专利名称：一种真菌菌株及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种野生稻内生的真菌菌株及其在促进植物生长和增加生物量上的用途， 属于微生物及微生物应用领域。
背景技术：
植物与周围环境生物的互作是一种普遍现象，其中植物一微生物的相互作用是重要形 式之一。有两类有益的植物一微生物共生 一类是有营养功能的，如固氮细菌或菌根真菌
(mycorrhizal fungi); —类是有防御功能的，如抑制病原菌的内生菌和附生菌。这两类 有益的共生微生物都能提高植物的适应能力。农用化学物质(化肥和农药)和"精耕细作" 的栽培方式在农业生产中发挥着重要作用。在这种栽培方式下，栽培作物中植物一微生物 这一平衡体系被打破，有益的植物一微生物共生缺乏，使得作物生产高度依赖于化肥和农 药。而化肥农药的频繁使用造成了全球环境的污染，并且污染物最终通过食物链进入人体。 因此外源应用有益微生物，从而重建生态友好的、有益的植物一微生物共生体受到人们的 极大关注，并显示了应用这种微生物制剂进行生物防治的潜力。
内生真菌(endophytic fungi)是一类在植物体内普遍存在的真菌。它的整个生活周 期或大部分阶段都在植物体内生活，通常与宿主植物形成互惠共生关系， 一方面内生真菌 从宿主植物中获取自身生长所需的养分，另一方面内生真菌可以促进植物生长、增强宿主 植物的抗生物和非生物胁迫的能力。
内生真菌具有提高宿主抗逆性的功能(Arnold et a丄，2003; Redman e￡ a人，2002)。 有研究表明内生真菌除了直接分泌抗生物质如生物碱等，也能诱导植物体产生相似的抗性 反应，如激活植物组织内的谷胱甘肽一抗坏血酸代谢途径(glutathione-ascorbate pathway)、增强细胞抗氧化能力，从而提高了植物抗真菌病害和耐盐的能力(Waller " a丄， 2005)。
有些内生真菌还具有促进植物养分吸收、促进植物生长的功能，如内生真菌通过活化 硝酸还原酶(Sherameti W a丄，2005)和磷酸酶(Malla a丄，2004)等形式促进植 物养分吸收，从而更利于植物生长；有些内生真菌能分泌生长素促进植物生长(Sirrenbergeta丄，2007);还有些内生真菌能通过抑制植物体内的乙烯信号途径来提高植物生长活 力(Barazani et s丄，2007)。
根系和叶片组织是植物体受外界生物和非生物因子胁迫最大的部位，因此根系和叶片 内生真菌对于保护植物组织免受伤害起着尤为重要的作用。植物体的根围区域是一个能量 和物质交换异常活跃的区域，植物和土壤微生物相互影响，而且植物根系被认为是一个动 态的"碳库"(carbon sink),营养物质充足，是众多生物相互竞争的部位，因此在这种 复杂的环境中植物的生存策略之一就是容纳了与之互惠共生的内生真菌。根系是内生真菌 极其丰富的部位(Vandenkoornhuyse eta义，2002)，根系内生真菌的侵染较地上部分要 广泛或多系统定殖。DSE (dark s印tate endophytes)是根系非菌根共生真菌的典型代表 (Mandyam & Jumpponen, 2005)。 DSE定殖在植物根系，有类似于菌根真菌的作用，如在 /feteroco/7J'鹏c/ a"05/ 丄ra和宿主植物大白菜的共生体系中，# c力a"o印ira从大白菜 中获取植物合成的碳水化合物蔗糖供自已生长需要，另一方面"c力se&砂ira给宿主大 白菜提供氮源(Usuki & Narisawa， 2007)。
广泛利用共生遗传资源重建有益的栽培作物-内生真菌共生体系是提高栽培作物抗逆 性的有效途径之一。典型例子是内生真菌戶J'ri/br/no印ora j'/7c/ica的应用尸.i/ 力'ca是 一种定殖在植物根系的类似于菌根真菌的内生真菌，它是从印度塔尔沙漠中的一种木本灌 木植物分离的，并可与很多植物形成共生体，接种尸.^7必ca和其培养滤液能促进植物生 长和增加生物量(Varma " a丄，1999; Verma et a丄，1998)，而且提高了大麦对真菌 病害和盐胁迫的能力(Waller " a丄，2005)。
