专利名称：一种肝细胞和枯否细胞的体外共同培养技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种动物细胞的体外培养技术，特别地，涉及一种肝细胞和肝
枯否细胞(又称Kupffer细胞)的体外共同培养技术。
背景技术：
肝脏是人体中的重要器官，具有合成、代谢、解毒等功能。原代肝细胞的 体外培养有着广泛的应用价值，如研究肝细胞的生理、病理，应用于细胞移植、 药物学检测等，同时还可用于作为生物型人工肝(Bio-artificial Liver, BAL)
生物反应器的的主体细胞。体外培养肝细胞技术的优化是研制开发BAL生物反 应器的核心与关键之一。
然而，将分离的肝细胞用于上述多种用途中存在的主要问题之一是原代肝 细胞在体外培养的时间短，且很多分化功能是瞬时的，在培养物中仅持续几小 时至几天，限制了肝细胞的应用。
一些研究报告认为，肝细胞与非实质细胞在体外共同培养，更接近肝细胞 在体内生存环境，有利于延长肝细胞生存时间并保持功能。然而，这些研究均 是采用含有多种细胞成分的非实质细胞与肝细胞混合培养，且无固定的培养流 程和标准化搡作程序(standard opration procedure )。
在肝脏的非实质细胞中，Kupffer细胞是数量仅次于窦状内皮细胞(SEC)的另 一肝非实质细胞，约占肝脏非实质细胞的25-40%，属巨噬细胞，主要起着清除 内毒素、细菌、病毒和肿瘤细胞的功能，是机体防御系统的重要组成部分。但 肝细胞和Kupffer细胞在一个培养体系中共同培养，由于这两种细胞属不同
种类的细胞，体外培养条件与体内环境相差大，因此要在体外建立一个标准化、 简单易行的培养体系，实现两种细胞既能良好存活生长、并且能同时呈现两种 细胞的功能具有相当大的难度。
1994年，汪谦等人(大鼠肝细胞、K叩ffer细胞和Ito细胞的分离与培养. 中华实验外科杂志.1994，11 (2):72-72 )在研究中提及将大鼠肝细胞、Kupffer 细胞和Ito细胞这三种细胞两两或三位一体混合培养比单独培养在形态学和功 能上都显示优越，但该论文中未论及具体如何培养。
发明内容
本发明主要针对现有技术的不足，提供一种在普通培养条件下肝细胞和 Kupffer细胞的体外共培养技术，该技术可延长原代肝细胞的体外培养时间，且 保持肝细胞的功能，可用于构建生物型人工肝支持系统、药物学检测、肝细胞
移植、生产白蛋白等。
本发明所述的技术方案包括
一种肝细胞和Kupffer细胞的体外共同培养技术，其特征是将肝细胞和 Kupffer接种于含80-120 ml/L小牛血清，110-135u/L胰岛素，90-110jug /L 胰高血糖素，90-110jug /L氢化可的松，1. 0-3. Og/L NaHC03, 8-120万U/L青 霉素的pH为7-7. 5的DMEM培养基的培养板上，置于恒温WC, 5%二氧化碳培 养箱中培养，培养24h后倒去培养上清，用培养液冲洗，每天换液；其中肝细 胞和K叩ffer细胞数量比在9-15:1之间；优选方案，二种细胞的数量比为 10-14:1;比较优选地方案，二种细胞的数量比为11-13:1;最优选方案，二种 细胞的数量比为12: 1。
本发明比较优选的技术方案
乳猪肝细胞和Kupffer细胞的体外共同培养技术，其特征在于肝细胞和
Kupffer细胞的数量比在9-15: 1之间；优选方案，二种细胞的数量比为10-14: 1; 比较优选地方案，二种细胞的数量比为11-13:1;最优选方案，二种细胞的数量 比为12: 1。
