肺炎球菌的抗原及配体管式pcr检测试剂盒及其制备和应用的制作方法

专利名称：：肺炎球菌的抗原及配体管式pcr检测试剂盒及其制备和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种检测试剂盒，尤其涉及一种肺炎球菌的抗原及配体管式PCR检测试剂盒及其制备方法和应用。
背景技术：
：早期蛋白质检测是以抗体同特定待检物蛋白质的低解离常数和一定的特异性为基础，采用简易方便的筛选方法——抗体捕捉法。该法是检测样品中有无抗原首先将抗原包被于固相支持物，然后用抗体去结合抗原形成复合物，冲洗去掉未结合的抗体，最后用和结合抗体特异识别的标记分子去检测结合抗体；也可以抗原、抗体先反应形成复合物后，再结合到固相支持物上，然后检测复合物。许多抗体捕捉法是利用间接法来检测抗体，如检测抗体是鼠抗体，则检测分子可能是带检测标记的兔抗鼠抗体，所用的传统检测标记包括放射性同位素、染料和作用于底物产生可检测分子如色原的酶。酶联免疫吸附剂测定(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)是广为人知的免疫检测法，传统的ELISA技术似三明治夹心法，即两抗体共同结合到某一抗原一一捕捉抗体，将其同样品中的抗原结合，再加入同抗原结合的偶连酶的检测抗体，然后反应形成捕捉抗体一抗原一检测抗体"三明治"复合物，最后测偶连酶活性显示检测结果。虽然抗体检测法具有较大的应用价值，但是它的检测范围受捕捉抗体和抗原反应的解离常数(Kd)值限制。在实践中，检测低限大约是Kd值的1%，当待分析物浓度降低到这个可能检测极限时，所捕捉到的待分析物抗体百分率将不足以产生相对于信噪比的可检测信号。因此，用荧光或化学发光检测系的抗体检测法的检测下限约lpg/ml(10-4M对平均分子量50，OOO道尔顿的蛋白质)。随着基因技术应用的快速发展，在抗原抗体检测方面己有较多的基因检核酸待测物的检测要求不同于抗体检测的技术。在二十世纪八十年代中期，DNA技术的研究发现了通过酶重复扩增过程可扩增DNA的方法，后来叫聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction，PCR):首先加入两互补的寡核苷酸序列(叫引物)，它将结合在所要扩增的区域的两侧，然后加热变性，在降温退火过程中让引物同互补序列结合，再加入Klenow片段DNA聚合酶I以延伸引物，通过重复变性、退火、延伸所希望的片段，目标DNA就会以指数方式扩增。PCR曾经过许多改进，一个重要的变化是耐热聚合酶(即Taq聚合酶)的应用，它产于温泉中嗜热菌，具有热稳定性，几乎不被PCR变性中高温影响，所以不必像应用不耐热的Klenow聚合酶I，每一次变性后得补加聚合酶。在以PCR作为扩增系统的运用中，产生了免疫-PCR方法。该法是把特定待测物连接到微孔板上，然后用PCR扩增放大能力来检测——例如小牛血清白蛋白(BSA)被动吸附到一免疫检测板上，加入对BSA的特异抗体(连有蛋白A链亲和素融合蛋白及生物素标记的报告扩增子)，PCR后用琼脂糖电泳分析报告扩增子，可检测到几百个BSA分子，但这种方法不能实现定量检测，同时因为缺乏待测物的特异捕捉分子，也不能用于生物样品检测。为此，人们不断对其进行改进首先用生物素化第二抗体和一个连接生物素化报告扩增子的链亲和素融合蛋白，然而5种试剂的加入、洗板、扩增、检测很费时费力，而且解离复杂；随后又把报告扩增子共价连到第二抗体上，虽然直接连接减少了试剂数目和解离复杂性，但仍需要PCR操作，劳动强度和试验室污染的可能性还是无法降低。三明治式免疫-PCR是由传统ELISA方式的改编而来，即检测抗体连有DNA标记，再运用到分析检测生物样品。早期的抗体免疫-PCR检测形式是将初级抗体固定在平板上，然后依次加入样品，再用生物素化检测抗体，链亲和素和生物素化的DNA;后来改进为直接连接DNA到抗体上和用标记引物产生PCR产物，而PCR的扩增能力可产生大量DNA标记，这种DNA标记可用典型的凝胶电泳检测分析。