水稻是我国最重要的粮食作物，实现水稻的稳定高产是我国可持续发展的基础。内生 真菌具有促进植物营养生长、增加生物量(产量)、并提高在逆境中的生存能力；同时内 生真菌普遍稳定存在于植物的整个组织器官中，而且受到植物体本身机械组织的保护，因 此对于土传、气传病原菌的抗性和持久能力具有优越性；并且由于野生稻与水稻的亲缘关 系较近，它们的互补性较好，因此研究发掘野生稻丰富的内生真菌资源，并利用野生稻内 生真菌，能促进栽培水稻的生长、增加生物量(产量)、并提高在逆境中的生存能力。目 前对水稻内生菌的研究多为内生固氮细菌的研究和利用，如对野生稻内生固氮细菌草螺菌 船rte邵j'rj7A/历sp. B501的研究(Elbeltagy et a义，2001)，栽培水稻内生细菌固氮 成团泛菌尸a/ to朋a^7溯er朋sYS19的研究(Duan " a丄，2007; Fengeta7. ， 2006)。 而缺乏对野生稻内生真菌在提高栽培水稻生长、增加生物量(产量)、提高其在逆境中的
4生存能力方面的研究与利用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种源于野生稻的真菌菌株，该真菌菌株能促进栽 培水稻生长，从而增加水稻的产量。
为了解决上述技术问题，本发明一种真菌菌株该菌株为稻瓶霉(户/n'a/op/wrao7加e) 真菌菌株R5-6-l，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址是 北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，保藏日2008年10月27日，保藏号CGMCC 2737。
作为本发明的真菌菌株的改进该菌株R5-6-l属于真菌界Fungi，子囊菌门 Ascomycota，粪壳纲Sordariomycetes， 巨座壳禾斗Magnaporthaceae，有丝分裂真菌巨座壳禾斗 mitosporic Magnaporthaceae,瓶霉属P/ /a/o/ /zora。该菌株R5-6-l在MEA、 PDA培养基上25。C 暗培养7天的菌落直径分别为4.5cm、 4.6 cm; MEA培养基上的气生菌丝比PDA培养基上的 稠密，波浪状气生菌丝集合形成绳索状结构；随着培养时间延长，菌落颜色逐渐变成灰色 至黑色，菌落表面成壳状，产生大量分生孢子。该菌株R5-6-l在PDA培养基上，菌丝有隔， 宽1.3-2.0pm，无色至褐色；分生孢子梗不分枝至l-2次分枝，多数单生，有时2-3个帚状生； 瓶梗着生在分生孢子梗顶端，烧瓶形，长5.6-13.8)im，最宽处宽2.5-3.1 iam，基部宽1.5-2.0 pm，颈部宽0.5-1.2 pm，淡褐色至褐色；分生孢子堆积在瓶梗顶端成粘液状，无色，单细 胞，镰刀形，强烈弯曲，长7.5-9.0 urn,最宽处宽0.8-1.2pm;具有厚垣孢子。
作为本发明的真菌菌株的进一步改进该菌株R5-6-l的内转录间隔区核糖体DNA的全 序列如SEQIDNO: l所示。
本发明还同时提供了上述真菌菌株的用途用于促进植物生长或增加生物量。 作为本发明的真菌菌株用途的改进该植物为水稻。
本发明的稻瓶霉(iVif(i/oj^ora oo;z從)真菌菌株(R5-6-l)系从我国云南版纳自然保 护区采集的野生稻根中分离得到。
本发明的稻瓶霉CGMCC 2737，具有促进水稻等植物生长和增加生物量的作用，具有 开发出新型、高效、无毒的天然微生物制剂的巨大潜力。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。
图l为本发明的稻瓶霉化iaJ叩力ors orj^se菌株R5-6-l系统发育示意图；图l中A为菌株R5-6-1在PM培养基上25 。C暗培养7天的菌落形态，B为菌株R5-6-1在 MEA培养基上25 。C暗培养7天的菌落形态，C为菌株R5-6-1在PDA培养基上25 。C暗培养25天 的菌落形态，D为菌株R5-6-l的瓶梗，E为菌株R5-6-l的分生孢子，F-G为菌株R5-6-l的分 生孢子梗及其上积聚的分生孢子；
图2为本发明的稻瓶霉尸力i^，力ora or/幼e菌株R5-6-l的扫描电镜图； 图2中A、 B、 C为菌株R5-6-1的瓶梗及其聚集着生的镰状分生孢子，D为串珠状着生 的厚垣孢子。
图3为本发明的稻瓶霉州ia7，力,s oir幼e菌株R5-6-1的系统发育图4为本发明的稻瓶霉Zfe'sJop/^ra ozy幼e菌株R5-6-1的盆栽试验水稻幼苗对比
图4中左侧5株水稻幼苗代表实验组，右侧5株水稻幼苗代表对照组； 图5为本发明的稻瓶霉P/ 2's&p力ora oxy幼e菌株R5-6-1的盆栽试验水稻幼苗干重 统计图6为本发明的稻瓶霉尸MaJop力ora ozy幼e菌株R5_6-1的菌丝定殖在水稻根部组织 中的示意图。
具体实施例方式
参照上述附图，对本发明的具体实施方式
进行详细说明。 实施例l、菌株R5-6-l的分离培养