研究表明，肝细胞和Kupffer细胞二者比例在9-15:1之间，肝细胞和 K叩ffer细胞在体外存活时间明显延长，且具有较好的肝细胞功能，能对安定 和乙酰氨基酚的清除率较高；尤其二者数量比为12: 1时，肝细胞和Kupffer细 胞在体外存活时间最长，对安定和乙酰氨基酚的清除率最高。
在本发明中，用于获得肝细胞的肝脏供体优选是哺乳动物的正常的或者转 基因动物，比较优选的是人、狒狒、猪、牛、马、犬或羊等；最优选的是人、 猪。
对于在生物型人工肝生物反应器的应用，肝细胞和Kupffer细胞的肝脏供 体来源比较优选的是猪供体，尤其是乳猪供体。优选猪龄在2个月之内，比较 优选为l个月之内，更优选在20天之内；优选猪体重在20kg之内，比较优选 在10kg之内，更优选在5kg之内。
细胞分离
本发明所述的分离原代肝细胞和Kupffer细胞的方法，可以使用本领域所 公知的任何方法。优选的方法是Seglen的二步灌流法或者是对其改进的方法。 本发明通过釆用改良的Seglen的二步灌流法，建立了以肝门静脉为流入道的IV 型胶原酶离体灌流法分离乳猪肝实质细胞，以及联合Percoll液密度梯度离心 法分离Kupffer细胞。该操作程序稳定、高效、实用。所获乳猪肝细胞数量、 活率基本能满足构建生物人工肝的要求。且采用低速离心，并缩短离心时间， 可很好地清除上清中的细胞碎片。IV型胶原酶对肝细胞的损伤较小，在培养后，
本发明所述的共培养的肝细胞和Kupffer细胞可以来源于同一种动物，也 可以来源于不同种动物；可以来源于同一只动物，也可以来源于不同只动物。
细胞培养
用含适量的小牛血清，胰岛素，胰高血糖素，氢化可的松，NaHC03,青霉 素，DMEM培养基将肝细胞悬液密度调整为肝细胞数约5x105—1xl07ml，取6孔培 养板一块，播种肝细胞于其中，K叩ffer细胞根据肝细胞数量调节到相应比例后 加入，置于恒温37"C5y。二氧化碳培养箱中培养，培养24h后倒去培养上清，用少 量培养液冲3次，每天换液。分别收集肝细胞与K叩ffer细胞培养过程中不同时 间内的上清液，以1000g的离心速度离心3分钟，去除细胞碎片，将处理后的培 养上清置于一20"C的冰箱中保存以备药物浓度及生化功能检査。
本发明所述的细胞数量可釆用本领域公知的计数方法计数。 本发明所述的肝细胞和Kupffer细胞在分离后直接按照一定的比例混合后
共培养。
所述肝细胞和Kupffer细胞可作为细胞悬浮液或在适合动物细胞或组织培 养的表面上培养和维持，如培养皿，培养板或培养瓶等。也可以将所述细胞掺 入到生物反应器中，以悬浮形式或在诸如培养珠或纤维的培养基质或在平面或 膜上铺板的形式培养。
细胞鉴定
肝细胞的鉴定可选择通用的经典方法。Kupffer细胞的鉴定可采用吞噬试验 和免疫组织化学方法。肝细胞培养领域的技术人员可以参考公开的文献进行鉴
本发明肝细胞功能检观U分析
表征肝细胞功能的任何分析方法都可以用于确定原代肝细胞的长期功能。 肝细胞功能的分析方法为本领域所熟知，包括，但不局限于分析肝细胞酶的活 性，测定由肝细胞表达的蛋白和化合物，以及测定肝细胞中基因的表达水平。 由肝细胞表达的蛋白和化合物包括，但不局限于尿素，白蛋白。肝脏是白蛋白 唯一的合成器官，白蛋白的分泌是完全分化的肝细胞的特征，可以用标准的 ELISA检测方法测定。可通过检测尿素向靛酚的转化测定尿素的合成。