PCR扩增抗体携带的DNA标记可提高对抗原检测的灵敏度(该法缺少用基因芯片法来检测)，比传统ELISA方法的灵敏度还高，但用凝胶电泳纯化扩增产物需要大量人工操作，因此耗时；而且用于PCR扩增的引物在退火时可引起二聚体扩增产生副产品；同时它还存在污染核糖或污染也将同样被扩增的情况。免疫PCR方法是采用一个捕捉抗体，类似于直接ELISA三明治夹心法，不同点在于选择检测方法。该方法己被成功用于检测肿瘤坏死因子、P-半乳糖甘酶、人甲状腺刺激激素、鼠可溶T-细胞受体、重组乙肝表面抗原、不同6的人心钠素、e-葡糖苷激酶、绒毛膜促性腺激素等物质，有的敏感度达10—15摩尔水平。在免疫PCR方法中，抗原浓度通常由PCR后产物分析决定，可以是凝胶电泳分析，也可以是PCR-ELISA分析。定量分析PCR终点产物的DNA标记易产生错误结果，因为产物形成率在几个对数增长循环后即下降，再者PCR样品处理可导致实验室污染；另外，这些实验由于步骤多且需冲洗，因此在这个过程中抗原抗体复合物可能会出现解离。实时定量PCR是更先进的PCR技术，已用于核酸分析。在实时PCR中，PCR扩增DNA是在非线性标记、双荧光杂交探针存在条件下进行，其中一种荧光染料用作报告分子，它的发射光谱被第二种荧光染料淬灭;该实时PCR在链延伸时，报告染料位于杂交探针5'端(FAM)，淬灭染料位于3'端(TAMRA)，此探针和PCR扩增的特殊耙序列结合，当未结合时，5'端FAM发射的荧光被3'TAMRA淬灭，但随着PCR循环增加，扩增子增多，杂交探针被Taq多聚酶5'-3'核酸活性切割，结果使报告荧光染料从淬灭染料中释放出来，致报告分子发射峰值增加。序列检测系统用氩原子激光激活荧光(488nm)，激光装置照相机监控PCR反应，收集从所有96孔发出的500nm-660nm荧光，然后利用相应原理、设立内参照，直接通过一定的软件分析定量。该技术实现整个反应实时监控，同时也可应用逆转录-PCR。由于序列检测系统用96孔热循环仪可连续检测每孔中PCR反应时的荧光谱，因此，可排除复制子试验室污染。Gold等在1995年(GoldL，etal.A腿RevBiochem(生物化学年报)，64:763-797)应用SELEX筛选出的系统性红斑狼疮特异抗体的RNA和ssDNA配基，不仅对系统性红斑狼疮进行诊断，而且可以进行病情监测和疗效检验；Gold等又在1999年(GoldL，etal.DiagnDec(诊断);4(4):381-8)在配基微阵分子诊断应用研究中，对配基微阵分辨率进行了研究。上述研究均显示出核酸配基检测具有巨大的应用前景，但是目前的配基检测都是采用直接对配基PCR扩增放大检测，这种检测操作复杂，不但需要将配体和配基分离，而且由于配体和配基分离后，配基纯度及残留配体和配基的再结合可以阻断DNA复制，因此导致检测灵敏度低和准确性差。核酸与蛋白质在细胞内相互作用是普遍现象，核酸能折叠形成二级结构和三级结构，这对其与蛋白质相互结合作用非常重要，通过使核苷酸序列多样化而使体外检测核酸蛋白质相互作用方法成熟。指数富集的配基系统进化技术(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment,SELEX)被用来分离所选靶目标的核苷酸配体，这些配体被称为配基或适配体，意即核酸可以形成一定结构并适配入靶分子的口袋，SELEX技术就是利用该原理筛选耙分子配基的方法。利用SELEX技术，许多靶标的核苷酸配基已被筛选出，尤其是已知能和核酸结合的许多蛋白质可作为SELEX技术的较合适靶标，如T4DNA聚合酶、噬菌体R17被膜蛋白、大肠杆菌rho因子、大肠杆菌核糖体蛋白Sl、苯丙氨酸-tRNA合成酶、识别RNA的自身免疫抗体、E2F转录因子及不同的肺炎球菌相关蛋白。SELEX技术可筛选出许多不同蛋白配基的事实引发了配基应用的拓展，这些配基可作为单抗和多抗产品的替代品应用于诊断和治疗，如DNA聚合酶的配基已被用于热启动PCR来诊断低拷贝的复制子，提高PCR敏感性和保真性；同时配基也被用于促进实验方法，如中性弹性蛋白的酶配体荧光标记用于流式细胞仪检测弹性酶浓度，中性弹性蛋白酶配基用于鼠肺炎症诊断模型体内诊断。在酶联寡核苷酸方法中，一个或多个抗体被对抗原有高亲和力、高特异性的配基取代，这样的配基可通过SELEX技术体外筛选获得。