专利名称：一种由Pseudoalteromonas sp.MYX44生产的к-卡拉胶酶的制作方法
技术领域：
生物技术
背景技术：
有关卡拉胶酶的报道并不多见。早在1943年，Mori就从海洋软体动物中提取到能够水解角叉菜卡拉胶的酶。海洋假单胞菌Pseudomonas carrageenovora是最早研究的能够产生卡拉胶酶的微生物。该酶在对k-卡拉胶降解的过程中，使其粘度迅速下降，还原糖含量增加，降解产物以4-硫酸-新卡拉二糖为主。现在已经在假单胞菌、噬纤维菌属Cytophaga、别单胞菌属A. carrageenovora及某些未鉴定菌种中发现到卡拉胶降解酶。Luk，yanov等(1994)从红藻Chondrus， Polysiphonia， Tichocarpus等分离至lj 100株细菌，其中25株菌具有卡拉胶降解活性。 目前的研究已经确定k _卡拉胶酶属于16族糖苷水解酶，k _卡拉胶酶的分类号E.C. 3. 2. 1.83，为专一性内切酶，专门水解a-3，6-内醚-D-半乳糖和P-4-硫酸-D-半乳糖之间的P-l，4-糖苷键。Sarwar等1987年报道用2216E培养基添加商业0. 1%卡拉胶培养海洋细菌Cytophaga sp. lk_C783，分离胞外卡拉胶酶。用硫酸铵沉淀、离子交换色谱、凝胶过滤色谱纯化得到k -卡拉胶酶，纯化的酶分子量用SDS/PAGE电泳测定为100kDa。Potin等1991年报道从红叶藻属(Delesseria sanguinea)分离了一株能够降解不同硫酸化的半乳糖聚合物(琼胶或卡拉胶)的细菌，用硫酸铵、凝胶过滤色谱(S印hacryl S-200HR)、离子色谱(DEAE-S印harose-CL6B)纯化k -卡拉胶酶，用SDS/PAGE电泳检测为单一蛋白质。测定酶分子量为40kDa。 Araki(1999)从海藻表面分离到k-卡拉胶酶产生菌一海洋弧菌CA-1004，通过硫酸铵盐析和层析技术使从发酵液中分离的卡拉胶酶纯化分子量为35kDa。 pl和Km值分别达到9. 2和3. 3mg/ml。
发明内容
本发明的目的是提供一种来源于海水的菌株Pseudoalteromonas sp. MYX44并利用该菌株制备的k-卡拉胶酶以及相关的酶学性质。 本发明分离纯化出一株来源于海水的菌株Pseudoalteromonas sp.MYX44，其具有产生k-卡拉胶酶的特性，保藏单位中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏号为CCTCC M 207151。保藏日期2007年9月25日.保藏单位地址中国武汉，武汉大学.发明的特点是 首次分离出产k -卡拉胶酶Pseudoalteromonassp. MYX44菌株。该菌株为不产孢子的杆状，革兰氏阴性。不抗酸，没有荚膜，氧化酶阳性，无色素。0. 8-1. 2 ii mX 1. 8-2. 2 y m，端生单鞭毛。该菌株来源于海水，为氧化型糖代谢，3%和7% NaCl胨水中生长良好，经过生理生化特征和16S r DNA基因序列测定鉴定为Pseudoalteromonas序列表l，但是未能给出具体种，暂命名Pseudoalteromonas sp. MYX44。为此菌株在2216E培养基上26。C培养24h形成单菌落，菌落乳白色，圆形，边缘整齐。该菌株具有营养要求范围广，容易培养和培养时间短的特点。在发酵培养基中培养28h，其发酵液中k-卡拉胶酶的活力达到最高(32°CT 测定)。用本发明的菌株作为k -卡拉胶酶的生产菌株，具有产品的活性高、稳定性好、生产 周期短、成本低的特点，能够实现工业化生产。通过酶的分离纯化，将纯化的酶蛋白单一组 分进行N端测序得到20个氨基酸的序列经检索不同于已经报告的k-卡拉胶酶。判定其 为一个新的k-卡拉胶酶。
纯化的k-卡拉胶酶SDS-PAGE电泳结果。左边为标准蛋白分子量，右边为 Pseudoalteromonas sp. MYX44生产的k -卡拉胶酶纯酶单带，表示数量单位为kDa。
