专利名称：一种低分子硫酸软骨素制备方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物技术领域的方法，具体地说，是一种低分子硫酸软骨素制备方法。
背景技术：
硫酸软骨素是从动物软骨中提取的酸性粘多糖物质，可提高脂肪酶活性加速乳糜微粒中高甘油三脂分 解成脂肪酸而澄清血液，还具有抗血栓形成，保护软骨降解，预防老年性关节退行性疾病，维持关节健康， 抗风湿等作用。低分子量硫酸软骨素具有比天然分子量硫酸软骨素更好的口服吸收率，在美国不仅做为药 品用于治病，更多地做为高档营养补充剂进行疾病预防，消费群体从病人普及到一般人，口服剂量从0.8 克增加到1. 2克，需求量非常大。经文本品
低分子量硫酸软骨素生产常用的酸水解工艺，该方法的特异性差，脱硫酸基团率高，生产成品率低， 不适合大规模生产用。
经对现有技术文献的检索发现，中国专利《低分子量硫酸软骨素的制备方法》(03114375. X)。该论 文通过利用动物软骨和/或市售普通大分子硫酸软骨素为生产原料，经过常规生产工艺、酸水解处理后， 应用超滤膜进行分子量截留、浓縮等特殊工艺，可以得到分子量低于10， 000道尔顿的硫酸软骨素。虽然 该工艺采用超滤膜进行分子量截留，但通过膜的低分子量硫酸软骨素仍然处于酸性反应环境被继续降解， 未解决生产效率问题。因此，有必要开发高效率、低成本生产低分子量硫酸软骨素的方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种低分子量硫酸软骨素制备方法，使其成本低，效率 高，大批量高效制备低分子量硫酸软骨素。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明以酸性粘多糖酶裂解高分子量硫酸软骨素，同时将生成的 低分子量硫酸软骨素及时移除防止其进一步裂解，从而得到高产率的低分子量硫酸软骨素。
本发明包括以下步骤-
(1) 将酸性粘多糖酶加入的50mMTris/HCl含50mM醋酸钠，pH 8. 0，含硫酸软骨素底物浓度l mg/ml。 原料硫酸软骨素的分子量为10000 - 60000 Da;
所述的步骤(1)中酸性粘多糖酶指透明质酸酶，硫酸软骨素酶，肝素酶裂解原料硫酸软骨素； 所述的原料硫酸软骨素指从各种动物软骨制备的硫酸软骨素，原料纯度可从36-95%。
(2) 酶解生成的低分子量硫酸软骨素用截留分子量为5000Da的超滤膜及时移除，从而得到低分子量
硫酸软骨素产品。
述的步骤(2)中，反应条件为pH7. 5 — 9.0，醋酸钠浓度为0.05—0.2M的缓冲液，温度25-45'C。 本发明既克服了硫酸软骨素酸水解工艺制备产品的分子量分布宽，产品得率低的缺点，可高效、大 批量制备低分子量硫酸软骨素，得率80%以上。
具体实施方式
实施例1
取IO g平均分子量为30000 Da的硫酸软骨素粗品，溶解于IOOO ml 50 mM Tris/HCl和50 mM醋酸 钠缓冲液，PH 8. 0，加入链霉菌属透明质酸酶0. 1 g,在3(TC条件下保温20 min，然后在截留分子量为 3000Da的超滤系统中循环2 h,收集滤过液分析硫酸软骨素平均分子量3600Da,分子量分布3000-5000Da之
间的产品产率8 g。 实施例2
取IO g平均分子量为30000 Da的硫酸软骨素粗品，溶解于IOOO ml 50 mM Tris/HCl和50 mM醋酸 钠缓冲液，PH 7.5,加入普通变形杆菌硫酸软骨素酶ABC 0.2 g，在30。C条件下保温20 min，然后在截留 分子量为3000Da的超滤系统中循环2 h，收集滤过液分析硫酸软骨素平均分子量4200Da,分子量分布 3000-5000Da之间的产品产率7 g。
实施例3
取IO g平均分子量为30000 Da的硫酸软骨素粗品，溶解于IOOO ml 50 mM Tris/HCl和50 mM醋酸 钠缓冲液，PH 8. 5，加入肝素黄杆菌肝素酶0. 1 g，在3(TC条件下保温20 min，然后在截留分子量为3000Da的超滤系统中循环2 h，收集滤过液分析硫酸软骨素平均分子量3800Da，分子量分布3000-5000Da之间的产品产率6 g。实施例4
取IO g平均分子量为25000 Da的硫酸软骨素粗品，溶解于IOOO ml 50 mM Tris/HCl和50 mM醋酸钠缓冲液，PH8.5，加入羊睾丸透明质酸酶0.3g,在3(TC条件下保温20 min,然后在截留分子量为3000Da的超滤系统中循环2 h，收集滤过液分析硫酸软骨素平均分子量4500Da,分子量分布3000-5000Da之间的产品产率6. 5 g。
实施例5
