专利名称：：酶法检测糖化血红蛋白的试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物制剂
技术领域：
，具体说涉及一种酶法检测糖化血红蛋白的试剂盒。
背景技术：
：血液中的糖化血红蛋白(糖化Hb)浓度近年来被用作糖尿病的诊断和治疗的重要指标。目前，糖化血红蛋白的测定可采用离子交换层析法、高效液相色谱法、亲和层析法、放射免疫法、酶免疫法和胶乳免疫凝集法等。但这些方法或者需要专用仪器、价格昂贵，或者检测时间长、测量精度差。最近流行的酶法检测，利用氧化还原反应，不需要特殊的测定仪器，操作简便易行，精度高，时间短，因此广泛应用于生化分析和临床检査。糖化血红蛋白的酶法检测依照以下方法进行。首先，将含有糖化血红蛋白的样品用蛋白水解酶处理，使得糖化蛋白质分解i较小的糖化肽片段和糖化氨基酸；然后，将果糖缬氨酸氧化酶(FVO)作用于该糖化蛋白质的分解物，进行氧化还原反应，释放出过氧化氢；过氧化氢在过氧化物酶的作用下与显色基质发生反应，使得显色基质显色；通过测定显色基质的显色量，可以确定过氧化氢的量，从而可知样品中糖化蛋白质的量。以前用于消化糖化血红蛋白的蛋白水解酶为碱性蛋白酶，包括金属蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、枯草杆菌蛋白酶及氨基肽酶等，酶解效果有待提高，且酶解反应中，除糖化血红蛋白以外，其它糖化蛋白质和糖化肽也能被水解，影响了检测结果的精确度。
发明内容本发明的目的在于克服上述不足，提供一种酶法检测糖化血红蛋白的试剂盒，克服了以往试剂盒只能在碱性条件下酶解的弊端，酶解效果好于碱性蛋白酶，且用量仅为碱性蛋白酶的十分之一至五十分之一，成本更低；测量结果精确、符合糖化血红蛋白临床检测要求快速、大批量、经济的特点，有利于临床大规模应用。本发明的酶法检测糖化血红蛋白的试剂盒，其是由溶血缓冲液、试剂Rla、试剂Rlb、中和缓冲液和试剂2组成的，其中溶血缓冲液10-1000mmol/LN-环乙基-2氨基乙烷磺酸，10-1000mmol/L吗啉代丙烷磺酸，1-100g/L聚氧化乙烯十二垸基醚；试剂Rla:10-1000kU/L猪胃蛋白酶，0.1-10腿ol/L2-(碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯)-5-(2,4-二磺苯基)-211四唑钠盐，0.0001-0.1mol/LHCl;试剂Rlb:0.1-10mmol/L吗啉代乙基磺酸，0.5-50mmol/LCaCl2;中和缓冲液0.0001-0.1mol/LNaOH;试剂2:1-1000kU/L果糖缬氨酸氧化酶，30-600kU/L过氧化物酶，0.01-0.5mmol/LN-(羧甲基氨羰基)-4,4双偶(二甲胺)-二苯胺钠■i^fj!，10-1000mmol/LTris隱HCl。本发明试剂盒在糖化血红蛋白的酶法检测中应用了猪胃蛋白酶。猪胃蛋白酶是一类酸性蛋白酶，其最适反应pH值为1.5-3.5。当用于血红蛋白的酶解时，猪胃蛋白酶的酶解效果好于金属蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶等碱性蛋白酶，且用量仅为碱性蛋白酶的十分之一至五十分之一。本发明开发的新型试剂盒初始反应缓冲液为酸性环境，pH值为2.0左右，后经中和缓冲液中和，达到中性环境附近，便于终止蛋白水解反应，进行下一步的氧化还原反应。在初始反应缓冲液中，可用盐酸或磷酸营造酸性环境，首选盐酸，其反应速度快且反应完全。中和缓冲液可采用氢氧化钠中和初始反应缓冲液中过量的盐酸，使反应环境pH值约为7.0-8.5。此后果糖缬氨酸氧化酶在该偏碱性环境下(pH7.0-8.5)作用于样品，产生过氧化氢。过氧化氢在过氧化物酶催化下使显色基质显色，通过测定显色基质的显色量，最终确定样品中糖化血红蛋白的量。'该试剂盒优选采用高活性果糖缬氨酸氧化酶FVO-m-21，其含有SEQID.No.1所示核苷酸序列和SEQID.No.2所示氨基酸序列。其制备方法步骤如下(1)以Corynebacteriumsp.2-4-1的FVO基因编码序列为模板，进行易错PCR扩增，建立果糖缬氨酸氧化酶的突变文库；(2)将突变文库转入大肠杆菌，对其基因进行克隆、重组转化和表达；(3)利用醌法测定酶活性，筛选出高活性果糖缬氨酸氧化酶。棒状杆菌属Corynebacteriumsp.2-4-1菌株含有果糖基缬氨酸氧化酶(FVO)的编码基因。本发明基于FVO的基因编码序列，设计两条FVD基因的易错PCR引物，上游引物序列为5，-TTGTTCGGATCCATGTCCTCCACCGCTAC-3，，下游引物序列为5'-TTGTTCAAGCTTCTAGGAGAACCGGCCCG-3，。