具体实施例方式1.菌株的分离纯化 本发明Phyllobacterium sp. nov. 921F菌株的获得从黄海水域采集海水样品， 加入到装有25ml富集培养基(蔗糖2g， NaN03lg， K2HP040. 5g， MgS040. 5g， NH4C1 0. 5g， FeS040. Olg， H20 lOOOml， pH7. 2)的三角瓶中，30°C ， 160r/mim摇瓶培养3d。然后将富集培 养液用无菌生理盐水适当稀释后，取0. 2ml涂布初筛分离培养基(蛋白胨10g，豆粉1. 0g， NaC114. 0g，KH2P04l. 0g，CaCl20. lg，琼脂15. 0g，H20 1000mL，pH 10.0。)平板。30。C倒置培 养48h，获得选取平板上有液化性状的白色菌落，得到一株能产k-卡拉胶酶的细菌。
2.菌株的鉴定将分离得到是菌株经过16S r DNA基因序列测序结果GGCCGGTTGAGATTGCTCCGAT
AAGTCCGGAAGTGCCCGCACCACTTGTGAGT 根据测定结果鉴定为Pseudoalteromonas,但是未能给出具体种，暂命名 Pseudoalteromonas sp. MYX44。为此菌株在2216E培养基上26。C培养24h形成单菌落，菌
5落乳白色，圆形，边缘整齐。该菌株具有营养要求范围广，容易培养和培养时间短的特点。
3.制备酶 将Pseudoalteromonas sp. MYX44菌株用液体2216E培养基活化后，以7%的接种 量接入到装有75mL发酵培养基(含有O. 1% k _卡拉胶的2216￡培养基去除琼胶)的250mL 三角瓶中，26t:摇瓶培养28h，培养液4t:下3000rpm将酶发酵液冷冻离心3500rpm、5min，上 清液加入硫酸铵使饱和度达到30%，析出的杂蛋白质经高速离心(7，000rpm)去掉，上清液 继续加入硫酸铵使饱和度达到80%，析出的蛋白质经高速离心(7，000rpm)回收，作为粗酶 用于进一步纯化。
4.纯化酶 将粗酶液分散，以含有0. 025M Tris-HCl缓冲液(pH8. 0)进行透析，每隔4h更换 一次透析外液，用BaCl2检查透析外液是否含有硫酸根，直至无硫酸根检出。将透析好的酶 液加样于S印hadex G-200凝胶层析柱，洗脱液0. 025M Tris-HCl缓冲液(pH8. 0)，在280nm 下检测蛋白峰，DNS法测酶活，收集有活性的蛋白，进行下一步纯化。将S印hadex G-200 层析柱部分纯化后的活性蛋白加样于CM-cellulose 52柱，洗脱液为含有0_1. 0M NaCl的 25mMNa2HP04-NaH2P04(pH7. 2)缓冲液，在280nm下检测蛋白峰，DNS法测酶活后收集有活性 的蛋白。直至获得单一电泳纯的酶组分，用于以下步骤的测定。
5.酶分子量测定 用SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)技术确定k-卡拉胶酶的分子量。具体方法 是试剂准备 (1) 、30%储备胶溶液丙烯酰胺(Acr)29. Og，亚甲双丙烯酰胺(Bis) 1. Og，混匀后 加H20， 370C溶解，定容至100ml，棕色瓶存于室温。 (2)、1.5M Tris-HCl (pH 8.0) :Tris 18. 17g加H20溶解，浓盐酸调pH至8. 0，定容 至100ml。 (3)、1M Tris-HCl (pH 6.8) :Tris 12. llg加H20溶解，浓盐酸调pH至6. 8，定容至 100ml 。 (4)、10% SDS :电泳级SDS 10. Og加H20 68。C助溶，浓盐酸调至pH 7. 2，定容至 100ml 。 (5)、电泳缓冲液(pH 8. 3) :Tris 3. 02g，甘氨酸18. 8g， 10% SDS 10ml加ddH20溶 解，定容至100ml 。 (6) 、10%过硫酸铵(AP) :lgAP加H20至10ml 。 (7)、2' SDS电泳上样缓冲液1M Tris-HCl(pH 6. 8) 2. 5ml， b_巯基乙醇1. Oml， SDS 0.6g，甘油2. Oml，O. 1%溴酚兰1. Oml， H20 3.5ml。 (8)、考马斯亮兰染色液考马斯亮兰0. 25g，甲醇225ml，冰醋酸46ml， H20 225ml 。 (9)、脱色液甲醇、冰醋酸、1120以3 : 1 : 6配制而成。 操作步骤采用垂直式电泳槽装置 (1)、聚丙烯酰胺凝胶的配制 ①分离胶(10% )的配制 H20 4. Oml 30%储备胶3.3ml