众所周知，肝脏的P450系统是正常肝脏功能的重要组成部分。该系统直接 完成肝脏转化功能和代谢功能。因此，生物人工肝脏是否具有P450系统的作用， 成为评价其人工肝脏性能的可靠与实用的指标图。而其中最能反映P450系统 作用的当属于安定等药物的转化清除试验。安定和对乙酰氨基酚对肝脏均有毒 性，当肝细胞功能良好同时在有K叩ffer的支持下，如体外培养的肝细胞能够 在这两种药物作用下继续长期生存，并且代谢这两种药物，说明培养的细胞系 具有合成、代谢和解毒功能。本发明研究结果表明，合适比例的肝细胞和K叩ffer
细胞共同培养时，具有优化的合成、代谢和解毒功能。 本发明的应用
本发明任一所述的肝细胞和K叩ffer细胞的体外共同培养技术，可用于构 建生物型人工肝支持系统；比较优选的，乳猪肝细胞和K叩ffer细胞的体外共
同培养技术可用于构建生物型人工肝支持系统；可用于生产白蛋白；可用于筛
选和研究用于治疗肝脏疾病的候选药物等。
在用于构建体外的肝脏辅助装置时，可用于患有急性或爆发性肝功能衰竭 的患者的治疗装置。该装置可以起者临时支持装置的作用，能够暂时提供肝脏 功能，直到肝脏移植或者患者自身的肝脏再生。
本发明的关键和优势
本发明的关键在于选择确定了肝细胞和K叩ffer细胞在体外共同培养的比
例，从而延长了肝细胞的生存时间，保持了肝细胞的功能。Kupffer细胞的主要
生理功能包括吞噬和清除功能，分泌包括IL-1, TNF-a,HGF在内的各种细胞因
子，分泌前列腺素和氧化类物质，杀灭肿瘤细胞。但Kupffer细胞在肝损伤和
肝衰竭的发生中又常常起着不良的作用，在病理情况下对肝实质细胞有杀伤作
用。K叩ffer细胞是肝窦中潜在的活性氧来源，受刺激激活化后可产生并释放活
性氧。有实验证实Kupffer细胞是肝缺血再灌注损伤初期活性氧的主要来源，
在缺血再灌注损伤的初期，Kupffer细胞可因补体系统的激活而激活，还可自身
活化，释放活性氧和蛋白酶等，介导肝脏的损伤，并激活中性粒细胞攻击肝实
质细胞，形成恶性循环，最终导致肝组织的严重损伤(JaeschkeH,FarhoodA,B肌tista AP,et al.Complement activates Kupffercells and neutrophils during reperfusion after hepatic ischemia.Am J Physiol,1993,264(4Ptl):G801-G809)。另一方面，Kupffer细胞释放的
TNF， IL-1， IL-6等细胞因子与肝衰竭发病机制中的细胞因子瀑布学说相一致。 而实验中新分离的肝实质细胞有细胞膜的损伤，有可能使Kupffef细胞激活， 导致Kupffer细胞对肝细胞的杀伤作用。本发明通过调整肝细胞和Kupffer细 胞在体外培养体系中的比例，获得了简单实用的解决这两种细胞功能上互相冲 突造成损伤的技术方案。
本发明的优势在于体外肝细胞和Kupffer细胞的共培养可釆用普通的培养 基和培养板，不需复杂的技术和稀有材料，成本低，实用性强；乳猪肝细胞和 Kupffer细胞，是能够直接用于构建生物型人工肝支持系统的一种细胞； 一定比 例的肝细胞和Kupffer细胞共同培养时，可延长肝细胞在体外的存活时间，且 具有合成、代谢和解毒功能。
图l新分离的肝细胞(光镜10x20)
图2.新分离的Kupffer细胞(光镜10x20)
图3.单独培养148小时后的枯否细胞(光镜10 x 20)
图4.单独培养216小时后的肝细胞(光镜10x20)
图5肝细胞与枯否细胞按8: 1混合共培养216小时(光镜10 x 20)
图6肝细胞与枯否细胞按16: 1混合共培养216小时(光镜10 x 20)