美国专利WO96/40991和WD97/38134中描述了酶联寡核苷酸方法，其中用核苷酸配基代替夹心法中的检测抗体或捕捉抗体；同时也提到捕捉分子-靶分子-检测分子复合物中核酸配基PCR扩增检测系统。该方法利用常用报告分子如酶、生物素等的PCR引物来扩增扩增子，这样在提高配体数量的同时，还需要进一步增加把扩增的配基和不纯的核苷酸引物二聚体分离的步骤。DNA和RNA配基也存在着这样的问题。另外，夹心法用传统的酶联检测抗体检测捕捉分子-抗原复合物，然后用报告酶分子标记寡核苷酸，这需要化学合成步骤和额外的劳动，同时用来标记的引物不能解决不纯问题和引物二聚体扩增问题，因此，无法解决定量检测的问题。
发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种高灵敏度、快速、可定量检测的肺炎球菌的抗原及配体管式PCR检测试剂盒。本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种简便易行的肺炎球菌的抗原及配体管式PCR检测试剂盒的制备方法。本发明还要解决的一个技术问题是提供肺炎球菌的抗原及配体管式PCR检测试剂盒在检测获得性人类免疫缺陷病肺炎球菌的特异寡核苷酸配体中的应用。为解决上述问题，本发明所述的一种肺炎球菌的抗原及配体管式PCR检测试剂盒，包括一PCR管为聚苯乙烯材料制成的普通PCR管，其上包被捕捉获得性人类免疫缺陷病肺炎球菌靶分子的抗体或配基；一检测试剂A液和B液，用于获得性人类免疫缺陷病肺炎球菌配体/抗原一阴性和阳性对照样品。一种用于如上所述的肺炎球菌的抗原及配体管式PCR检测试剂盒的A液，其特征在于它由100ul、pH值为7.4的25pmol/ul带有人为序列修饰的检测配基和2ug/ml抗体的磷酸盐缓冲液组成。所述人为序列修饰的检测配基是指人为在配基的3'和5'端分别或同时加上己知序列的单链茎环结构和两条互补双链。一种用于如上所述的肺炎球菌的抗原及配体管式PCR检测试剂盒的B液，其特征在于它由lul上游引物、lul下游引物、8ul4XdNTP、lOullOXPCR缓冲液、25单位的耐热DNA聚合酶和水组成；其中上游引物序列为1:5，-TCTAACGTGAATGATAG-3，；下游引物序列为2:5，-TATGGTCGAATAAGTTAA-3'。该B液还含有分子信标。所述的分子信标是修饰序列的茎环分子信标、SYBRGreen1荧光染料及带有荧光分子和淬灭分子的探针分子信标中的任意一种。一种制备如上所述的肺炎球菌的抗原及配体管式PCR检测试剂盒的方法，包括以下步骤(1)在37土rC下、用体积浓度为120。/。的戊二醛处理PCR管，使戊二醛附着在PCR管；(2)用超纯水清洗PCR管；(3)将捕捉肺炎球菌靶分子的配基/抗体包被在PCR管上；(4)用pH值为7.4的含5。/。的脱脂奶粉、甘氨酸、牛血清白蛋白和龟精DNA的碳酸氢钠缓冲液封闭PCR管，经干燥得PCR管；(5)配制检测试剂A液将检测肺炎球菌的抗体和经序列修饰的抗体特异寡核苷酸配基在pH值为7.4的磷酸盐缓冲液中孵育并通过紫外线交联，或用磷酸盐缓冲液溶解配基即可；(6)配制检测试剂B液将B液各组分混合后加水即得；(7)将干燥后的PCR管、检测试剂A液和B液与标准检测样品、阴性和阳性对照样品组装，放入试剂盒即可。所述步骤(3)中的配基包被在PCR管上是指先将链酶亲和素包被在PCR管上，再加入带有生物素的配体捕捉配基，通过链酶亲和素和生物素的结合，使捕捉配基固着在PCR管上。所述步骤(3)中的抗体包被在PCR管上是指将单克隆抗体用pH值为9.6的碳酸氢钠缓冲液包被在PCR管上。一种如上所述的肺炎球菌的抗原及配体管式PCR检测试剂盒在检测获得性人类免疫缺陷病肺炎球菌的特异寡核苷酸配体中的应用，包括以下步骤①设置阴性和和阳性标准曲线；②待测样品的制备；③在PCR管中加入待测样品和阴阳对照样品，在37土rC孵育45-120分钟；④将步骤③中孵育后的PCR管用洗液冲洗；在PCR管中加入A液，在37±rC孵育45-120分钟；⑥将步骤⑤中孵育后的PCR管用洗液冲洗；⑦在PCR管中加入B液后再加入标准品，采用实时定量-PCR检测，并进行数据采集和处理。.