以FVO的基因编码序列作为模板，进行易错PCR扩增，经扩增35个循环后，PCR产物纯化回收，与原核表达载体pMD-18TVector连接，转化入大肠杆菌XL1-Red中，涂布LB平板，收集含有插入片段的克隆，组成突变体库。提取突变体库中的质粒DNA，酶切，回收目的片段，连接入载体pGEX-4T-lm，转化入BL-21菌株，涂布于含有IPTG、果糖缬氨酸和1^(羧甲基氨基羰基)-4，4-二(甲基氨基)-联苯胺[DA-64]的LB平板，由于大肠杆菌自身含有过氧化物酶，故37。C培养12-24小时后，可见明显变色现象。挑取变色快和变色圈大的克隆进行液体培养基培养。将初步筛选出的克隆在25'C液体培养基中培养48小时，诱导表达，裂解细菌，利用醌法测定酶活性，最终得到一株酶活性约为普通果糖缬氨酸氧化酶活性6倍的高活性菌株，其所携带的FVO突变命名为FVO-m-21。通过测序分析发现，该突变克隆中发生五个碱基点突变，分别是碱基序列中57位'C—T、374位T—C、534位G—A、914位C—A和1056位G—C，共引起了两个氨基酸突变，分别是氨基酸序列中125位He—Thr和305位Ala—Glu。作为进一步优选，本发明试剂盒的组成如下溶血缓冲液10-800mmol/LN-环乙基-2氨基乙烷磺酸，10-900mmol/L吗啉代丙烷磺酸，1-100g/L聚氧化乙烯十二垸基醚；试剂Rla:10-700kU/L猪胃蛋白酶，0.1-10mmol/L2-(碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯)-5-(2，4-二磺苯基)-2H四唑钠盐，0.0001-0.1mol/LHCl;试剂Rlb:2-8mmol/L吗啉代乙基磺酸，0.5-40腿ol/LCaCl2;中和缓冲液0.0001-0.1moI/LNaOH;试剂2:20-80kU/LFVO-m-21，30-500kU/L过氧化物酶，0.01-0.5mmol/LN-(羧甲基氨羰基)-4,4双偶(二甲胺)-二苯胺钠10-800腿ol/LTris-HCl。作为最优选，本发明试剂盒的组成如下溶血缓冲液600mmol/LN-环乙基-2氨基乙烷磺酸，450mmol/L吗啉代丙烷磺酸，50g/L聚氧化乙烯十二烷基醚；试剂Rla:500kU/L猪胃蛋白酶，3mmol/L2-(碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯)-5-(2，4-二磺苯基)-2H四唑钠盐，0.005mol/LHCl;试剂Rlb:6mmol/L吗啉代乙基磺酸，20腿ol/LCaCl2;中和缓冲液0.03mol/LNaOH;试剂2:50kU/LFVO-m-21，250kU/L过氧化物酶，O.lmmol/LN-(羧甲基氨羰基)-4，4双偶(二甲胺)-二苯胺钠盐，600腿ol/LTris-HCl。本发明试剂盒采用酸性猪胃蛋白酶，克服了以往试剂盒只能在碱性条件下酶解的弊端，酶解效果好于碱性蛋白酶，且用量仅为碱性蛋白酶的十分之一至五十分之一，成本更低；检测血红蛋白时，除糖化血红蛋白以外，其它糖化蛋白质和糖化肽都难以被水解，果糖缬氨酸氧化酶也难以作用于上述其它糖化蛋白质等，因此可以只测定糖化血红蛋白，使得结果更精确。另外，试剂盒中的高活性酶FVO-m-21可更快速地与糖化肽片段或糖化氨基酸反应，生成过氧化氢，在相同底物量的反应体系中，所需的酶量也更少，可降低生产成本，縮短反应时间，便于更快速的进行大批量样品检测。具体实施例方式下面结合具体实施例进一步阐述本发明，但并不仅限于下述实施例。实施例l:高活力果糖缬氨酸氧化酶FVO-m-21的获得。一、以Corynebacteriumsp.2-4-1的FVO基因编码序列为模板，进行易错PCR扩增。1.引物序列正向引物5，-TTGTTCGGATCCATGTCCTC*CACCGCTAC-3，反向引物5，-TTGTTCAAGCTTCTAGGAGAACCGGCCCG-3，2.易错PCR反应体系和反应条件PCR反应体系100tlL体系中含有10mMTris-HClpH8.30，50mMKCl，6.5mMMgCl2，0.15mMMnCl2，0.2mMdGTP/iiATP，0.8mMdTTP/dCTP，2.2吗SSBProtein,0.5正向/反向引物，10ng模板DNA2.5单位TaqDNA聚合酶。PCR反应条件94°C5min;94'C30sec，55°C30sec,72。C2min，35个循环；72°C10min;4°Cforever。3.易错PCR产物取3pL于P/。的琼脂糖凝胶电泳，可见lkb左右有产物条带。将易错PCR产物用纯化回收试剂盒纯化回收，与pMD-18TVector连接，转化入大肠杆菌XLl-Red中，涂布Amp抗性LB平板，可获得Corynebacteriumsp.2-4-1的FVO基因的突变体库。