图7肝细胞与枯否细胞按12: 1混合共培养216小时(光镜10 x 20)
图8肝细胞与枯否细胞按12: 1混合共培养240小时(光镜10 x 20)
具体实施例方式
以下通过具体实施例来说明本发明的技术方案，但并不限于此。 实施例1乳猪肝细胞和Kupffer细胞的体外共培养
将细胞数量比为12:1的乳猪肝细胞和K叩ffer细胞接种于含100 ml/L小牛 血清，125u/L胰岛素，lOO)ig/L胰高血糖素，100Mg/L,氢化可的松，2. 0g/L NaHC03， 10万U/L青霉素的pH为7. 2的画EM培养基的6孔培养板上，置于恒 温37'C, 5%二氧化碳培养箱中培养，培养24h后倒去培养上清，用培养液冲3 次，每天换液。
以下通过实验来说明乳猪肝细胞和K叩ffer细胞单独培养、共培养情况下 的培养效果 一.材料和方法
1. 实验动物实验乳猪由云南省原种猪场提供，日龄小于20天，体重小于5kg, 健康，雌雄不限，实验前4小时断乳，清洁皮毛后备用。
2. 主要试剂 collagenase IV、台盼蓝(trypan blue) 、 L-谷氨酸钠、D-葡萄
糖丙酮酸钠购自美国Sigma公司；新生小牛血清为杭州四季青公司产品；DMEM 培养基为Gibic公司；Percoll细胞分离液购自Pharmacia公司；注射用青霉素、 链霉素为华北制药股份有限公司；肝素、HEPES、氯化按、EDTA、 NaH2P042H20、 地塞米松、胰岛素、硫喷妥钠、肝素、Nacl、 Kcl、 Na2HP04. 12&0等均为国产制 剂和分析纯；D-Hanks液、PBS、 Percol 1工作液均为自制。 3.乳猪肝细胞与Kupffer细胞的分离 3. l.乳猪肝实质细胞的分离
以2. 5%硫喷妥钠(0. 6—lml/kg)腹腔注射麻醉乳猪，常规方法消毒皮肤铺 单，沿腹正中线开腹。暴露门静脉、肠系膜上静脉等并注入肝素钠100—150u，沿 门静脉插管并固定。结扎肝动脉，胃左右静脉脾静脉肠系膜下静脉等。保留 门静脉插管，离断肝脏韧带及其它血管及系膜并将肝脏移入无菌筛网中夹闭肝 下腔静脉，先自门静脉灌注前灌注液，速度为350ml/min,待肝脏充盈后打开肝 下腔静脉并继续灌注直至流出液清晰为止(约2000ml， 6min)。再循环灌注酶灌 流液，速度为7Qml/min,直至肝脏变软，包膜发亮为止停止灌注(约400ml ),将 肝脏置入预冷的DMEM培养基中顿性撕裂肝组织，去除包膜和筋膜，加入D-Hanks 液终止消化后，以100目筛网过滤离心洗涤3次100g/min, 3min。所得下层及单个 肝细胞。
3. 2. Kupffer细胞分离
用percoll液密度梯度离心法分离Kupffer细胞。取l/2混合肝细胞悬液用 200目尼龙网过滤除去肝细胞团块等，50g 3min，离心除肝实质细胞，上清再以 300glOmin离心，沉淀细胞重复洗涤一次后用20ml PBS液垂悬待用。将25ml肝非 实质细胞液铺于两层percoll液上，800g/min，40C, 20min离心，整个离心管的液 体分成四层，kupffer细胞位于第三带50y。层，收集该带细胞用等体积的PBS液稀
释，40C下900g离心10min,DMEM培养液垂悬肝细胞。Kupffer细胞经免疫组织化
学染色鉴定。
4. 培养条件 按实验分组将肝细胞和/或K叩ffer接种于含100 ml/L小牛血 清，125u/L胰岛素，lOOiag /L胰高血糖素，lOOpg/L,氢化可的松，2. Og/L NaHC03， 10万U/L青霉素的画EM培养基(pH7. 2)的6孔培养板上，置于恒温 37°C, 5%二氧化碳培养箱中培养，培养24h后倒去培养上清，用少量培养液冲3 次，每天换液。
