专利名称：：一种由雷公藤细胞培养法生产雷公藤甲素和生物碱的方法
技术领域：
：本发明涉及雷公藤甲素和生物碱生产方法，特别是一种由雷公藤细胞培养法生产雷公藤甲素和生物碱的方法，该方法生产的雷公藤悬浮培养细胞和培养液中所含的雷公藤甲素和总生物碱相对较高，具有生产周期短、效率高、对环境无污染等特点，并且有利于雷公藤自然资源的保护。
背景技术：
：雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook.f.)系卫矛科雷公藤属植物，在我国很早以前就用于医学和防治各种害虫，为著名的杀虫植物之一。民间多用于防治蔬菜害虫，故有"菜药"之称。其对多种害虫有效。传统中医上可用于治疗肿胀、水肿、黄白疽、痢疾等，具有明显的抗肿瘤、抗风湿作用。雷公藤属多年生木质藤本、生长缓慢、处于野生状态，因用根入药，大量应用使资源遭到破坏。雷公藤根中活性成分含量显著高于其他部位，是主要用药部位。现己从中分离出70多种化学成分，其中雷公藤甲素又称雷公藤内酯醇，是中药雷公藤的主要有效成分之一，作为免疫抑制药物，可应用于许多自身免疫性疾病的治疗，同时它又是一种毒性成分。雷公藤生物碱具有明显的体液和细胞免疫抑制作用，也是治疗类风湿性关节炎的有效成分。在农业害虫防治中，雷公藤甲素有较好的触杀活性，雷公藤总生物碱有较好的胃毒毒杀活性和拒食活性。这些有效成分均为次生代谢产物，在雷公藤植株内含量很低，在其他植物内的含量更低，虽然可通过化学分离提取获得产品，但受气候、土壤、分布等因素及有效成分含量、原料、季节等条件的限制，生产受到一定的限制，加上人类对自然的过度开发，资源受到破坏，提取量很有限。利用微生物或化学方法至今不能合成。通过植物细胞培养生产有用的植物次生代谢物是解决植物资源问题的途径之一。雷公藤细胞培养生产有效成分在国内外也进行了大量研究。在国内，尹作鸿等人从雷公藤的茎、叶诱导出愈伤组织，并进行了组织培养，从中分离得到雷公藤甲素、雷公藤乙素等二萜内酯化合物。这些对雷公藤细胞培养的研究从不同方面进行了有益的探索，但远未达到工业化生产的水平。关于雷公藤悬浮细胞二步培养法生产雷公藤甲素和总生物碱的方法尚未见到报道。植物细胞全能性的设想于1902年提出，1948年得到了证实，这为进行植物组织培养工作奠定了理论基础，自从1956年Routine和Nickel首次申请用植物组织培养生产有用次生代谢产物的专利以来，应用细胞培养生产有用的次生物质的研究取得了很大的进展。大量研究成果证明，通过植物细胞发酵培养产生有用的次生代谢产物越来越显示出巨大的应用潜力。利用植物细胞培养生产次生代谢产物不受地理、季节变换和各种环境因素的影响；可节省土地，降低成本，縮短生产周期；可以提供一种标准化的生产过程，该过程可以连续生产，产品的质量和产量稳定，便于实行工业化生产，已是解决各种有效成分含量低的植物资源利用的主要途径。这是本申请的试验基础和理论基础。
发明内容本发明的目的在于，提供一种由雷公藤细胞培养法生产雷公藤甲素和生物碱的方法。为了实现上述任务，本发明采取如下技术解决方案得以实现一种由雷公藤悬浮细胞通过二步培养法生产雷公藤甲素和生物碱的方法，其特征在于，具体包括下列步骤步骤一，以雷公藤一年生枝条扦插形成的不定根为外植体；用洗洁精洗涤并用自来水反复清洗后，流水冲洗2小时，用含70%质量分数的酒精消毒20s，然后以无菌水冲洗4次，再用lg/LHgCh消毒4min，无菌水冲洗4次；步骤二，将不定根的幼根切成小段；接种在培养基上，放置在培养室进行愈伤组织诱导，培养基组成为MS+(0.51.0)mg/L2，4-D+(0.10.5)mg/LKT，pH值为5.8，并在培养基中加入蔗糖30g/L，培养室温度为25土1。