二、突变体菌株的初筛提取突变体库中的质粒DNA，用BamHI和HindIII双酶切，回收1kb左右的目的片段，载体pGEX-4T-lm同样用BamHI和HindIII双酶切，回收，二者4'C连接过夜，转化入BL-21菌株，涂布于含有IPTG、果糖缬氨酸和N-(羧甲基氨基羰基)-4,4-二(甲基氨基)-联苯胺[DA-64]的LB平板，37'C培养12-24小时后，可见明显变色现象。挑取变色快和变色圈大的克隆进行液体培养基培养，共挑取克隆48个。三、突变体酶活性的醌法检测1.在诱导表达4小时后，收集菌液，测量并且记录细胞培养物的OD600值。2.制备检测酶活的细菌裂解液。在374B-PERtm细菌蛋白抽提试剂(Pierceproduct78248)中重新悬浮细胞，再加入50uL蛋白酶和磷酸化酶抑制剂以及细菌细胞提取物(Sigma产品P8465)，1uL34mg/mL的氯霉素(用甲醇配制)。快速涡旋振荡一分钟。在冰上放置5min。离心1min后置于冰上。3.用Bradford法测定蛋白含量。4.取50nL上述细菌裂解液加到醌法反应混合液中，37'C温浴1-3min,测量555nm处吸光值。反应混合液成分为lOOmM磷酸钾缓冲液(pH8.0)，1purpurogallinunit/ml过氧化物酶，0.45mM4-氨基安替吡啉，0.5"mMTOOS(N-^基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺)，5.0mM果糖缬氨酸，总体积为3mL。其中，一个酶活力单位定义为在37'C每分钟可催化产生0.5pM醌染料。实际酶活力按每分钟每mg蛋白质所形成的nmol产物来测定。四、高活性突变FVO的序列测定通过酶活力测定，筛选出活力约为普通果糖缬氨酸氧化酶活力6倍的高活突变。提取质粒DNA，测序发现该突变序列如SEQID.No.1所示。其中发生突变的位点，为57位C—T、374位T—C、534位G—A、914位C—A和1056位G—C。对应的氨基酸序列如SEQID.No.2所示。其中发生突变的氨基酸位点，共有两个氨基酸突变，分别是氨基酸序列中125位lie—Thr和305位Ala—Glu。实施例2.以蒸馏水为溶剂，按照常规配制试剂方法配制，如表1所示。实施例3应用本发明试剂盒测定糖基化血红蛋白标准液。从患者采集全血(患者数16名)，红细胞自然沉降回收，取20uL沉降的红细胞部分，向其中加入上述溶血缓冲液500uL。将得到的30uL溶血试样与40uL试剂Rla和40ixL试剂Rlb混合，于37'C温浴3分钟。加入40nL中和缓冲液，混匀，读取吸光度A1。再向反应体系中加入20uL试剂2，于37'C温浴2分钟，读取吸光度A2。=A2—A1。。测定时可选择751nm和571nm处的吸光值。其中，Hb浓度可由波长751nm处的吸光度求出，HbAlc浓度可由波长571nm处的吸光度求出。计算公式，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>表l酶法检测糖化血红蛋白的试剂盒各配方<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>实施例4采用金属蛋白酶的酶法测定糖化血红蛋白的试剂盒配方。与实施例2不同处在于试剂Rla的成分和不应用中和缓冲液。其它处理方法相同。试剂Rla为100-10000kU/L金属蛋白酶0.1-10讓ol/L2-(碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯)-5-(2，4-二磺苯基)-2H四唑钠盐。表2不同方法糖化血红蛋白测定值比较<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表2表示为本发明酶法检测糖化血红蛋白的试剂盒与用金属蛋白酶检测糖化血红蛋白的试剂盒测量精度对比表，还包括采用HPLC法测定的标准参考值。以HPLC法测定值为横坐标，本发明酶法检测糖化血红蛋白试剂盒和金属蛋白酶检测糖化血红蛋白的试剂盒测量值为纵坐标，拟合直线，得到实施例的相关式为"y=0.9955x+2.0727，R2=0.9987;"y=1.0227x+1.8455，R2=0.9958"。由此可知本发明试剂盒的测量精度与HPLC法测定的标准参考值几乎一致，而且比普通金属蛋白酶的糖化蛋白检测试剂要高，因此本发明试剂盒可以以优良的精度测定糖化血红蛋白。以上实施例是对专利的说明和进一步解释，而不是对本发明的限制，在本发明的精神和权利保护范围内所做的任何修改，都落入本发明的保护范围。SEQUENCELISTING<110>宁波美康生物科技有限公司<120>酶法检测糖化血红蛋白的试剂盒<130>003<160>2<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>1119<212>DNA<213>Corynebacteriumsp.<220><221>CDS<222>(1)..