5. 实验分组 A组空白对照组
B组单纯肝细胞培养组
C组单纯Kupffer细胞培养组
D组肝细胞Kupffer细胞(8: 1 )组
E组肝细胞Kupffer细胞(12: 1 )组
F组肝细胞Kupffer细胞(16:1)组
6. 肝细胞、Kupffer细胞的形态观察及功能检测
6. l肝细胞及K叩ffer细胞形态观察用倒置显微镜及全自动显微摄影装置动态
观察记录培养中肝细胞及Kupffer细胞的生长情况及其形态学改变。
6. 2白蛋白浓度的测定在Olympus AU-2700全自动生化分析仪上采用溴甲酴绿
法测定培养的i-io天内加有氯化铵的细胞培养上清白蛋白的含量。培养上清白
蛋白的测定采用标准的溴甲酚绿法在Olympus AU2700全自动生化分析仪测定， 釆用Olyrapus公司的配套试剂并按照操作手册方法进行检测。 6. 3安定转化功能测定在培养基中加入30mg/L安定标准品培养24h后，用高 效液相色谱仪测定上清中安定的浓度，连续10天取样分析。该方法由发明者课
题组制定(见文献韦嘉(通讯作者).体外培养肝细胞安定代谢能力的高效液
相测定法.肝脏2008， 2: 129-131)
6. 4醋氨酚清除功能测定在培养基中加入50mg/L醋氨酚标准品培养24h后，
用自动荧光偏振免疫法测定上清中醋氨酚的浓度，连续10天取样分析。荧光偏 振血药浓度检测仪型号为TDxFLx，配套试剂及仪器均为美国雅培公司，按照操 作手册方法进行检测。
表1 前灌流液和酶灌流液的配制组成
前灌流液用时其中每升加入地酶灌流液用时其中每升加入地塞米松 塞米松4Qmg，葡萄糖1.0g,青4Qmg,葡萄糖1. Og,青链霉素各0. lg, 链霉素各O. lg，最后用NaOH调最后用NaOH调至PH 7.4,过滤除菌，4 至PH 7. 3，过滤除菌，4 。C保存，。C保存，37。C水浴加热。其中胶原酶临
37 r水浴加热。 用时再加入。
g/L
组分
g/L
NaCl8. 176NaCl8. 0
KC10. 403Kcl0. 4
Na2HPO,0. 114Na2HP04.12H200.151
HEPES5. 958NaH2P04.2H200. 078
EDTA2. 253HEPES2. 38
L-谷氨钠0. 336CaC120. 56
D-葡萄糖0. 129Collage 40. 5
丙酮酸钠0. 253Tryps ininhibi tor0. 05
MC032. 1NaHC030. 35
DMEM培养基的组成称量匿EM13. 4g; NaHCO山2g; HEPES10. 0ml (1. 5mol/L) 调节PH7.2，三蒸馏水加至1L,其它组分的终浓度见下表2。加入孔径O. 22，
过滤除菌，分装，4。C储存。
表2 DMEM培养基中其它成分及浓度
成分终浓度
EGF20ng/ml
地塞米松40 |i g/ml
胰岛素lOjig/ml
胰高血糖素10|ig/ml
NGF100 (ig/ml
矽酸钠10-5mol/ml
亚油酸10-5mol/ml
1oy。胎牛血清100ml
7.统计学分析数值以^+s表示，采用SPSS11.5软件进行统计学分析
二、试验结果
l.肝细胞及K叩ffer细胞产率、活率及细胞总数