2%麦芽汁琼脂培养基(malt extract agar, MEA):麦芽浸出粉20g，琼脂20g,蒸馏水 1000 mL。
马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar, PDA):马铃薯200g，葡萄糖20g,琼 脂20g,蒸馏水1000 mL。
在实验室中按下列条件分离培养，即可获得本发明所述的稻瓶霉。从我国云南版纳自 然保护区采集野生稻(OF"gmmJ"to)，将采集的野生稻用自来水漂洗干净，野生稻根茎 在75% (v/v)酒精溶液中消毒30秒，然后在1% (v/v)次氯酸钠溶液中消毒10分种，无 菌水漂洗3次。用无菌刀片将根切成约0.6cm长的片段，置于分别含50ng'm^氨节青霉 素和链霉素的2%麦芽汁琼脂(MEA)平皿上，25r暗培养，待菌丝长出后，将菌丝顶端 移接到PDA培养基获得纯培养。
实施例2、菌株R5-6-l的鉴定
6马铃薯葡萄糖培养液(potato dextrose broth, PDB):马铃薯200g,葡萄糖20g,蒸馏水1000 mL。
下面列举了瓶霉属(i^i"/o;^om)真菌形态鉴定和利用rDNA序列进行系统发育关系分析的相关参考文献，有关分子操作还可见于《精编分子生物学实验指南》(科学出版社，1998)等分子生物学技术指导书。
Cole, G. T., and Kendrick, B. (1973).瓶霉属分类研究，真菌学，5: 661-688，对瓶霉属真菌的形态学分类加以描述概括(Taxonomic studies of P/n'a/op/wra. Mycologia， 65:661-688.)。
Deacon, J. W.， and Scott， D. B. (1983).玉米瓶霉及其在玉米茎腐病中的作用，英国真菌学会通讯，81: 247-262，报道了瓶霉新种玉米瓶霉及其侵染玉米茎部引起的病害玉米茎腐病(_P/n'a/op/iora zez'co/a. sp. nov" and its role in the root rot-stalk rot complex of maize.Transactions of the British Mycological Society, 81: 247—262.)。
Ellis，M.B.(1976).暗色丝孢菌，CABI,国际菌物学会出版社，系统总结了常见暗色丝孢菌的分类地位禾卩禾中属描述(Dematiaceous Hyphomycetes. CAB International. MycologicalInstitute, Kew.)。
Hoog, G. S., Weenink, X. O., and Gerrits van den Ende., A.H.G. (1999).疣状瓶霉复合种的分类学研究及其二个新种，菌物学研究，43: 107-122，描述了疣状瓶霉复合种的分类研究概况，并描述了二个新禾中(Taxonomy of the尸/zz'a/op/zora vern/cora complex with thedescription of two new species. Studies in Mycology, 43: 107—122.)。
Sivasithamparam, K. (1975).大麦根系瓶霉真菌及类瓶霉真菌，澳大利亚植物学杂志，23: 193-212.，研究了大麦根系瓶霉类真菌的分布情况(户Wa/opAora and /^!'a/o如ora-likefungi occurring in the root region of wheat. Australian Journal of Botany, 23: 193-212.)。
Wang, C丄K., and Wilcox, H.E. (1985).外生菌根真菌及假菌根真菌的新种弗兰迪瓶霉，普西氯霉菌和弗蒂尼瓶霉.真菌学，77: 951-958,报道了三个瓶霉属相关的新种(Newspecies of ectendomycorrhizal and pseudomycorrhizal fungi: J"/^a/o/ /wraCTz/on'c^'ww戸wc—orw附,and i3/ V7/oce/ /za/ay^7>H7. Mycologia, 77: 951—958.)。
