专利名称：人源性抗大疱性类天疱疮抗原bp180单链抗体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人源性抗大疱性类天疱疮抗 原BP180单链抗体，它通过与BP180的结合，阻断大疱性类天疱疮自身抗 体与相应自身抗原BP180的结合，从而阻断由于自身抗体的结合而激活补体 所介导的炎症反应，具有治疗大疱性类天疱疮的作用。
背景技术：
大疱性类天疱疮(BP)是一种常见而且顽固的自身免疫性水疱病，而 且是一种疑难病症，目前缺乏特异性治疗手段而主要依靠糖皮质激素等进行 系统免疫抑制。大疱性类天疱疮病的主要病理改变是以抗BP180自身抗体为主的致病 性自身抗体与相应抗原结合，激活补体并引发免疫炎症反应，导致表皮真皮 分离形成水疱。目前在临床上对大疱性类天疱疮的治疗包括皮质类固醇激 素、免疫抑制剂和其他治疗方法。由于缺乏特异性，因而疗效差且毒副作用 显著。根据申请人所进行的资料检索，目前国内外尚没有治疗大疱性类天疱 疮的特效药品。发明内容本发明的目的在于提供一种人源性抗大疱性类天疱疮抗原BP180单链 抗体(human anti-BP180scFv)，可在大肠杆菌中进行可溶性表达，以期利 用该人源性的抗大疱性类天疱疮抗原BP180单链抗体解决临床治疗大疱性 类天疱疮的问题，并最终成为治疗大疱性类天疱疮的生物药品。 为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案 一种人源性抗大疱性类天疱疮抗原BP180基因工程抗体，其基因序列在结构上属于单链抗体(scFv)，由轻链可变区基因和重链可变区基因组成，其中轻链可变区基因为CGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGGCGGAGGGACC;重链可变区基因为:CACTTTCAGTAACTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGATTGGAGTGGGTGGGAACCCTGGTCACCGTCTCTTCA 。上述人源性抗大疱性类天疱疮抗原BP180单链抗体的制备方法，包括以 下主要步骤a、 分离大疱性类天疱疮患者外周血单一核细胞，提取RNA并经过RT-PCR 扩增抗体轻重链可变区基因，构建噬菌体抗体库；b、 从噬菌体抗体库中筛选抗BP180噬菌体抗体；c、 利用基因工程手段，获得可溶性表达的人源性抗BP180单链抗体；d、 对所获抗体的结合活性、特异性、亲和力等免疫学特性进行鉴定。 通过生物学实验证明，本发明的人源性抗大疱性类天疱疮抗原BP180单链抗体，具#封闭大疱性类天疱疮自身抗体与相应自身抗原结合的活性，能够阻断由于自身抗体的结合而激活补体所介导的炎症反应，具有治疗大疱 性类天疱疮的作用。
具体实施方式
大疱性类天疱疮(BP)的发病是由致病性自身抗体介导、补体等多种 炎症成分参与而导致皮肤严重免疫损伤的一个复杂过程。BP180系表皮基底 细胞跨膜胶原蛋白，又称XVII型胶原(COL17)或大疱性类天疱疮抗原2 (BPAG2)，其基因定位于10q24.3。 BP180分子由细胞内结构域、跨膜区和 细胞外结构域三部分组成，其中细胞外结构域又包括15个胶原编码区(分 别由15个非胶原编码区相互分隔)以及第十六非胶原编码区(NC16A)， 形成一带有柔性尾部的杆状胶原蛋白结构，连接基底细胞并向下延伸达致密 板，然后其末端向上折返至透明带。凭借这种独特的结构，BP180分子作为 "半桥粒-锚纤维复合物"的重要组成成分，在维持表皮与真皮的正常粘附功 能方面起着至关重要的作用。BP180基因的遗传学异常如缺失突变等会导致 表皮真皮粘附功能的缺陷，发生先天性大疱性表皮松解症(EB);而机体免 疫系统紊乱产生针对BP180的自身抗体，则可能通过介导免疫炎症反应而 破坏其结构和功能，发生BP等自身免疫性水疱病。BP180是BP致病性自 身抗体所针对的主要靶抗原，BP自身抗体与BP180结合继而激活补体，趋 化炎细胞在局部浸润并释放多种炎症介质，造成明显的炎症反应，破坏表皮 真皮的粘附状态，最终发生表皮下水疱。