经改良的灌流系统对乳猪肝脏行胶原酶离体灌流，每头乳猪新鲜分离的肝 细胞总数达(3. 5士l.l)x109,细胞活率达(92士 2)% , K叩ffer细胞的产量平均 为(2. 35±0. 5) x108,纯度为(95±4) %。
2. 肝细胞及K叩ffer细胞形态观察
刚分离的肝细胞为透亮、呈球形且边界清晰，其间有少数非实质细胞(图1); 刚分离的枯否细胞为球形，右上角为聚集的肝实质细胞团块(图2)。
3. 肝细胞、Kupffer细胞的单独培养及二者不同比例混合培养生长、存活状况
各培养组中成活的肝细胞均从2~3h开始贴壁，至24h活细胞全部贴壁， 死细胞则漂浮于培养液上清中；成活的K叩ffer细胞至2h全部贴壁。
单独培养的Kupffer至148小时时，细胞生长良好，极度伸展，呈梭形(图 3)，培养至216小时时，细胞死亡达50%。
肝细胞单独培养组，肝细胞于一周后即开始出现少量的死亡细胞漂浮，随 培养时间的延长，漂浮细胞明显增多，且细胞生长增值缓慢，至细胞培养216 小时时细胞基本全部死亡(图4)。
肝细胞与枯否细胞按8: 1混合共培养216小时后可见肝实质细胞多数死亡；
剩下的枯否细胞仍有存活(图5)，肝细胞与枯否细胞按16:1混合组细胞多数 已死亡(图6);
12:1组肝细胞的生长、增殖较其他比例共同培养组和肝细胞单独组的细胞 增殖迅速，细胞贴壁后体积变大，逐渐铺展开来，向正常肝细胞的形态演变， 呈岛屿状或条索状，共培养216小时后可见细胞生长良好，呈集落生长(图7), 肝细胞与枯否细胞按12: 1混合共培养240小时后可见肝实质细胞多数仍存活， 部分死亡，密度较前稀疏(图S),培养至3周时细胞全部死亡。 5.安定转化功能及醋氨酚清除功能检测
每隔24小时换液一次，以1000r/min离心去除细胞碎片，并分别采用高效
液相色谱仪和自动荧光偏振分析仪检测对安定和醋氨酚药物的清除效果。 5. l安定转化功能
表3 不同培养组安定转化功能比较(单位mg/L)
组别 N 安定浓度；士s
对照(A) H 29. 3650±0. 38839
K卯ffer组(B) 10 29. 1488±0. 23953
肝细胞组(C) 10 25. 4975±1. 33698
8: 1组(D ) 10 25. 4531±1. 55508
12: 1组(E) 10 23. 7881土1. 00529*
16: 1组(F)_^_24. 7981±0. 99440
*经方差分析两两比较E组与A、 B、 C、 D组比较安定浓度显著降低(P<0. 05 )。 5. 2醋氨酴清除功能检测
表4 对乙酰氨基酚清除功能比较(单位mg/L)
组别 N 醋氨酚^s
对照(A) 44, 4395±0. 89466~
Kupffer组(B) 1 0 40. 4400±0. 40057
肝细胞组(C) 10 38. 5270±2. 31004
8: 1组(D) 10 39. 3230±2. 36752
12: 1组(E) 10 33. 6430±1. 5168**
<formula>formula see original document page 16</formula>
"经方差分析两两比较E组与A、 B、 C、 D和F组比较，对乙酰氨基酚浓度
显著降低(P<0. 05)。
6.白蛋白测定结果
表5白蛋白测定结果(单位g/L) 组另'J n x + s
从表中显示出12: l组的白蛋白合成水平较其他组高。 以上结果表明，当肝细胞和K叩ffer细胞二者数量比例在8-16: l之间时， 能明显延长肝细胞在体外的存活时间，尤其在二者比例为12: 1时，肝细胞在 体外存活时间最长，且能保持较好的合成、分泌、解毒功能。