White, T丄，B認s, S., Lee， S., and Taylor, J. (1990).真菌基因扩增与直接测序.pp.315-322. PCR手册方法与应用，学术出版社，美国圣地亚哥，介绍了扩增真菌ITS基因的各禾中弓l物禾口扩增条件(Amplification and direct sequencing of fungal genes for phylogenetics.pp. 315—322. In: PCR protocols: A guide to methods and applications. Academic Press, SanDiego.)。
Yan, Z.H，. Rogers, S.O., and Wang, C丄K. (1995).基于形态学和ITS保守基因评价瓶霉 属真菌的分类情况，真菌学，87: 72-83，利用形态学和分子生物学结合的方法分析瓶霉属 真菌的分类地位(Assessment of户/n'a/op/wra species based on ribosomal DNA internal transcribed spacers and morphology. Mycologia， 87: 72-83.)。
AItschul， S.F.， Gish， W., Miller, W., Myers， E.W. & Lipman, D丄(1990)，基础局部比对 搜索工具，分子式物学杂志.215: 403-410，介绍了BLAST工具在分子生物学中的应用 (AItschul, S.F" Gish， W" Miller, W., Myers, E.W, & Lipman, D丄(1990) "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215:403-410.)。
Swofford, D丄.，1998. PAUP.使用简约法分析系统进化树，4.0版本，Sinauer Associates出版社，麻萨诸塞州，系统阐述了如何利用PAUP软件进行简约法分析构建系统 发生树的方法(Phylogenetic analysis using parsimony. Version 4. Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts.)。
参照上述文献的方法对内生真菌菌株R5-6-l进行形态鉴定，观察在PDA、 MEA培养 基上的菌落形态、颜色和生长速率，并采用光学显微镜和真空冷冻扫描电子显微镜观察菌 株的分生孢子梗、产孢瓶梗和分生孢子的显微形态特征。
形态鉴定结果(图l、图2)表明菌株R5-6-l在MEA、 PDA培养基上25°C暗培养7 天的菌落直径分别为4.5cm、 4.6 cm。 MEA培养基上的气生菌丝比PDA培养基上的稠密， 波浪状气生菌丝集合形成绳索状结构；随着培养时间延长，菌落颜色逐渐变成灰色至黑色， 菌落表面成壳状，产生大量分生孢子。菌株R5-6-l在PDA上，菌丝有隔，宽1.3-2.0 (im， 无色至褐色。分生孢子梗不分枝至1-2次分枝，多数单生，有时2-3个帚状生。瓶梗着生 在分生孢子梗顶端，烧瓶形，长5.6-13.8 pm，最宽处宽2.5-3.1 pm，基部宽1.5-2.0 nm， 颈部宽0.5-1.2 pm，淡褐色至褐色。分生孢子堆积在瓶梗顶端成粘液状，无色，单细胞， 镰刀形，强烈弯曲，长7.5-9.0 nm，最宽处宽0.8-1.2 nm。具有厚垣孢子。
参照文献的方法对内生真菌菌株R5-6-l进行ITS rDNA基因测序，利用BLAST程序 进行比对，利用PAUP程序进行系统发育分析。
将内生真菌菌株接种于PDA培养基上，24-26t:暗培养3-5天，再移接至PDB液体培 养基中，24-26°C、 150rpm培养4天。用滤纸滤取菌丝，吸水纸吸干水份后在液氮中研成粉末，按每管约lOOmg的量分装于 1.5mL离心管中。采用DNeasy Plant Mini Kits (QIAGEN)，按厂商的程序提取基因组DNA。 在100 mg菌体粉末中加入400 (al裂解缓冲液API和4 (il 100 mg/ml RNase A贮存液，剧烈 振荡混匀60秒，65C保温IO分钟裂解细胞，隔3分钟振荡混匀1次；裂解液中加130^il 缓冲液AP2，混匀，冰浴5分钟后14,000rpm离心5分钟；取上清液至QIAshredder离心 柱，14000 rpm离心2分钟；将滤过液移至1.5ml eppendorf管，加1.5倍沉淀缓冲液AP3/E， 用枪头吸打混匀；取650 pi反应液至DNeasy微型柱，11000 rpm离心1分钟，弃去收集管 中的滤液；将余下的反应液移至DNeasy微型柱,11000rpm离心1分钟，弃去收集管和滤液； 将DNeasy微型柱置于另一收集管，加500 pl缓冲液AW至DNeasy微型柱,11000 rpm离心 l分钟，弃去收集管中的滤液；将DNeasy微型柱重新置于收集管中，力[]500 ^缓冲液AW 至DNeasy微型柱,14000 rpm离心2分钟，弃去收集管和滤液；将DNeasy微型柱置于另一 1.5 ml eppendorf管上，加100 pi预热(65°C)的缓冲液AE至DNeasy膜上,室温静止5分 钟，11000 rpm离心l分钟，收集滤液即为基因组DNA。 -20°。保存备用。取5 ^样品在 1.4% Agarose胶上电泳，检测DNA的分子大小，同时取1 (il稀释50倍，测定OD260/OD280, 检测DNA含量及质量。