C，保持每天12小时的光照，光照强度为10001x15001x，20天30天后形成愈伤组织；步骤三，将形成的愈伤组织置入培养基中继代培养，4045天继代一次，连续继代5代，培养基组成为6，7-V+(0.51.0)mg/L2，4-D+(0.l0.5)mg/LKT;步骤四，挑选生长快、有光泽、质地疏松，颗粒状愈伤组织，接种量为8g/L12g/L，接种在培养基上建立雷公藤悬浮细胞系，培养基的组成为NT+(0.51.0)mg/L2，4-D+(0.10.5)mg/LKT，选择250mL三角瓶，装培养基100mL，放入培养室中的摇床上震荡培养，培养条件为温度25土rC，自然光照，摇床转速120转/分钟，每2530天继代培养一次，连续继代培养5次以上，即获得雷公藤悬浮细胞系，作为供试种子；步骤五，在超净工作台中将供试种子接种于生长培养基中进行培养扩增，接种量为8g/L12g/L，接种后的培养瓶放入培养室中的摇床上，培养条件为温度25士rC，无光照，摇床转速120转/分钟，培养30天后，将其分别转至生产雷公藤甲素培养基和雷公藤生物碱培养基中；培养条件为温度25土rC，自然光照，培养20天后，收获悬浮培养细胞及培养液；上述生长培养基和生产雷公藤甲素培养基以及雷公藤生物碱培养基分别为生长培养基N^N03:1650mg/L，認03:1900mg/L，MgS04'7仏0:1233mg/L，KH2P04:1360mg/L，CaCl22H20:440mg/L，FeSO47H20:27.85mg/L，Na2EOTA2H20:37.25mg/L，MnS047H20:33.8mg/L，ZnS042H20:8.6mg/L，H3B03:6.2mg/L，Na2MoO,2H20:lmg/L，CuS045H20:0.025mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸5mg/L,盐酸硫胺素lmg/L，盐酸吡哆醇lmg/L，烟酸lmg/L，蔗糖:40mg/L，2,4-D:0.5~2.5mg/L，KT:0.1~1mg/L，其pH值为5.8;雷公藤甲素培养基腳03:825mg/L，跳:950mg/L，MgS047H20:1233mg/L，KH2P04:1360mg/L，CaCl2'2H20:147mg/L，FeS04'7H20:9.28mg/L，Na2.EOTA'2仏0:12.42mg/L，MnS04'7仏0:67.6mg/L，ZnS04'2H20:17.2mg/L，KI:3.32mg/L，CuS045H20:0.05mg/L，肌醇200mg/L，甘氨酸5mg/L，盐酸硫胺素lmg/L，盐酸吡哆醇lmg/L，烟酸0.5mg/L，生物素0.5mg/L，蔗糖20mg/L，NAA:26mg/L，6-BA:0.llmg/L，苹果炭疽病菌菌丝体100mg/L，其pH值为5.8;雷公藤生物碱培养基..(NH4)2S04:3960mg/L,KCh745mg/L，MgS04'7^0-1233mg/L，KH2P04:680mg/L，CaCl2*2H20:220mg/L，FeS04'7H20:9.28mg/L，Na2.EOTA'2H20:12.42mg/L，MnS04'7H20:67.6mg/L,ZnS04'2H20:34.4mg/L，CoS(WH20:0.05mg/L，CuS045H20:0.05mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸5mg/L，盐酸硫胺素lmg/L，盐酸吡哆醇lmg/L,生物素lmg/L，葡萄糖-20mg/L，2，4-D:0.5~2.5mg/L，KT:0.l~lmg/L，苹果炭疽病菌菌丝体200mg/L，其pH值为5.8。