在此过程中，病理性自身抗体与 BP180结合并激活补体是至关重要的环节。本发明从这一环节入手，采用噬 菌体抗体库技术，直接以大疱性类天疱疮患者的外周血淋巴细胞为基因来 源，通过构建单链抗体库而筛选获得的具有特异性识别BP180活性的基因工 程抗体，并可在大肠杆菌中进行可溶性表达。本发明的人源性抗大疱性类天疱疮抗原BP180基因工程抗体，其基因 序列在结构上属于单链抗体(scFv)，由轻链可变区基因和重链可变区基因组成，其中轻链可变区基因为CGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCT GCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTACACTGGTGGCGGAGGGACC;重链可变区基因为CTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCTTGTGCAGCCTCTGGATTGAACCCTGGTCACCGTCTCTTCA 。利用抗体库技术制备针对BP180的基因工程单链抗体(scFv)作为治 疗BP的生物药品，利用其不具有Fc段因而不能激活补体的特性，使之靶 向BP180分子并封闭其抗原表位，竞争性抑制病理性自身抗体的结合，从 而阻断后续的补体活化等免疫炎症过程，终止对皮肤的免疫损伤而实现BP 的特异性治疗。本发明通过以下生物学实验证明本发明的功能原理、该抗体的稳定性和 含有上述抗体的该药品治疗大疱性类天疱疮的实用性实验1:用ELISA方法检测人源性抗大疱性类天疱疮抗原BP180单链 抗体与人BP180分子以及其他一些无关抗原如角蛋白、木瓜蛋白酶、牛血 清白蛋白、人IgG等的结合情况，结果发现此抗体与人BP180具有较高的结合活性，而与其他无关抗原不结合，说明该抗体的特异性、稳定性良好。实验2:用免疫荧光技术检测人源性抗大疱性类天疱疮抗原BP180单链 抗体与人皮肤冰冻切片的结合情况，结果发现此抗体结合于人皮肤的表皮-真皮交界处，形成线状荧光条带。当人皮肤先用lmol/L氯化钠裂解后，该 抗体结合得荧光条带位于表皮侧。该抗体与人皮肤其他部位以及鼠皮肤等均 不结合，说明该抗体特异性识别人皮肤表皮-真皮交界处的BP180分子。实验3:用ELISA法和免疫荧光技术观察人源性抗大疱性类天疱疮抗 原BP180单链抗体对BP自身抗体与BP180分子结合的竞争抑制作用。结 果发现，人源性抗大疱性类天疱疮抗原BP180单链抗体能够明显抑制BP患 者血清自身抗体与BP180自身抗原的结合。实验4:用正常人皮肤冰冻切片为底物，先使BP自身抗体与之结合， 然后加新鲜分离的正常人血清作为补体来源，待充分反应后用抗人补体C3 和Clq荧光抗体观察沿皮肤基底膜带的补体沉积情况；在反应体系中加入 不同浓度的人源性抗大疱性类天疱疮抗原BP180单链抗体，观察其对补体 活化的抑制作用。结果发现，人源性抗大疱性类天疱疮抗原BP180单链抗 体能够明显抑制BP自身抗体介导的补体活化作用，说明该抗体能够通过抑 制补体活化而发挥治疗BP的效果。通过大量的生物学实验证实，本发明所述的人源性抗大疱性类天疱疮抗 原BP180单链抗体具有抑制BP患者血清自身抗体与BP180自身抗原结合 的活性，具有治疗大疱性类天疱疮的作用。该抗体克服了鼠源性单克隆抗体 存在的免疫原性问题，能够保证长期疗效，具有可工业化生产、操作简单、 生产周期短、成本低、产量和纯度高、活性好、质量稳定、使用安全等优点。本发明的人源性抗大疱性类天疱疮抗原BP180单链抗体制备方法是 (1)人源性抗大疱性类天疱疮抗原BP180单链抗体基因的获得利用BP患者的淋巴细胞作为基因来源构建噬菌体抗体库，用人BP180作为抗原，从噬菌体抗体库中经过常规采用的数轮"亲和吸附——洗脱——扩增"过程，筛选具有较好结合活性的抗BP180噬菌体抗体，得到由轻链 可变区基因和重链可变区基因组成的基因序列；(2) 人源性抗大疱性类天疱疮抗原BP180单链抗体的可溶性表达-利用分子生物学手段，酶切去除噬菌体载体上的基因in，然后转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达出可溶性的人源性抗大疱性类天疱疮抗原BP180单 链抗体；(3) 人源性抗大疱性类天疱疮抗原BP180单链抗体大肠杆菌表达产 物经饱和硫酸铵盐析，充分透析后用金属鳌和亲和层析法分离纯化，得到人 源性抗大疱性类天疱疮抗原BP180单链抗体的基因工程产物。