(1119)<400>1atgtectecaccgetaccaagcatgtcgccgtcattggcggcggcate48MetSerSerThrAlaThrLysHisValAlaVallieGlyGlyGlylie151015ctgggcgtttecaccgccgtccacctgetccgccaaggcgcaacagtc96LeuGlyValSerThrAlaValHisLeuLeuArgGinGlyAlaThrVal202530accetcttgaccgaacagggcetcgccage'gaagccacgggceggtec144ThrLeuLeuThrGluGinGlyLeuAlaSerGluAlaThrGlyArgSer354045ttgtectggetcaactecgccggggaacgctecactccetatcaccag192LeuSerTipLeuAsnSerAlaGlyGluArgSerThrProTyrHisGin505560ctgcgcategetggcgttgaceggtaccgcacgctgttcgccgccgat240LeuArglieAlaGlyValAspArgTyrArgThrLeuPheAlaAlaAsp65707580cccageegggaatggttgcagttcgggggcgggetcatgtggaacgcc288ProSerArgGluTrpLeuGinPheGlyGlyGlyLeuMetTrpAsnAla859095gccggggaaagtgaggtcaccaaagcceggcacgcctacgagaagtec336AlaGlyGluSerGluValThrLysAlaArgHisAlaTyrGluLysSer100105110ateggctacgacteccaactgctggcccctgaagaaaccggcteggtc384lieGlyTyrAspSerGinLeuLeuAlaProGluGluThrGlySerVal115120125acgccaggcategacgccagtgccgtcccggagaacgcaatettcaat432ThrProGlylieAspAlaSerAlaValProGluAsnAlaliePheAsn130135140cctggcgagggctgggtcagectgccggacctggtgaacttcctgatg480ProGlyGluGlyTrpValSerLeuProAspLeuValAsnPheLeuMet145150155160gaggaattccacgccctgggcggccagttggtcetcaacgcaggtaaa528GluGluPheHisAlaLeuGlyGlyGinLeuValLeuAsnAlaGlyLys165170175gccteagtgatggtcgagggcggcegggetaccgcggtcgaaaccgcc576AlaSerValMetValGluGlyGlyArgAlaThrAlaValGluThrAla180185190accggtgaaacctaccccgcggacgccgttetcgtagcctgcggtgcc624ThrGlyGluThrTyrProAlaAspAlaValLeuValAlaCysGlyAla195200205gcgacgccggccgtcgtaaaaccgetcggggtcgagataccgaacggt672AlaThrProAlaValValLysProLeuGlyValGlulieProAsnGly210215220tecccggtctecatgctggttgttaccaagcecgtggagcaccaggtc720SerProValSerMetLeuValValThrLysProValGluHisGinVal225230235240gcggcagtgatgaatacgccgcgcgetgccgtgcgacccaatccgggt768AlaAlaValMetAsnThrProArgAlaAlaValArgProAsnProGly245250255<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>GlyArgPheSer370<210>2<211>372<212>PRT<213>Corynebacteriumsp.