步骤六，将悬浮培养细胞及培养液过滤，冷冻干燥，培养液自然风干至1/3;步骤七，采用常规的方法对悬浮培养细胞和风干的培养液进行萃取，即可得到雷公藤甲素和雷公藤生物碱。利用本发明的方法生产雷公藤甲素和雷公藤生物碱，具有生产周期短、效率高、对环境无污染等特点，并且有利于雷公藤自然资源的保护。图1为本发明的制备工艺流程图以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。具体实施例方式实施例l:在实验室小试中，本实施例采取一步法生产雷公藤甲素和生物碱，具体包括下列步骤以雷公藤一年生枝条扦插形成的不定根为外植体；用洗洁精洗涤并用自来水反复清洗后，流水冲洗2小时，用含7096质量分数的酒精消毒20s，然后以无菌水冲洗4次，再用lg/LHgCl2消毒4min，无菌水冲洗4次；将不定根的幼根切成小段；接种在培养基上，放置在培养室进行愈伤组织诱导，培养基组成为MS+(0.51.0)mg/L2，4-D+(0.10.5)mg/LKT，pH值为5.8，并在培养基中加入蔗糖30g/L，培养室温度为25土rC，保持每天12小时的光照，光照强度为10001500lx，2030天后形成愈伤组织；将形成的愈伤组织置入培养基中继代培养，4045天继代一次，连续继代5代，培养基组成为6,7-V+(0.51.0)mg/L2，4-D+(0.10.5)mg/LKT;挑选生长快、有光泽、质地疏松，颗粒状愈伤组织，接种量为812g/L，接种在培养基上建立雷公藤悬浮细胞系，培养基的组成为脏+(0.51.0)mg/L2，4-D+(0.10.5)mg/LKT，选择250mL三角瓶，装培养基100mL，放入培养室中的摇床上震荡培养，培养条件为温度25+l°C，自然光照，摇床转速120转/分钟，每2530天继代培养一次，连续继代培养5次以上，即获得雷公藤悬浮细胞系，作为供试种子；按表l配制生长培养基、雷公藤甲素培养基，雷公藤生物碱培养基。表1一步法生产培养基和二步法生产培养基配方表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>生长培养基，雷公藤甲素培养基，雷公藤生物碱培养基，调节生长培养基蔗糖浓度40克/升，pH值5.8，雷公藤甲素培养基蔗糖浓度20克/升，PH值6.4，雷公藤生物碱培养基pH值5.2，分装于250ml的三角瓶中，每瓶lOOml。以雷公藤根愈伤组织建立的细胞系为种源，在超净工作台中接种于已经准备好的液体状生长培养基中进行培养扩增，接种量为8g/L12g/L，接种后的培养瓶放入培养室中的摇床上，培养条件为温度25士rc，无光照，摇床转速120转/分钟，培养30天后，将其分别转至雷公藤甲素培养基和雷公藤生物碱培养基中，培养条件，温度25士rC，自然光照，培养20天后，收获悬浮培养细胞及培养液；将悬浮培养细胞及培养液过滤，冷冻干燥，培养液自然风干至l/3;悬浮培养细胞和风干的培养液按常规的方法萃取，即可得到雷公藤甲素和雷公藤生物碱。雷公藤甲素的提取方法，如《中草药》，2005，36(7)，1065-1068记载的方法提取雷公藤甲素。雷公藤总生物碱的提取方法，如《中国中药杂志》，1995，20(3):145-147记载的方法提取总生物碱。实施例2:雷公藤甲素中试生产本实施例用70升的植物细胞培养反应器以雷公藤细胞二步法培养生产雷公藤甲素。1.