专利名称：：一种通量鉴定小麦高分子量麦谷蛋白亚基的方法
技术领域：
：本发明属于分子生物
技术领域：
，涉及小麦品质性状分子标记的实用检测方法，特别涉及基于PCR技术的多个小麦优质高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)的快速鉴定。
背景技术：
：蛋白质的数量和质量是影响小麦面粉品质的重要因素。小麦种子储藏蛋白主要由麦醇溶蛋白(Gliadin)和麦谷蛋白(Glutenin)组成，麦谷蛋白又分为高分子量麦谷蛋白亚基(H丽-GS)和低分子量麦谷蛋白亚(L丽-GS)，亚基间通过二硫键结合形成谷蛋白大聚合体，赋予面团独特的粘弹性和延展性[PaynePI，LawCN，MuddEE.Controlbyhomologousgroup1chromosomesofthehigh_molecular_weightsubunitsofglutenin,amajorproteinofwheatendosperm.TheorApplGenet，1980，58:113—120;WrigleyCW.Giantproteinswithflourpower.Nature,1996，381:738—739;GianibelliMC，Larroque0R，MacRitchieF.Biochemical,genetic,molecularcharacterizationofwheatgluteninanditscomponentsubunits.CerealChem，2001，78:635-646]，可以加工成面包、面条和糕点等多种食品。遗传和生化研究表明，高分子量谷蛋白的组成和数量与小麦面包力口工品质密切相关[PaynePI，LawCN，MuddEE.Controlbyhomologousgroup1chromosomesofthehigh_molecular_weightsubunitsofglutenin,amajorproteinofwheatendosperm.TheorApplGenet，1980，58:113—120;PaynePI，Geneticsofwheatstorageproteinsandtheeffectofallelicvariationonbreadmakingquality.AnnRevPlantPhysiol，1987，38:141—153;RadovanovicN，CloutierS，BrownD，etal.Geneticvarianceforglutenstrengthcontributedbyhighmolecularweightgluteninproteins.CerealChem.2002，79:843-849]。高分子麦谷蛋白基因位点Glu-1位于第1同源群染色体长臂，在A、B、D组染色体上含有相应的Glu-Al、Glu-Bl和Glu-Dl同源基因复合位点，每个Glu-1位点又包含分别编码x-和y_型高分子麦谷蛋白亚基的2个紧密连锁基因[PaynePI，LawrenceGJ.Catalogueofallelesforthecomplexloci，Glu-Al，Glu—BlandGlu—Dl，whichcodeforhigh_molecular_weightsubunitsofglutenininhexaploidwheat.CerealResComm，1983，11:29_35;ShewryPR，HalfordNGandTathamAS.Thehigh_molecular_weightsubunitsofwheatglutenin.JournalofCerealScience,1992，15(2):105-120]。Payne首先建立了小麦高分子量谷蛋白亚基(对)对面筋品质贡献的评分系统，如Axl/Ax2伞和Dx5是目前公认的面包小麦优质亚基[PaynePI，Geneticsofwheatstorageproteinsandtheeffectofallelicvariationonbreadmakingquality.AnnRevPlantPhysiol，1987，38:141-153]。研究表明，等位基因Glu-Blal编码的超表达Bx7亚基(Bx7QE)能显著提高面筋强度[ButowBJ，MaW，GaleKR，etal.MoleculardiscriminationofBx7allelesdemonstratesthatahighlyexpressedhigh_molecular_weightgluteninallelehasamajorimpactonwheatflourdoughstrength.TheorApplGenet，2003，107:31524-1532]，含有Bx7GE的小麦育成品种或地方品种通常都具有更好的面筋强度[VawserMJ，CornishGB.OverexpressionofHMWgluteninsub皿itGlu-Bl7xinhex即loidwheatvarieties(Triticumaestivum).AustralJAgricRes，2004，55:577-588;Lukow0M，ForsythSA，PaynePI.Over—productionofHMWgluteninsubunitscodedonchromosomelBincommonwheat,Triticumaestivum.JGenetBreed,1992，46:187—192;RadovanovicN，CloutierS，BrownD，HumphreysDG，Lukow0M.Geneticvarianceforglutenstrengthcontributedbyhighmolecularweightgluteninproteins.CerealChem，2002，79:843-849]。