ITS rDNA基因序列的扩增采用通用引物ITS 1 (5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCGG-3') 和ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')， PCR体系DNA模板(100ng/pl) l.(Hil， 10xPCR缓冲液(含25腿ol/L MgC12)5.0pl， dNTP(5mmo1 / L)1.0^d,引物(50ng/ml)各0.5 pl， Taq DNA聚合酶(2U/nI )ljal，加水补足50pl，混匀后在MJ Research公司的Minicycler PTC-150型PCR仪上进行PCR反应，PCR反应条件94 °C 3min; 94°C 40s， 55°C 50s， 72。C60s， 30个循环；72°C 10min。 PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，PCR扩增产物 用QIAGEN公司的QIAquick PCR纯化试剂盒纯化在PCR反应产物中加5倍体积的PB 缓冲液，涡旋混匀；将上述混合液转至QIAquick微型柱中，离心柱置于2mL收集管上， 13000rpm离心30-60s;弃去收集管中的滤液，将微型柱重新放回收集管中；加0.75mLPE 缓冲液至微型柱中，13000rpm离心30-60s;弃去收集管中的滤液，将微型柱重新放回收集 管中，14000 rpm离心lmin;将微型柱置于1.5mL离心管上，加30pL EB缓冲液或水，静 止lmin后13000 rpm离心lmin，收集滤液即为纯化的PCR产物。纯化后的PCR产物-20。C 保存备用。取2pL滤液在琼脂糖凝胶上电泳，估算浓度。
纯化后的PCR产物委托上海英骏生物技术有限公司测序，测序用美国ABI3730测序
9仪(ABI 3730 sequencer, Applied Biosystems, USA)，测序引物同上述的ITS1和ITS4。
获得的ITS rDNA基因序列在GenBank上的登录号EU636699,并用该序列在GenBank
上进行BLAST搜索，BLAST结果表明菌株菌株R5-6-l属于瓶霉属。
基于BLAST结果，用软件Clustal X 1.81将菌株R5-6-l的序列与GenBank上瓶霉属
其它已知种的序列进行比对，然后进行系统发育分析。系统发生树的构建由软件PAUP*
4.0bl0完成，应用最大简约法中的启发式搜寻法进行系统发生分析，具体设置如下用逐
步添加法生成树，添加随机序列，重复1000次；树-对分-重接法作为分枝交换运算法则； 序列中单个缺口作为第五种碱基对待，插入的序列若与其他序列不同源则被删除；应用自
举分析评估树的可靠性，设置自举值为1000个重复。系统发育分析(图3)表明菌株R5-6-l 与已报道的瓶霉属其它种不同，属于瓶霉属新种，将其命名为稻瓶霉(尸W"/op/wraoo;^e)。 ITS rDNA只是菌株R5-6-l的部份基因序列，但本发明所述的菌株R5-6-l并不局限于 上述部分基因序列。
该真菌菌株R5-6-l为稻瓶霉(i^/a/印/wra w^z加)，保藏单位中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心，保藏日2008年10月27日，保藏号CGMCC2737。
实施例3、菌株R5-6-l促进水稻生长的盆栽试验及菌株在根部定殖的显微镜观察 根据Newshani, K. K. (1999).暗色有隔内生菌 一禾生瓶霉对鼠茅草的促生作用，新 植物学家，144: 517-524，报道了一种暗色有隔内生真菌未生瓶霉侵染鼠茅草根系，并促 进其生长的作用(Phialophora graminicola, a dark septate ungus， is a beneficial associate of the grass Vulpia ciliata ssp. ambigua. New phytologist, 144: 517-524.)。