1. 5M Tris-HCl 2. 5ml
10% SDS 0. 1ml
10% AP 0. 1ml取lml上述混合液，加TEMED(N，N，N'，N'-四甲基乙二胺)lOiil封底，余加TEMED
4iU，混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面平。(凝胶完全聚合需30-60min) ②积层胶(4% )的配制 ddH20 1.4ml 30%储备胶0.33ml 1M Tris-HCl 0. 25ml 10% SDS 0. 02ml 10% AP 0. 02ml TEMED 2 ii 1 将分离胶上的水倒去，加入上述混合液，立即将梳子插入玻璃板间，完全聚合需 15-30min。 (2)、样品处理将样品加入等量的2XSDS上样缓冲液，IO(TC加热3-5min，离心 12000gX lmin，取上清作SDS-PAGE分析，同时将SDS低分子量蛋白标准品作平行处理。
(3)、上样取10ia诱导与未诱导的处理后的样品加入样品池中，并加入20iil低 分子量蛋白标准品作对照。 (4)、电泳在电泳槽中加入电泳缓冲液，连接电源，负极在上，正极在下，电泳时， 积层胶电压60V，分离胶电压IOOV，电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止(约需3hr)。
(5)、染色将胶从玻璃板中取出，考马斯亮兰染色液染色，室温4-6hr。
(6)、脱色将胶从染色液中取出，放入脱色液中，多次脱色至蛋白带清晰。
(7)、凝胶摄像和保存在图像处理系统下将脱色好的凝胶摄像，结果存于软盘中， 凝胶可保存于双蒸水中或7%乙酸溶液中。将样品加入2倍浓度的Sample Buffer中，在 沸水浴中加热5min变性，取出冷却后进行电泳。固定后，用考马斯亮蓝R250进行染色。标 准蛋白是Phosphorylase B :97， 4kDa ;Bovine serum albumin(BSA) :66kDa ;Ovalbumin : 43kDa scarbonicanhydrase :31kDa trypsin inhibitor (20. lkDa)禾口 lysosyme(14. 4kDa)。 电泳后，测定各样品从开始电泳的位置起移动的距离，将它们相对全长的比例和各标准蛋 白质分子量的，计算此酶的分子量为SDS-PAGE上显示的分子量为35kDa(见图1)。
6.酶蛋白的等电点测定用等点聚焦电泳测定酶蛋白的等电点。
(1)、材料蛋白样品
(2)、试剂 聚丙烯酰胺、甲乙聚丙烯酰胺、两性电解质、尿素、NP40、 teiton-100 电极液1M磷酸(阳极液)、1M氢氧化钠(阴极液) 固定液100g三氯乙酸、10g磺基水杨酸溶于500ml，定容为1000ml 染色液0. 35g考马斯亮蓝R-150溶于300ml脱色液中，加热到60-70。C，加入0. 3g
硫酸铜。 脱色液25%乙醇、8%冰乙酸溶于水样品缓冲液1% Ampholine、2% Triton X-100、9M尿素
(3)、操作步骤
①样品制备 用IEF样品缓冲液提取待分析样品，如其他缓冲液提取的样品则应透析后，冷冻 干燥、再复溶于IEF样品缓冲液。充分溶解后，离心去除不溶杂质。
②制模具 洗干净两块IEF专用玻璃板，进行硅化和反硅化处理，两块玻璃板的硅化和反硅 化面相对，放上夹条，夹子夹好。 ③配胶胶液组成6ml胶母液(10 %，19/1) ;6-8 %尿素；lml Ampholine(pH3. 5-10) ;60_80ull0% AP ;
