源，从而达到定向筛选分离不同产甲垸菌的目的。本方 法无需复杂昂贵的厌氧设备，操作简单可靠，可快速定向分离到甲烷菌，同 时也为其他特殊厌氧菌种选育提供了新的思路。
图1:双层培养基制备示意图；其中l-平皿盖；2-上层隔氧培养基；3-菌液涂布层；4-下层选择培养基；
图2:玻璃干燥器充气示意图；其中5-氮气充气口； 6-活动橡胶塞； 7-平皿隔板。
具体实施例方式
实施例1
1. 将上层隔氧培养基(1000 mL水和20 g琼脂粉)和下层选择性培养基 (组分如下NHUCl: 1.2g/l, MgCl2: 0.14g/l， NaCl: 22g/l， CaCl2 : 0.3g/l，
K2HP04: 0.5g/l， KH2P04: 0.5g/l，酵母膏1.2g/l ，蛋白胨1.2g/l，碳源1: 甲酸钠2.4 g/l，碳源2:乙酸钠2.4g/l，碳源3:甲醇2.4g/l，蒸馏水lOOOmL, 琼脂2% (W/V)，)分别配制后，加入微量元素母液lml/L; 115t:高温蒸汽 灭菌20min。
2. 将下层选择性培养基在无菌操作台快速倒入平皿中，其厚度大概在 0.4-0. 7cm左右，冷却凝固。
3. 将分离样品中其微生物浓度调节至0. 6X 107ml，取100ul均匀涂布在 下层培养基上。
4. 将上层隔氧培养基冷却到40'C左右，快速倒入涂有样品的上述平皿中， 其厚度大概在0. 6-0. 7cm左右。冷却凝固后倒置于玻璃干燥器中。
5. 将玻璃干燥器盖边缘均匀涂上凡士林(用于密封干燥器)，盖上盖子， 然后将氮气管通过盖子顶部的开口插入干燥器底部，充气10min。密闭开口， 将这个装置置于37。C恒温箱培养5天后即可观察到甲烷菌单菌落，可用接种 针小心挖取菌落块进行扩大培养及后续研究。实施例2
1. 将上层隔氧培养基(1000 mL水和20g琼脂粉)和下层选择性培养基 (组分如下NHjCl: 0,7g/l, MgCl2: 0.09g/l， NaCl: 19g/l， CaCl2 : 0.3g/l，
K2HP04: 0.3g/l， KH2P04: 0.3g/l，酵母膏0.8g/l ，蛋白胨0.8g/l，碳源1: 甲酸钠1.8 g/l，碳源2:乙酸钠1.7g/l，碳源3:甲醇1.7g/l,蒸馏水lOOOmL， 琼脂2% (W/V)，)分别配制后，加入微量元素母液lml/L; 115。C高温蒸汽 灭菌20min。
2. 将下层选择性培养基在无菌操作台快速倒入平皿中，其厚度大概在 0.4-0. 7cm左右，冷却凝固。
3. 将分离样品中其微生物浓度调节至1. 5X 10Vml，取100ul均匀涂布在 下层培养基上。
4. 将上层隔氧培养基冷却到4(TC左右，快速倒入涂有样品的上述平皿中， 其厚度大概在0. 6-0. 7cm左右。冷却凝固后倒置于玻璃干燥器中。
5. 将玻璃干燥器盖边缘均匀涂上凡士林(用于密封干燥器)，盖上盖子， 然后将氮气管通过盖子顶部的开口插入干燥器底部，充气10min。密闭开口， 将这个装置置于37-C恒温箱培养5天后即可观察到甲烷菌单菌落，可用接种 针小心挖取菌落块进行扩大培养及后续研究。
权利要求
1. 一种分离严格厌氧产甲烷古菌的方法，其特征在于1)将被分离样品中微生物浓度调节至0.5×107-1.5×107/ml；2)将上层选择性培养基和下层隔氧培养基于115℃蒸汽灭菌20min；3)将下层选择性培养基在无菌操作台倒入平皿中，其厚度为0.4-0.7cm，冷却凝固后，将预先调整好微生物浓度的样品取100ul均匀涂布在该培养基上；4)将上层隔氧培养基冷却到40℃左右，倒入涂有样品的上述平皿中，其厚度为0.6-0.7cm，冷却凝固后倒置于干燥器中；5)将干燥器密封后通入氮气，充气10min后于37℃恒温箱培养3-5天，可观察到甲烷菌单菌落；所述隔氧培养基是由水和重量体积为2-3％的琼脂粉构成的无营养基质；所述选择性培养基组成成份及含量为NH4Cl0.7-1.2g/l，MgCl20.08-0.14g/l，NaCl17-22g/l，CaCl20.2-0.4g/l，K2HP040.3-0.5g/l，KH2P040.3-0.5g/l，酵母膏0.8-1.2g/l，蛋白胨0.8-1.2g/l，碳源1甲酸钠1.7-2.4g/l，碳源2乙酸钠1.7-2.4g/l，碳源3甲醇1.7-2.4g/l，蒸馏水1000mL，琼脂重量体积百分数为2-3％，pH7.0—7.2，按1L选择性培养基加入微量元素母液1ml；所述微量元素母液组成为FeCl3·4H2O2000mg/l；CoCl2·6H2O2000mg/l，MnCl2·4H2O500mg/l，CuCl2.2H2O30mg/l，ZnCl250mg/l，H3BO350mg/l，Na2SeO3·5H2O100mg/l，NiCl2·6H2O50mg/l，EDTA1000mg/l，36％HCl1ml。
全文摘要
一种分离严格厌氧产甲烷古菌的方法。本发明利用双层平皿培养基和外加氮气的双重隔氧保护，通过甲烷菌属之间及与其他厌氧微生物在碳源利用上的特异性，限制性的加入有限的碳源，从而达到定向筛选分离不同甲烷菌的目的。本方法无需复杂昂贵的厌氧设备，操作简单可靠，使常规难以分离的特殊环境下的甲烷菌在实验室可快速定向分离得到，为深化甲烷菌的认识及开发其工艺应用潜能奠定了基础。
文档编号C12R1/01GK101434924SQ200810143979
公开日2009年5月20日 申请日期2008年12月17日 优先权日2008年12月17日
发明者夏乐先, 礎 尹, 张维新, 戴松林, 柳建设, 邱冠周 申请人:中南大学