MS基本培养基硝酸钾(KN03) 1900 mg/L，硝酸铵(NH4N03) 1650 mg/L，硫酸镁 (MgS04'7H20 ) 3 70 mg/L，磷酸二氢钾(KH2P04) 170 mg/L，氯化铐(CaCl2.2H20) 440 mg/L, 硫酸锰(MnSCV4H20 ) 22 . 3mg/L，硫酸锌(ZnS04-4H20) 8. 6mg/L，硼酸(H3B03) 6. 2 mg/L ， 碘化钾(KI) 0. 83 mg/L，钼酸钠(Na2Mo04'2H20) 0. 25 mg/L，硫酸铜(CuS04-5H20) 0. 025 mg/L， 氯化钴(CoCl2.6H20) 0.025 mg/L，硫酸亚铁(FeS04-7H20) 27. 8 mg/L， Na2'EDTA 37. 3 mg/L, 甘氨酸2.0mg/L，盐酸硫胺素(Thiamine HC1) 0. 1 mg/L，盐酸吡咳醇(Pyridoxine HC1) 0.5 mg/L,烟酸(Nicotinic acid) 0.5 mg/L，肌醇(Inositol) 100 mg/L。
水稻种子(秀水128)去壳，在75% (v/v)酒精溶液中消毒3分种，然后在1% (v/v)次氯酸钠溶液中消毒3分种，无菌水漂洗10次。置于含1/10浓度的PDA培养基(即马铃 薯20g,葡萄糖2g,琼脂20g,蒸馏水1000 mL组成)的平皿上，24°C、光照(16h/8h， 即16小时光照，8小时无光照)下催芽5天，将每个无菌水稻幼苗置于直径3.5 cm、高 30cm加40mL半量MS培养基的试管中，在植物生长箱中24°C、光照(16h/8h)、湿度80% 条件下培养。半量MS培养基是在每lOOOmL的1/2浓度的MS基本培养基的基础上，加入 30g蔗糖和5g琼脂组成。
待水稻幼苗长出三片真叶(苗高约15cm)后，随机选择5颗上述水稻幼苗作为实验组、 5颗上述水稻幼苗作为对照组。在每个实验组的水稻幼苗根部接种2个直径5mm的稻瓶霉 R5-6-1菌丝块。将实验组和对照组在相同的盆栽培养条件下共培养1个月，盆栽培养条件 为植物生长箱中24。C、光照(16h/8h)、湿度80%。
肉眼观察实验组(即接种处理的)和对照组的水稻幼苗的生长情况，并测定水稻幼苗 的干重，显微镜观察稻瓶霉菌丝在水稻幼苗根系中的定殖情况。按参考文献[Newsham, 1999] 方法进行，根系用无菌水漂洗三次，在4。/。(w/v) K0H浓度中37。C浸泡4天，再用无菌水漂 洗三次，然后在3% (v/v) HA溶液中漂白3分钟，用2。/。(v/v) HC1淋洗45分钟，最后用 0. 05%(w/v)苔酚蓝60°C下染色50分钟，再用无菌水漂洗后显微观察。
盆栽试验结果(如图4所示)表明，稻瓶霉R5-6-l菌株接种水稻后，水稻长势旺，苗 壮，根系颜色呈褐色，水稻干重显著增加(如图5所示)，具体结果如表1所示；显微观 察表明稻瓶霉菌丝定殖在水稻根部细胞内和细胞间隙(如图6所示)。表明稻瓶霉R5-6-l 菌株能显著促进水稻生长和增加生物量。
表l 、水稻(秀水128)的对比数据
处理干重(克)重复l重复2重复3重复4重复5平均值*标准偏差
实验组(接种 R5-6-l)0. 1060. 1080. 1200. 0980. 0860.10360. 0126
对照组0. 0590. 0700. 0620. 0690. 0750. 0670 b0.0064
*小写字母代表差异显著性？<0.01
实施例4、将秀水128水稻的种子分别改成浙粳22和嘉花1号水稻的种子，其余内容同 实施例3，盆栽试验结果表明，稻瓶霉R5-6-l菌株接种水稻后，水稻长势旺，苗壮，根系颜 色呈褐色，水稻干重显著增加，具体结果分别如表2和表3所示。表2 、水稻(浙粳22)的对比数据
处理1 识重复l重复2重复3重复4重复5平均值*标准偏差
实验组(接种 R5-6-l)0. 1010. 0960. 1050. 0890. 1170. 10160. 0105
对照组0. 0610. 0760. 0640. 0680. 0720. 0682 b0. 0060
^J、写字母代表差异显著性P0.01 表3 、水稻(嘉花l号)的对比数据处理干重(克)重复l重复2重复3重复4重复5平均值*标准偏差
实验组(接种 R5-6-1)0.0940. 1050. 1180. 0890. 1100. 1032 a0.0118