摇床上三角瓶细胞种子的准备(1)按表l配制生长培养基，雷公藤甲素培养基，雷公藤生物碱培养基，调节生长培养基pH值在5.8，雷公藤甲素培养基pH值在6.4，雷公藤生物碱培养基pH值在5.2，分装于250ml的三角瓶中，每瓶100ml。(2)以实施例1的步骤四获得的雷公藤根细胞系为种源，接种于以上准备好液体生长培养基中进行培养扩增，接种密度为8g/L12g/L。接种后的培养瓶放入培养室中的摇床上，培养条件为温度25土rc，自然光照，摇床转速120转/分钟，培养25天，即可用于7升发酵罐的种子。2.70升植物细胞培养反应器的系统灭菌及培养基的准备(1)对培养反应器的管路及空气过滤器进行蒸汽消毒消毒蒸汽压力为1.2Kg/cm21.4Kg/cm2，时间20-30分钟；蒸汽消毒结束，立即用1.5Kg/cm22.0Kg/cm2的空气吹干管路及空气过滤器中的冷凝水，通常需要2030分钟，关闭管路末端阀门以保证管路中的气体正压。(2)空消对培养反应器的培养罐和补料罐进行蒸汽消毒，消毒蒸汽压力为1.2Kg/cm21.4Kg/cm2，时间30-40分钟。蒸汽消毒结束，待罐体压力降至0.5Kg/cm2时打开培养罐和补料罐的进气阀，调节罐体出气阀，以保证罐体中气体压力维持在0.3Kg/cm20.5Kg/cm2的范围内。(3)实消待培养罐和补料罐的温度降至7(TC以下后，关闭罐体出气阀，打开培养罐和补料罐的加料口，向培养罐中加入液态的生长培养基及蒸馏水至3540升，向补料罐中加入生长培养基及蒸馏水至1520升，调节生长培养基PH值在5.8范围内，关闭培养罐和补料罐的加料口及进气阀。通以0.2Kg/cm2的水蒸气，待罐体压力升至0.5Kg/cm2时打开培养罐和补料罐的出气阀，放气510分钟，随后微开二者的出气阀。待罐内压力升至1.21.3Kg/cm2时，调节水蒸气进气阀和培养罐和补料罐的出气阀以保证罐体中蒸汽压力维持在1.2Kg/cm21.3Kg/cm2的范围内，进行高温实消。2530分钟后关闭水蒸气进气阀，打开冷凝水手动阀冷却罐体，待罐体压力降至0.5Kg/cm2时打开培养罐和补料罐的出气阀，调节罐体出气阀，以保证罐体中气体压力维持在O.30.5Kg/cm2的范围内。(4)接种将无菌水平送风平台安装于细胞培养反应器的培养罐罐顶后方(接种口位于罐顶)，无菌水平送风2030分钟后，关闭培养罐出气阔，将培养罐进气阀开至最大，点燃接种口火圈，打开接种口盖，将准备好的盛有细胞种源的三角瓶瓶口火焰灭菌，之后通过燃烧着火圈的接种口将细胞种源快速倒入培养罐中，迅速盖上接种口盖并旋紧，最后调节培养罐进气阀及出气阀，保证罐体中气体压力维持在0.3Kg/cm20.5Kg/cm2的范围内。(5)生长培养及监测按本发明的培养条件，温度25士rc，无光照，系统自动控制进行培养，生长培养30天，达到生物量指数末期，即完成一步生长培养。(6)生产培养及监测以带有细胞过滤装置的排料管路排尽生长培养基，随后将补料罐中已灭过菌的雷公藤甲素培养基经无菌管路压差补入细胞培养反应器中，进行生产培养，按本发明的培养条件，温度25士rc，无光照，系统自动控制进行培养，生长培养20天，即可完成二步生产培养。(7)将悬浮培养细胞和培养液以带有细胞过滤装置的排料管路排出，悬浮培养细胞和培养液即可进行雷公藤甲素的提取。实施例3:雷公藤生物碱中试生产.-本实施例以70升的植物细胞培养反应器雷公藤细胞二步法培养生产雷公藤生物碱。在本实施例中，除雷公藤甲素培养基置换为雷公藤生物碱培养基外，其余方法均同实施例2，即可进行雷公藤生物碱的提取。