人源性抗大疱性类天疱疮抗原BP180基因工程抗体基因序列 轻链可变区基因CGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGGCGGAGGGACC;重链可变区基因CTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCTTGTGCAGCCTCTGGATTGAACCCTGGTCACCGTCTCTTCA 。
权利要求
1、一种人源性抗大疱性类天疱疮抗原BP180单链抗体，其特征在于，该人源性抗大疱性类天疱疮抗原BP180单链抗体由轻链可变区基因和重链可变区基因组成；其中轻链可变区基因由299个核苷酸组成，其核苷酸序列如下CGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTACACTGGTACCAGCAACTTCCGGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATGTATGCTAACAGCCATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCGCTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAAGCTCATTATTACTGCCAGTCCTATGACAGCAGCCTGACCGGCGAGGTATTCGGCGGAGGGACC；重链可变区基因由344个核苷酸组成，其核苷酸序列如下CTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCTTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGATTGGAGTGGGTGGCAGCTATATCGTATGACGGAAGTAGAAAATATTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCCTCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAATAGCCTGATAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGGGTTCTATTATGATTGGGGGACTTATTACGACTATTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCTTCA。
2、权利要求1所述的人源性抗大疱性类天疱疮抗原BP180单链抗体用 于作为治疗大疱性类天疱疮的药物应用。
全文摘要
本发明公开了一种人源性抗大疱性类天疱疮抗原BP180单链抗体，其基因序列在结构上属于单链抗体(scFv)，由轻链可变区基因和重链可变区基因组成。该抗体的制备方法包括以下主要步骤a.分离大疱性类天疱疮患者外周血单一核细胞，提取RNA并经过RT-PCR扩增抗体轻重链可变区基因，构建噬菌体抗体库；b.从噬菌体抗体库中筛选抗BP180噬菌体抗体；c.利用基因工程手段，获得可溶性表达的人源性抗BP180单链抗体；d.对所获抗体的结合活性、特异性、亲和力等免疫学特性进行鉴定。本发明的抗体具有封闭大疱性类天疱疮自身抗体与相应自身抗原结合的活性，能够阻断由于自身抗体的结合而激活补体所介导的炎症反应，具有治疗大疱性类天疱疮的作用。
文档编号C12N15/13GK101333255SQ20081015025
公开日2008年12月31日 申请日期2008年7月4日 优先权日2008年7月4日
发明者刘玉峰, 孙娜娜, 刚 王 申请人:中国人民解放军第四军医大学