发掘和利用Bx7°E已成为进一步改良小麦品质的重要途径，目前发达国家优质小麦育种计划正加强利用这一基因。普通小麦中的Bx7^亚基来自南美的一个地方品种，中国小麦品种几乎不含有这一亚基。通过杂交聚合育种引入Bx7，Dx5等优质亚基，是快速改良我国小麦品质的有效途径。SDS-PAGE是分离和鉴定HMW-GS的传统方法，但不能有效鉴别分子量大小和迁移率十分接近的亚基[ShewryPR，HalfordNGandTathamAS.Thehigh_molecular_weightsubunitsofwheatglutenin.JournalofCerealScience,1992,15(2):105-120]，且费工费时。近年来，随着大量的HMW-GS基因被克隆，主要等位基因的DNA分子标记也相应被建立[AhmadM.Molecularmarker-assistedselectionofHMWgluteninallelesrelatedtowheatbreadqualitybyPCR_generatedDNAmarkers.TheorApplGenet，2000，101:892-896;DeBustosA，RubioP，JouveN.MolecularcharacterisationoftheinactivealleleofthegeneGlu—AlandthedevelopmentofasetofAS—PCRmarkersforHMWgluteninsofwheat.TheorApplGenet，2000，100:1085-1094]，利用连锁分子标记鉴定亚基组成更加方便、准确、可靠。然而在我国现有育种条件下，相对表型鉴定而言，分子标记辅助选择技术因成本较高未能真正用于育种实践。与单个基因分子标记的PCR鉴定方法相比，多重PCR(multiplexPCR)技术体系含有多个基因标记引物，通过一次反应能够对多个性状基因进行鉴定，实验成本明显降低，工作效率显著提高[MoczulskiM，SalmanowiczBP(2003)MultiplexPCRidentificationofwheatHMWgluteninsub皿itgenesbyallele—specificmarkers.Theor.Appl.Genet.44(4):459-471]。目前，用于小麦研究的多重PCR技术主要涉及与品质相关的高(低)分子谷蛋白亚基基因、籽粒硬度基因和淀粉酶基因等[MaW，ZhangW，GaleKR.Multiplex—PCRtypingofhighmolecularweightgluteninallelesinwheat.Euphytica，2003，134:51-60;ZhangXK，LiuL，HeZH，SunDJ，HeXY，XuZH，ZhangPP，ChenFandXiaXC.DevelopmentoftwomultiplexPCRassaystargetingimprovementofbread-makingandnoodlequalitiesincommonwheat.PlantBreeding,127(2):109-115;张晓科，夏先春，王忠伟，万映秀，张平治，何心尧，杨燕，何中虎.小麦品质性状分子标记多重PCR体系的建立.作物学报，2007，33(10):1703-1710]，能够同时鉴定3个Glu-l位点上重要优质亚基基因的多重PCR技术还未见报道。
发明内容本发明目的是提供一种通量鉴定几个高分子量谷蛋白优质亚基的多重PCR实用方法。本发明提供的小麦高分子量谷蛋白优质亚基的分子鉴定技术，是通过选用3个已经报道的AxNull、Bx7°E和Dx5亚基基因的特异分子标记，通过优化PCR反应体系和热循环条件而建立起来的。由于在Glu-Al位点通常只编码3种亚基，分别是Axl、Ax2*和Ax皿ll[Thompson,RD，D.Bartels，NP.Harberd&RB.Flavell.Characterisationofthemultigenef咖ilycodingforHMWgluteninsub皿itsinwheatusingcDNAclones.TheorA卯lGenet，1983，67:87-96]，通过鉴定Ax皿ll可以间接判断优质亚基Axl/Ax2氺存在与否，因此该方法经一次PCR和普通琼脂糖凝胶电泳检测，可鉴定4种优质亚基的有无。经品种和群体验证，利用本发明检测品种(系)的结果可靠、重复性好，为小麦品质改良过程中，育种材料和杂交后代高分子量谷蛋白优质亚基的有效鉴定和选择，提供了一种简单、准确的实用检测方法。用于通量检测上述分子标记的多重PCR技术属于本发明的保护范围。图1.AxNull、Bx7°E、Dx5亚基组合不同的小麦品系多重PCR凝胶电泳图。1是分子Marker(D2000)，2是CJ02(AxNull)，3是CJ05(7°E)，4是CJ12(Dx5)，5是CJ54(AxNull+Bx70E)，6是CJ17(AxNull+Dx5)，7是CJ25(Bx70E+Dx5)，8是CJ31(AxNull+Bx70E+Dx5)图2.部分西藏小麦品种(系)优质亚基组成的多重PCR鉴定。