所述步骤④和⑥中的洗液是指pH值为7.4、含0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液。所述步骤⑦中的实时定量-PCR检测的标记物选自化学发光物质、酶、荧光和同位素中的一种或多种。本发明与现有技术相比具有以下优点1、由于本发明利用聚苯乙烯制成的PCR管经戊二醛处理后，可附着核酸配体(或抗原、抗体及配基等)，通过特异寡核苷酸配基(或携带信号分子的特异寡核苷酸配基)与配体直接结合，将配体信号转换成核酸配基信号，然后经PCR(或滚环复制)扩增放大、检测，来测定配体，因此其检测配体具有快速、灵敏度高、特异性强、多配体微阵检测和可机械化完成的特点。2、由于本发明是利用连接在抗体或配基上的人为修饰DNA或RNA序列作为信号分子，该修饰DNA或RNA序列具有一对引物和中间的人为标记序列，针对被检测的靶分子和检测目的的要求这一对引物可以相同也可以不相同，中间的标记序列是靶分子的标记，因此通过对信号修饰序列的PCR扩增，可以实现对抗原或配体的检测。3、由于本发明在使用过程中是通过采用实时定量-PCR仪进行扩增产物检测或寡核苷酸芯片检测来进行数据采集和处理的，同时通过对DNA或RNA修饰序列的变换来达到数据的效正，因此可有效进行单一样品或多种样品的检测。4、由于本发明在使用过程中所进行的数据采集和处理都在PCR管内一次性完成，无须将产物转换地方，进行提纯、检测等步骤，并且PCR产物可在PCR管内封闭销毁，因此操作过程简单、安全、可有效避免逸出产物所造成的环境污染。5、本发明由于在反应时只需将配体和配基室温孵育45分钟就能完成配体和配基的结合反应，因此操作简便，便于一般实验室或临床检验科室的普及应用。6、由于本发明组装的检测试剂盒或构建的生物芯片可以广泛应用于基础研究与临床检测，因此具有一定的经济效益与社会效益。下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。图1为本发明的小鼠IgG-Fc片段的配基特异寡核苷酸配基序列。图2为本发明的新型免疫-PCR检测流程。图2a为本发明的抗体IgG的Fc片段特异寡核苷酸修饰配基。图2b为本发明的抗体IgG的Fc片段特异寡核苷酸修饰配基PCR扩增产物，荧光信号分子5'荧光分子-TTTTTTTTTT-荧光淬灭分子3'序列。图3为本发明的配基检测流程。图3a为本发明的5'生物素化的捕捉配基序列。图3b为本发明的修饰的检测配基序列。图3C为本发明的PCR扩增产物，荧光信号分子5'荧光分子(激发光源波长470nm，检测光源波长510nm)-TTTTTTTTTT-荧光淬灭分子3'序列。图4为本发明的实时定量-PCR原理图。图5为本实施例1的实时定量PCR检测曲线。图6为本实施例1的样品检测的标准曲线。图7为本实施例2的实时定量PCR检测曲线。图8为本实施例2的样品检测的标准曲线。具体实施例方式一种肺炎球菌的抗原及配体PCR管式检测试剂盒，包括其上包被捕捉肺炎球菌靶分子的抗体或配基的检测PCR管;用于肺炎球菌配体/抗原检测的检测试剂A液和B液；标准品和对照品。其中A液由带有人为序列修饰的配基/抗体和磷酸盐缓冲溶液组成；B液包括上游引物、下游引物、4XdNTP、IOXPCR缓冲液和耐热DNA聚合酶；上游引物序列为l:5，-TCTAACGTGAATGATAG-3'下游引物序列为2:5，-TATGGTCGAATAAGTTAA-3'标准检测样品、阴性和阳性对照样品为国家认定的已知滴度为103~108拷贝/ul的检测样品。标准检测样品序列为TTCGACCATA-3'在B液中还可以加入茎环分子信标、SYBRGreen1nucleicacidstain及带有荧光分子和淬灭分子的探针分子信标中任意一种的分子信标。在本实施例中选用了荧光分子信标，其序列为5'荧光分子-TTTTTTTTTT-荧光淬灭分子3'。为便于理解，本发明选用小鼠IgG-Fc片段的特异寡核苷酸配基序列(参见图1)进行具体实施例的描述，该序列是通过SELEX技术针对配体筛选出的一段20-40个碱基的寡核苷酸片段，再经人为增加修饰序列后，使其变成可携带大量信息的配基序列用于多种配体同时检测的示意图。