上述实施例所生产的雷公藤甲素和雷公藤生物碱，按以下方式进行检测1)雷公藤甲素的测定采用高效液相色谱法，色谱条件为色谱柱C18色谱柱(4.6mmX250mm,5Mm);流动相甲醇水(45:55);流速lmL/min;检测波长218nm;2)雷公藤生物碱的测定采用紫外分光光度法测定雷公藤总生物碱的含量，将提取液用45%甲醇稀释1030倍，用分光光度计在268nm处测定吸光度值。检测结果见表2。表2各实施例雷公藤细胞及培养液中雷公藤甲素及生物碱含量<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>实验实施例1:悬浮细胞培养物及培养液(所用材料均为实施例2)对三龄小菜蛾的毒杀作用测定将雷公藤根皮粉、实施例2的悬浮细胞培养物，冷冻干燥后，分别各取lg，加入乙酸乙酯20mL超声提取40min，过滤后，挥干乙酸乙酯，提取物用丙酮稀释成l，5，10，25，50，100mg/mL的溶液；将实施例2的培养液自然风干至1/3，用1:1乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，挥干乙酸乙酯，将培养液提取物稀释成培养液和丙酮的体积比为1，5,10，20，40，80，100ml/mL。采用叶碟法测定其毒杀活性。采用VisualBasic6.0程序求出毒杀曲线。试验结果表明不同提取物对3龄小菜蛾都具有明显的毒杀作用(表3)，其中悬浮细胞培养物对3龄小菜蛾毒杀作用最强，LC5。为8.8641mg/mL，而己知的雷公藤根皮粉对3龄小菜蛾LCs。为13.1280mg/mL，为悬浮细胞培养物的67.5%。表3不同类型雷公藤样品对小菜蛾幼虫的毒杀作用(48h)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>权利要求1.一种由雷公藤细胞培养法生产雷公藤甲素和生物碱的方法，其特征在于，具体包括下列步骤步骤一，以雷公藤一年生枝条扦插形成的不定根为外植体；用洗洁精洗涤并用自来水反复清洗后，流水冲洗2小时，用含70％质量分数的酒精消毒20s，然后以无菌水冲洗4次，再用1g/LHgCl2消毒4min，无菌水冲洗4次；步骤二，将不定根的幼根切成小段；接种在培养基上，放置在培养室进行愈伤组织诱导，培养基组成为MS+(0.5～1.0)mg/L2，4-D+(0.1～0.5)mg/LKT，pH值为5.8，并在培养基中加入蔗糖30g/L，培养室温度为25±1℃，保持每天12小时的光照，光照强度为1000lx～1500lx，20～30天后形成愈伤组织；步骤三，将形成的愈伤组织置入培养基中继代培养，40～45天继代一次，连续继代5代，培养基组成为6，7-V+(0.5～1.0)mg/L2，4-D+(0.1～0.5)mg/LKT；步骤四，挑选生长快、有光泽、质地疏松，颗粒状愈伤组织，接种量为8g/L～12g/L，接种在培养基上建立雷公藤悬浮细胞系，培养基的组成为NT+(0.5～1.0)mg/L2，4-D+(0.1～0.5)mg/LKT，选择250mL三角瓶，装培养基100mL，放入培养室中的摇床上震荡培养，培养条件为温度25±1℃，自然光照，摇床转速120转/分钟，每25～30天继代培养一次，连续继代培养5次以上，即获得雷公藤悬浮细胞系，作为供试种子；步骤五，在超净工作台中将供试种子接种于生长培养基中进行培养扩增，接种量为8g/L～12g/L，接种后的培养瓶放入培养室中的摇床上，培养条件为温度25±1℃，无光照，摇床转速120转/分钟，培养30天后，将其分别转至生产雷公藤甲素培养基和雷公藤生物碱培养基中；培养条件为温度25±1℃，自然光照，培养20天后，收获悬浮培养细胞及培养液；步骤六，将悬浮培养细胞及培养液过滤，冷冻干燥，培养液自然风干至1/3；步骤七，采用常规的方法对悬浮培养细胞和风干的培养液进行萃取，即可得到雷公藤甲素和雷公藤总生物碱。