l是分子Marker(D2000)，2-4是XZ10，XZ35，XZ37(AxNull)，5是XZ69(Dx5)，6-7是XZ19，XZ14(AxNull)，8是XZ37(Dx5)，9是XZ84(AxNull)，10是XZ47(AxNull+Dx5)，11-15是XZ28，XZ13，XZ54，XZ61，XZ57(AxNull)，16是XZ42(AxNull+Dx5)，17是XZ72(AxNull)具体实施方法下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例一所需材料DNA的提取和检测以及PCR引物的选取l.DNA的提取及检测CTAB法从种子中提取小麦总DNA，利用紫外分光光度计检测总DNA的质量和浓度。PCR引物序列各分子标记的引物序列、目的片段大小等见下表<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>实施例二多重PCR体系的建立多重PCR反应体系总体积为25ul，包括PCRBuffer(Mg2+Free)、1.5mMMgCI2、200uMdNTP、1.5U的Taq酶和150ng的模板DNA，亚基Bx7°E、Dx5和AxNull特异分子标记的上下游引物分别为5/5/8pmo1。由于3对引物其中一对的退火温度较高，所以采用一种类似降落PCR的方法来优化扩增条件，最佳热循环条件为95t:预变性5min，94"C变性30S，62°C退火30S，72。C延伸lmin，8个循环；然后94。C变性30S，58。C退火30S，72。C延伸lmin，27个循环；最后72t:延伸10min。采用该扩增程序可以富集引物与模板正确配对的产物，使每对引物都能合成特异的扩增产物。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色后用凝胶成像系统观察并照相。利用HMW-GS组成已知的7个小麦品种(系)验证Bx7°E、Dx5和AxNull分子标记多重PCR技术体系的准确性。结果表明，Glu-Al位点为Null的材料均能产生920bp的扩增条带，Glu-Bl位点为Bx7°E的材料均能产生844bp扩增条带，Glu-Dl位点为Dx5的材料均能产生476bp的扩增条带，以上条带与相应的单一PCR扩增产物大小一致。图1示Bx7°E、Dx5和AxNul1不同亚基组合材料的多重PCR扩增带型，含有AxNul1和Bx7°E两个亚基的品种中，同时扩增出920bp和844bp的2个条带，含有AxNull和Dx5的品种扩增出920bp和476bp的2个条带，含有Bx7°E和Dx5的品种扩增出了844bp和476bp的2个条带，含有lAxNull、1Bx7。e和1Dx5三个亚基的品种，则同时产生920bp、844bp和476bp的3个条带。实施例三对西藏小麦进行多重PCR鉴定利用本实验建立的多重PCR体系鉴定89份西藏小麦HMW优质亚基的组成，结果表明在Glu-Al位点，Axl或Ax2承亚基的分布频率为12.36%，Null劣质亚基出现频率较高；Dx5亚基的分布频率为12.36%;在Glu-Bl位点没有检测到Bx7°E亚基。有10.11%的供试品种(系)同时具有Axl/Ax2*和Dx5亚基(见图2)。权利要求一种通量鉴定小麦高分子量麦谷蛋白亚基的方法，其特征在于PCR体系同时含有Glu-A1位点的NullAx、Glu-B1位点的Bx7OE和Glu-D1位点的Dx5亚基基因分子标记引物，经反应体系、扩增程序优化以及普通琼脂糖电泳分离特异扩增产物，一次反应能同时鉴定上述3个Glu-1位点上的优质亚基。2.权利要求l所述的通量鉴定小麦高分子量麦谷蛋白亚基的方法，其特征在于PCR反应体系中的引物具有如下核苷酸序列，彼此之间不会形成引物二聚体。AxNullForward:ACGTTCCCCTACAGGTACTAReverse:TATCACTGGCTAGCCGACAABx70EForward:CCACTTCCAAGGTGGGACTAReverse:TGCCAACACAAAAGAAGCTGDx5Forward:CGTCCCTATAAAAGCCTAGCReverse:AGTATGAAACCTGCTGCGGAC3.权利要求l所述的通量鉴定小麦高分子量麦谷蛋白亚基的方法，其扩增程序为95。C预变性5min，94。C变性30S，62。C退火30S，72°C延伸lmin，8个循环；然后94。C变性30S，58。C退火30S，72。C延伸lmin，27个循环；最后72。C延伸10min。4.权利要求1所述的通量鉴定小麦高分子量麦谷蛋白亚基的方法在小麦品种改良中的应用。全文摘要本发明属于分子生物
技术领域：
，涉及基于PCR的小麦品质性状分子标记的通量实用检测方法。该方法选用NullAx(Glu-A1位点)、Bx7OE(Glu-B1位点)和Dx5(Glu-D1位点)亚基基因的特异分子标记，通过优化PCR反应体系和热循环条件，建立起一次反应能同时鉴定Glu-1位点上重要优质亚基的多重PCR体系，且普通琼脂糖电泳能有效分离特异扩增产物。较之单一PCR反应，该方法检测效率大大提高，经品种和群体验证，鉴定结果可靠、重复性好，为育种材料评价和杂交后代高分子量谷蛋白优质亚基的有效鉴定和选择，提供了一种简单、准确、快速的实用方法。文档编号C12Q1/68GK101760507SQ20081014803公开日2010年6月30日申请日期2008年12月25日优先权日2008年12月25日发明者付体华,郑寒,陈静申请人:中国科学院成都生物研究所