人为序列可以分别加在5，端、3，端或在5'端和3'端同时加上，长度可以多样，其中PCR所用引物为寡核苷酸配基两端人为添加序列的互补序列。实施例l:新型免疫-PCR检测新型PCR检测流程(参见图2)是指将PCR管处理后，首先包被一抗体，然后与检测样品共同孵育，形成一抗体-抗原复合物；再经清洗后，加入经配基标记的检测抗体，共同孵育后洗去未结合的检测抗体，最后针对配基修饰序列进行PCR扩增及扩增产物的分析和处理。其具体步骤如下1、PCR管的制备将0.2ml聚苯乙烯PCR管用50ul、体积浓度为120%的戊二醛在37士1。C下处理13小时；用超纯水、每次2~5分钟冲洗PCR管三次；用pH值为9.6的碳酸氢钠缓冲液将捕捉肺炎球菌抗原的单克隆抗体2ug/ml包被在PCR管上，然后将该PCR管用100ul、pH值为7.4的含5%脱脂奶粉、甘氨酸、牛血清白蛋白和龟精DNA的碳酸氢钠缓冲液在37士rC下处理13小时，使PCR管封闭，干燥后待用。2、抗体试剂A液的制备将检测肺炎球菌的小鼠IgG抗体2ug/ml和经序列修饰的小鼠IgG抗体Fc特异寡核苷酸配基25pmol/ul(参见图2a:检测配基由两部分组成，第一部分ATCTGCGCGCTCCCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3，为小鼠IgG抗体FC特异寡核苷酸配基；第二部分双链TTCGACCATA-3，为配基修饰序列，其中5，-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'为标志序列)，在100ul、pH值为7.4的1XPBS(138mMNaCl，2.7mMKCl，8.1mMNa2HP04，l.lmMKH2P04，lmMMgCl2)中共同孵育60~120分钟，并通过308纳米波长、12焦耳、1分钟的紫外线交联，使抗体和配基形成更稳定的复合物。3、PCR检测试剂B液的制备将含修饰序列的上游引物和下游引物各(25pmol/ul)lul、4XdNTP8ul、10XPCR缓冲液10ul(含Mg2+)和25单位的TaqDNA聚合酶(临用前加入)混合后加水至100ul(可根据检测仪即得。其中IOXPCR缓冲液是由pH值为8.3的50mmol氯化钾、15mmol氯化镁、10mmol的Tris-HCl和质量浓度为0.1%的明胶组成的混合物；4XdNTP是由每种2.5mM的dATP、dTTP、dGTP和dCTP组成的混合物。以下为应用具体操作步骤每次检测均应根据阴性、阳性对照样品按100pg，10pg，lpg，0.1pg，0.01pg，O.OOlpg设置阴性和和阳性标准曲线。(1)从试剂盒中取出检测PCR管放入检测架上，将在56。C下灭活60分钟的人血清样品100ul，及阴阳对照样品放入普通微量离心机中，以4000转/分的转速离心10分钟后，分别取被检测人血清和阴阳对照样品血清各50ul加入检测PCR管中，在37士rC下孵育45120分钟。(2)用洗液冲洗PCR管3次，3分钟/次；其中洗液为pH值为7.4、含0.05%吐温-20(Tween-20)的磷酸盐缓冲液(PBS)。(3)在PCR管中加入A液60ul，在37±rC下孵育45~120分钟。(4)用步骤(2)中的洗液冲洗PCR管3次，3分钟/次。(5)在PCR管中加入B液60ul后，同时再加入4个制作标准曲线的标准样品，采用Rotor-GeneRG3000实行实时定量-PCR扩增，共35个循环(参见图4、图5)，然后进行数据采集和处理并打印检测报告。其中扩增条件为预变性95"C、5分钟；变性94'C、30秒；复性55°C、30秒；延伸72'C、30秒；终延伸72'C、5分钟。实时定量-PCR检测的标记物选自化学发光物质、酶、荧光和同位素中的一种或多种。图4为本发明的实时定量-PCR原理图。图5为本实施例的实时定量PCR检测曲线，该曲线横坐标是PCR的循环次数，纵坐标是PCR产物荧光检测对数值。