2.根据权利1所要求的方法，其特征在于所述的生长培养基和生产雷公藤甲素培养基以及雷公藤生物碱培养基分别为生长培养基NH4N03:1650mg/L，認03:1900mg/L，MgS04'7H20:1233mg/L，KH2P04:1360mg/L，CaCl2'2H20:440mg/L，FeS04*7H20:27.85mg/L，Na2EOTA2H20:37.25mg/L，MnS047H20:33.8mg/L，ZnS042H20:8.6mg/L，H3B03:6.2mg/L，Na^cA2H20:lmg/L，CuS045H20:0.025mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸5mg/L，盐酸硫胺素lmg/L，盐酸吡哆醇lmg/L，烟酸lmg/L，蔗糖:40mg/L，2，4_D:0.5~2.5mg/L，KT:0.1~1mg/L，其pH值为5.8;雷公藤甲素培养基歸03:825mg/L，跳:950mg/L，MgS047H20:1233mg/L，K&POw1360mg/L，CaCl2'2仏0:147mg/L，FeSO4*7H20:9.28mg/L，Na2,EOTA'2仏0:12.42mg/L，MnS04'7^0:67.6mg/L，ZnS04'2H20:17.2mg/L，KI:3.32mg/L，CuS045H20:0.05mg/L，肌醇200mg/L，甘氨酸5mg/L，盐酸硫胺素lmg/L，盐酸吡哆醇lmg/L，烟酸0.5mg/L，生物素0.5mg/L，蔗糖20mg/L，NAA:26mg/L，6-BA:0.l~lmg/L,苹果炭疽病菌菌丝体100mg/L,其pH值为5.8;雷公藤生物碱培养基(NH4)2S04:3960mg/L，KCl:745mg/L，MgS04'7H20:1233mg/L，KH2P04:680mg/L，CaCl2'2H20:220mg/L，FeS04'7&0:9.28mg/L，Na2.EOTA'2仏0:12.42mg/L，MnSO4'7H20:67.6mg/L，ZnS04'2^0:34.4mg/L，CoS0r7H20:0.05mg/L，CuSO^5H20:0.05mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸:5mg/L，盐酸硫胺素lmg/L，盐酸吡哆醇lmg/L,生物素lmg/L,葡萄糖20mg/L，2，4-D:0.52.5mg/L，KT:0.l~lmg/L，苹果炭疽病菌菌丝体200mg/L，其pH值为5.8。全文摘要本发明公开了一种由雷公藤细胞培养法生产雷公藤甲素和雷公藤生物碱的方法，该方法以雷公藤一年生枝条扦插形成的不定根为原始材料，对外植体进行愈伤组织诱导、继代培养，建立悬浮细胞系，建立并筛选出了适合通过二步细胞培养法生产雷公藤甲素和生物碱的细胞悬浮体系及其相应的生长培养基和生产雷公藤甲素培养基以及雷公藤生物碱培养基配方。利用该方法生产雷公藤甲素和雷公藤总生物碱，具有生产周期短、效率高、对环境无污染等特点，并且有利于雷公藤自然资源的保护。文档编号C12P17/18GK101358180SQ200810150709公开日2009年2月4日申请日期2008年8月25日优先权日2008年8月25日发明者冯俊涛,兴张,琰李,王智辉,王永宏,马志卿申请人:西北农林科技大学无公害农药研究服务中心