对照组0. 0710. 0690. 0780. 0620. 0650. 0690 b0. 0061
"J、写字母代表差异显著性P0.01
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明 不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直 接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
12序列表
SEQIDNO: 1
aacctgcgga gggatcatta aagagttgaa aaactccaac ccctgtgaac cttaccttta 60
ctgttgcttc ggcggacgac ggcccttcgt ggcccgaggc cgccggaggt tccaaactct 120
aaatctttag tgtatctctg aggaaaataa accaataatt aaaactttca acaacggatc 240
tcttggttct ggcatcgatg aagaacgcag cgaaatgcga taagtaatgt gaattgcaga 300
attcagtgaa tcatcgaatc tttgaacgca cattgcgccc gccggtattc cggcgggcat 360
gcctgttcga gcgtcatttc accactcaag cccagcttgg tgttggggca cccggccgcc 420
cggcggtcgg ggcccccaag tacatcggcg gtetcgctag gaccctgagc gcagtaactc 480
gcggtaaaac gcgcctcgct cggaagttcc cagcgggctt ccagccgcta aaccccccct 540 aattttctta ggttgacctc ggatcaggta ggaatacccg ctgaacttaa gcatatcaat 600
权利要求
1、一种真菌菌株，其特征在于该菌株为稻瓶霉(Phialophora oryzae)真菌菌株R5-6-1，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日2008年10月27日，保藏号CGMCC2737。
2、 根据权利要求l所述的真菌菌株，其特征是所述菌株R5-6-l属于真菌界Fimgi，子囊 菌门Ascomycota,粪壳纲Sordariomycetes，巨座壳科Magn叩orthaceae，有丝分裂真菌巨座壳科 mitosporic Magnaporthaceae，并瓦霉属她油/ Aora。
3、 根据权利要求2所述的真菌菌株，其特征是所述菌株R5-6-l在MEA、 PDA培养基上 25。C暗培养7天的菌落直径分别为4.5 cm、 4.6 cm; MEA培养基上的气生菌丝比PDA培养基上 的稠密，波浪状气生菌丝集合形成绳索状结构；随着培养时间延长，菌落颜色逐渐变成灰色 至黑色，菌落表面成壳状，产生大量分生孢子；在PDA培养基上，菌丝有隔，宽1.3-2.0 pm，无色至褐色；分生孢子梗不分枝至l-2次分 枝，多数单生，有时2-3个帚状生；瓶梗着生在分生孢子梗顶端，烧瓶形，长5.6-13.8pm，最 宽处宽2.5-3.1 pm，基部宽1.5-2.0pm，颈部宽0.5-1.2 pm，淡褐色至褐色；分生孢子堆积在瓶 梗顶端成粘液状，无色，单细胞，镰刀形，强烈弯曲，长7.5-9.0 最宽处宽0.8-L2 具有厚垣孢子。
4、 根据权利要求l、 2或3所述的真菌菌株，其特征是所述菌株R5-6-l的内转录间隔区核 糖体DNA的全序列如SEQ ID NO: l所示。
5、 如权利要求1 4中任意一种真菌菌株的用途，其特征是用于促进植物生长或增加生 物量。
6、 根据权利要求5所述的真菌菌株的用途，其特征是所述植物为水稻。
全文摘要
本发明公开了一种真菌菌株该菌株为稻瓶霉(Phialophora oryzae)真菌菌株R5-6-1，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日2008年10月27日，保藏号CGMCC 2737。该真菌菌株能用于促进植物(特别是水稻)的生长和增加其生物量。
文档编号C12N1/14GK101486970SQ20081016253
公开日2009年7月22日 申请日期2008年12月1日 优先权日2008年12月1日
发明者林福呈, 章初龙, 袁志林 申请人:浙江大学