5ul TEMED 灌胶配好的胶迅速灌入模具 ⑤电泳等胶凝固后，小心揭去上下玻璃板，将塑料垫片底部擦干，小心放于电泳
槽上。在胶面两边各放一根浸透电极缓冲液的电极条。在胶面上任意位置上放上小擦镜纸
片，在纸片上加样，盖上盖子，功率25W电泳，约10min后，暂停电泳，取下纸片，继续电泳约
30min，待电流达4mA以下，停止电泳。 ⑥表面电极测定蛋白质的pl ⑦固定取出塑料片，放入固定液中15min ⑧染色取出塑料片放入染色液中65t:染色，直至条带出现 ⑨结果根据Ampholine pH 3. 0-10的有效pH范围计算出待测样品的pl = 8. 5。
7.酶蛋白的N端测序《DNA测序标准方法》(SCI-S-001)依据Edman降解法原理，即蛋白质的自由 a _氨基与PITC(异硫氰酸苯酯)偶联后，与之相邻的第二残基的肽键大为消弱，在无水酸 TFA(三氟乙酸)的作用下发生特异性的断裂，暴露出第二残基的a-氨基，再与PITC反 应，循环往复地进行偶联降解反应。循环次数受Edman反应产率的限制。按照常规条件进 行SDS-PAGE，将电泳完毕的凝胶按照海绵，滤纸，PVDF膜，凝胶，滤纸，海绵的次序将电印迹 夹层装好，并放入小型电转槽中，在50V(100-170mA)于室温下进行电印迹转移，转移时间 为2小时。取出PVDF膜并用去离子水略为漂洗，用甲醇浸泡数秒钟，用丽春红(Ponceau S) 染色。蛋白质N末端测序是采用Edman降解法，N端前20位氨基酸残基的序列由Applied Biosystems公司的PROCISE蛋白质测序仪测定。结果如下 Asn-Pro-Thr-Cys-His-Ile-Ala-Lys-Pro-Gly-Glu-Thr-Thr-Ile-Leu-Gln-Glu-C ys-Arg-Ser简写为NPTCH IAKPG ETTIL QECRS。
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权利要求
一株弧菌Pseudoalteromonas sp.MYX44，保藏在中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏号为CCTCC M 207151。
2. —株弧菌Pseudoalteromonas sp. MYX44，其16S r DNA基因序列测序结果是CATGGTG ACTTCAT CACTCTG CCGGTTT GACTTAA TCTCTGG GTGCGGG AAAAACA CCCACGC TTTCACCCGTATTAACTTTCCGGTGCAACTAGGATCCACTTG TGAGT。
3. 权利要求1所述的菌株在一种由Pseudoalteromonas sp. MYX44生产的k -卡拉胶酶。
4. 权利要求2所述k-卡拉胶酶，其特征是该酶的分子量为35kD。
5.如权利要求2所述的K-卡拉胶酶，其特征是该此酶的N端氨基酸序列为 Asn-Pro-Thr-Cys-His-Ile-Ala-Lys-Pro-Gly-Glu-Thr-Thr-Ile-Leu-Gln-Glu-Cys-A rg-Ser简写为NPTCH IAKPG ETTIL QECRS。
全文摘要
本发明的目的是提供一种来源于海水的菌株Pseudoalteromonas sp.MYX4该菌株具有营养要求范围广，容易培养和培养时间短的特点。在发酵培养基中培养28h，其发酵液中κ-卡拉胶酶的活力达到最高(32℃下测定)。用本发明的菌株作为κ-卡拉胶酶的生产菌株，具有产品的活性高、稳定性好、生产周期短、成本低的特点，能够实现工业化生产。
文档编号C12N9/42GK101724577SQ20081017076
公开日2010年6月9日 申请日期2008年10月21日 优先权日2008年10月21日
发明者江晓路, 牟海津, 马悦欣 申请人:中国海洋大学