<400>2MetSerSerThrAlaThrLysHisValAlaValHeGlyGlyGlylie151015LeuGlyValSerThrAlaValHisLeuLeuArgGinGlyAlaThrVal202530ThrLeuLeuThrGluGinGlyLeuAlaSerGluAlaThrGlyArgSer354045LeuSerTrpLeuAsnSerAlaGlyGluArgSerThrProTyrHisGin505560LeuArglieAlaGlyValAspArgTyrArgThrLeuPheAlaAlaAsp65707580ProSerArgGluTrpLeuGinPheGlyGlyGlyLeuMetTrpAsnAla859095AlaGlyGluSerGluValThrLysAlaArgHisAlaTyrGluLysSer100105110lieGlyTyrAspSerGinLeuLeuAlaProGluGluThrGlySerVal115120125ThrProGlylieAspAlaSerAlaValProGluAsnAlaliePheAsn130135140ProGlyGluGlyTrpValSerLeuProAspLeuValAsnPheLeuMet145150155160GluGluPheHisAlaLeuGlyGlyGinLeuValLeuAsnAlaGlyLys165170175AlaSerValMetValGluGlyGlyArgAlaThrAlaValGluThrAla180185190ThrGlyGluThrTyrProAlaAspAlaValLeuValAlaCysGlyAla195200205AlaThrProAlaValValLysProLeuGlyValGlulieProAsnGly210215220SerProValSerMetLeuValValThrLysProValGluHisGinVal225230235240AlaAlaValMetAsnThrProArgAlaAlaValArgProAsnProGly245250255AsnThrPheAlaLeuAspHisAspTrpTyrGluGlyHislieThrGlu260265270HisAlaAspGlySerPheThrlieProAspAspValValGinGluLeu275280285AlaAspGluSerSerLysLeuHeAlaGlyAsnProGluLeuLysPro290295300GluSerTrpLyslieGlyTyrLysProIlePro@lyAsp<%GluPro305310315320ValPheGlyGluLeuGlyArgValProGlyCysPheValAlaPheThr325330335HisSerGlyAlaThrLeuGlyLeulieAlaGlyGluLeuLeuSerGly340345350GinHeLeuThrGlyAspLysHisProMetPheAlaThrPheArgPro355360365GlyArgPheSer370权利要求1、一种酶法检测糖化血红蛋白的试剂盒，其特征在于该试剂盒是由溶血缓冲液、试剂R1a、试剂R1b、中和缓冲液和试剂2组成的，其中溶血缓冲液10-1000mmol/LN-环乙基-2氨基乙烷磺酸，10-1000mmol/L吗啉代丙烷磺酸，1-100g/L聚氧化乙烯十二烷基醚；试剂R1a10-1000kU/L猪胃蛋白酶，0.1-10mmol/L2-(碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯)-5-(2，4-二磺苯基)-2H四唑钠盐，0.0001-0.1mol/LHCl；试剂R1b0.1-10mmol/L吗啉代乙基磺酸，0.5-50mmol/LCaCl2；中和缓冲液0.0001-0.1mol/LNaOH；试剂21-1000kU/L果糖缬氨酸氧化酶，30-600kU/L过氧化物酶，0.01-0.5mmol/LN-(羧甲基氨羰基)-4，4双偶(二甲胺)-二苯胺钠盐，10-1000mmol/LTris-HCl。全文摘要本发明涉及一种酶法检测糖化血红蛋白的试剂盒，成分为溶血缓冲液10-1000mmol/LN-环乙基-2氨基乙烷磺酸，10-1000mmol/L吗啉代丙烷磺酸，1-100g/L聚氧化乙烯十二烷基醚；试剂R1a10-1000kU/L猪胃蛋白酶，0.1-10mmol/L2-(碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯)-5-(2，4-二磺苯基)-2H四唑钠盐，0.0001-0.1mol/LHCl；试剂R1b0.1-10mmol/L吗啉代乙基磺酸，0.5-50mmol/LCaCl<sub>2</sub>；中和缓冲液0.0001-0.1mol/LNaOH试剂21-1000kU/L果糖缬氨酸氧化酶，30-600kU/L过氧化物酶，0.01-0.5mmol/LN-(羧甲基氨羰基)-4，4双偶(二甲胺)-二苯胺钠盐，10-1000mmol/LTris-HCl。该试剂盒酶解效果好于碱性蛋白酶，用量少成本低，测量结果精确。文档编号C12Q1/26GK101363042SQ20081016632公开日2009年2月11日申请日期2008年9月23日优先权日2008年9月23日发明者姜云飞,邹炳德申请人:宁波美康生物科技有限公司