' 10 3. 2000±0. 07071
b 10 3. 2700±0. 12517
e 10 3. 6200±0. 49677
|_d 10 3. 6000±0. 48477
12:1组6 10 3. 7100±0. 44833
16:l组t 10 3. 6300±0. 43410
照否独u
对枯单ci^
权利要求
1.一种肝细胞和Kupffer细胞的体外共同培养技术，其特征是将肝细胞和Kupffer接种于含80-120ml/L小牛血清，110-135u/L胰岛素，90-110μg/L胰高血糖素，90-110μg/L氢化可的松，1.0-3.0g/L NaHCO3，8-120万U/L青霉素的pH为7-7.5的DMEM培养基的培养板上，置于恒温37℃，5％二氧化碳培养箱中培养，培养24h后倒去培养上清，用培养液冲洗，每天换液；其中肝细胞和Kupffer细胞数量比在9-151之间。
2、 如权利要求l所述的肝细胞和Kupffer细胞的体外共同培养技术，其特征是 将肝细胞和K叩ffer接种于含100 ml/L小牛血清，12Su/L胰岛素，lOO]dg /L胰高血糖素，lOOyg /L，氢化可的松，2.0g/L NaHC03, 10万U/L青霉 素的pH为7. 2的DMEM培养基的培养板上，置于恒温WC, 5%二氧化碳培 养箱中培养，培养24h后倒去培养上清，用培养液冲洗，每天换液。
3、 如权利要求2所述的肝细胞和K叩ffer细胞的体外共同培养技术，其特征在 于肝细胞和Kupffer细胞数量比在10-14: 1之间。
4、 如权利要求3所述的肝细胞和K叩ffer细胞的体外共同培养技术，其特征在 于肝细胞和Kupffer细胞数量比在11-13: 1之间。
5、 如权利要求4所述的肝细胞和K叩ffer细胞的体外共同培养技术，其特征在 于肝细胞和Kupffer细胞比例在12: 1。
6、 如权利要求5所述的肝细胞和K叩ffer细胞的体外共同培养技术，其特征在 于肝细胞和Kupffer细胞为哺乳动物的肝细胞和Kupffer细胞。
7、 如权利要求6所述的肝细胞和K叩ffer细胞的体外共同培养技术，其特征在于哺乳动物为乳猪、乳牛或人。
8、 如权利要求7所述的肝细胞和Kupffer细胞的体外共同培养技术，其特征在 于乳猪肝细胞和Kupffer细胞数量比为在9-15: 1之间。
9、 如权利要求8所述的肝细胞和K叩ffer细胞的体外共同培养技术，其特征在 于乳猪肝细胞和Kupffer细胞数量比为在10-14: 1之间。
10、 如权利要求9所述的肝细胞和Kupffer细胞的体外共同培养技术，其特 征在于乳猪肝细胞和Kupffer细胞数量比为在11-13: 1之间。
11、 如权利要求10所述的肝细胞和K叩ffer细胞的体外共同培养技术，其特 征在于乳猪肝细胞和Kupffer细胞数量比为U:l。
12、 权利要求1-11任一所述的肝细胞和Kupffer细胞的体外共同培养技术在 构建生物型人工肝支持系统中的应用。
全文摘要
本发明提供一种在普通培养条件下肝细胞和Kupffer细胞的体外共培养技术，其特征是将肝细胞和Kupffer细胞以一定比例混合培养，可延长原代肝细胞的体外培养时间，优化肝细胞的功能，可用于构建生物型人工肝生物反应器、药物学检测、肝细胞移植等。
文档编号C12N5/06GK101368170SQ20081014714
公开日2009年2月18日 申请日期2008年8月21日 优先权日2008年8月21日
发明者何凌滔, 嘉 韦 申请人:韦 嘉;何凌滔