取IO g平均分子量为30000 Da的硫酸软骨素粗品，溶解于IOOO ml 50 mM Tris/HCl和50 mM醋酸钠缓冲液，PH 8. 0，加入牛睾丸透明质酸酶0. 1 g，在25'C条件下保温20 min，然后在截留分子量为3000Da的超滤系统中循环2 h,收集滤过液分析硫酸软骨素平均分子量4500Da，分子量分布3000-5000Da之间的产品产率8. 5 g。
实施例6
取IO g平均分子量为30000 Da的硫酸软骨素粗品，溶解于IOOO ml 50 mM Tris/HCl和50 mM醋酸钠缓冲液，PH8.0，加入鞘胺醇杆菌肝素酶0.2g，在35'C条件下保温20min,然后在截留分子量为3000Da的超滤系统中循环2 h，收集滤过液分析硫酸软骨素平均分子量3500Da，分子量分布3000-5000Da之间的产品产率6. 3 g。
实施例7
取IO g平均分子量为30000 Da的硫酸软骨素粗品，溶解于IOOO ml 50 mM Tris/HCl和50 mM醋酸钠缓冲液，pH 8.0，加入肝素黄杆菌硫酸软骨素酶C 0.25 g，在45'C条件下保温20 min,然后在截留分子量为3000Da的超滤系统中循环2 h，收集滤过液分析硫酸软骨素平均分子量4200Da，分子量分布3000-5000Da之间的产品产率5. 0 g。
实施例8
取IO g平均分子量为30000 Da的硫酸软骨素粗品，溶解于IOOO ml 50 mM Tris/HCl和50 mM醋酸钠缓冲液，PH 8. 0，加入肝素黄杆菌硫酸软骨素酶AC 0. 5 g，在4(TC条件下保温20 min，然后在截留分子量为3000Da的超滤系统中循环2 h，收集滤过液分析硫酸软骨素平均分子量站OODa，分子量分布3000-5000Da之间的产品产率5. 5 g。
实施例9
取IO g平均分子量为30000 Da的硫酸软骨素粗品，溶解于IOOO ml 50 mM Tris/HCl缓冲液，pH 8. 0，加入肝素黄杆菌硫酸软骨素酶B 0. 3 g，在3(TC条件下保温20 min，然后在截留分子量为3000Da的超滤系统中循环2 h，收集滤过液分析硫酸软骨素平均分子量3600Da，分子量分布3000-5000Da之间的产品产率6. 6g
实施例10
取IO g平均分子量为30000 Da的硫酸软骨素粗品，溶解于IOOO ml 50 mM Tris/HCl 100 mM醋酸钠缓冲液，pH 8.0,加入金黄节杆菌硫酸软骨素酶AC 0.1 g，在3(TC条件下保温20 min,然后在截留分子量为3000Da的超滤系统中循环2 h，收集滤过液分析硫酸软骨素平均分子量4100Da,分子量分布3000-5000Da之间的产品产率7.6 g。
权利要求
1.一种低分子量硫酸软骨素生产方法，包括(1)用酸性粘多糖水解酶裂解高分子量硫酸软骨素，(2)用截留分子量为3000Da的超滤膜将生成的低分子量硫酸软骨素及时滤除得到低分子量硫酸软骨素。
2. 根据权利要求l所述的低分子量硫酸软骨素生产方法，其特征是，所用酸性粘多糖水解酶为肝素黄 杆菌肝素酶。
3. 根据权利要求l所述的低分子量硫酸软骨素生产方法，其特征是，所用酸性粘多糖水解酶为普通变 形杆菌硫酸软骨素酶ABC。
4. 据权利要求l所述的低分子量硫酸软骨素生产方法，其特征是，所用酸性粘多糖水解酶为金黄节杆 菌硫酸软骨素酶AC。
5. 据权利要求l所述的低分子量硫酸软骨素生产方法，其特征是，所用酸性粘多糖水解酶为肝素黄杆 菌硫酸软骨素酶AC。
6. 据权利要求l所述的低分子量硫酸软骨素生产方法，其特征是，所用酸性粘多糖水解酶为肝素黄杆 菌硫酸软骨素酶B。
7. 据权利要求l所述的低分子量硫酸软骨素生产方法，其特征是，所用酸性粘多糖水解酶为肝素黄杆 菌硫酸软骨素酶C。
8. 根据权利要求l所述的低分子量硫酸软骨素生产方法，其特征是，所用酸性粘多糖水解酶为牛睾丸 透明质酸酶。
9. 根据权利要求l所述的低分子量硫酸软骨素生产方法，其特征是，所用酸性粘多糖水解酶为羊睾丸 透明质酸酶。
10. 根据权利要求l所述的低分子量硫酸软骨素生产方法，其特征是，所用酸性粘多糖水解酶为鞘胺 醇杆菌肝素酶。
11. 根据权利要求l所述的低分子量硫酸软骨素生产方法，反应条件为pH7. 5 — 9. 0,醋酸钠浓度为O. 05 —0. 2M的缓冲液。
12. 根据权利要求l所述的低分子量硫酸软骨素生产方法，反应温度25-45'C。
全文摘要
本发明涉及一种低分子量硫酸软骨素生产方法，包括(1)用酸性粘多糖水解酶裂解高分子量硫酸软骨素，(2)用截留分子量为5000Da的超滤膜将生成的低分子量硫酸软骨素及时滤除得到低分子量硫酸软骨素。该方法具有产品回收率高，产品质量高的优点。
文档编号C12P19/14GK101659973SQ20081014685
公开日2010年3月3日 申请日期2008年8月26日 优先权日2008年8月26日
发明者徐佳珊, 徐峥嵘 申请人:徐峥嵘;徐佳珊