通过该曲线可计算出每个模板的Ct值，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，利用己知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线最后通过标准曲线达到对未知模板进行定量分析。图6为本实施例的样品检测的标准曲线，该曲线横坐标是配基修饰序列模板的拷贝数，纵坐标是Ct值。利用标准品的己知起始拷贝数和Ct值绘制标准曲线，每个未知模板的Ct值，通过标准曲线求出未知模板的起始拷贝数，从而计算出检测配体或抗原的含量。检测结果如下表:编号彩线名称类型Ct预定拷贝(copies/ul)检测拷贝(c叩ies/ul)1■标准品1St3ndsrd17.9850,000,000.0000000051,615,165.78285460<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>实施例2:配基检测配基检测流程(参见图3)是指将PCR管处理后，首先包被识别配体的配基，然后与检测样品共同孵育，形成配体-配基复合物；再经清洗后，加入经修饰序列标记的识别检测配体的不同配基，共同孵育后洗去未结合的检测配基，最后针对配基修饰序列进行PCR扩增及扩增产物的分析和处理。其具体步骤如下1、PCR管的制备将0.2ml聚苯乙烯PCR管用50ul、1~20%戊二醛在37士rC处理13小时；用超纯水、每次25分钟清洗PCR管三次；将50ul链菌亲和素(streptavidin)包被在PCR管上后，用60ul、pH值为7.4的含5%脱脂奶粉、甘氨酸、牛血清白蛋白和龟精DNA的碳酸氢钠缓冲液在37。C处理2小时封闭，干燥后待用；然后用300ul、pH值为7.4碳酸氢钠缓冲液漂洗三次，每次3分钟；再加入25pmol/ul的50ul捕捉肺炎球菌配体的含生物素配基(biotin，B，其序列为生物素-5，AGGCATGTTTCCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA画3，)(参见图3a)，在37士rC孵育1小时后用300ul、pH值为7.4的碳酸氢钠缓冲液漂洗三次，每次3分钟，干燥后待用。2、抗体试剂A液的制备、PCR检测试剂B液的制备及具体应用均同实施例l。其中图7为本实施例的实时定量PCR检测曲线；图8为本实施例的样品检测的标准曲线。检测结果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>权利要求1、一种肺炎球菌的抗原及配体管式PCR检测试剂盒，包括—PCR管为聚苯乙烯材料制成的普通PCR管，其上包被捕捉获得性人类免疫缺陷病肺炎球菌靶分子的抗体或配基；—检测试剂A液和B液，用于获得性人类免疫缺陷病肺炎球菌配体/抗原检测；—标准检测样品；—阴性和阳性对照样品。2、一种用于如权利要求1所述的肺炎球菌的抗原及配体管式PCR检测试剂盒的A液，其特征在于它由IOOul、pH值为7.4的25pmol/ul带有人为序列修饰的检测配基和2ug/ml抗体的磷酸盐缓冲液组成。3、如权利要求2所述的一种用于肺炎球菌的抗原及配体管式PCR检测试剂盒的A液，其特征在于所述人为序列修饰的检测配基是指人为在配基的3'和5'端分别或同时加上已知序列的单链茎环结构和两条互补双链。4、一种用于如权利要求1所述的肺炎球菌的抗原及配体管式PCR检测试剂盒的B液，其特征在于它由lul上游引物、lul下游引物、8ul4XdNTP、10ulIOXPCR缓冲液、25单位的耐热DNA聚合酶和水组成；其中上游引物序列为1:5，-TCTAACGTGAATGATAG-37;下游引物序列为2:5，-TATGGTCGAATAAGTTAA-3，。5、如权利要求4所述的一种用于肺炎球菌的抗原及配体管式PCR检测试剂盒的B液，其特征在于该B液还含有分子信标。6、如权利要求5所述的一种用于肺炎球菌的抗原及配体管式PCR检测试剂盒的B液，其特征在于所述的分子信标是修饰序列的茎环分子信标、SYBRGreen1荧光染料及带有荧光分子和淬灭分子的探针分子信标中的任意一种。7、一种制备如权利要求1所述的肺炎球菌的抗原及配体管式PCR检测试剂盒的方法，包括以下步骤(1)在37土rC下、用体积浓度为120。/。的戊二醛处理PCR管，使戊二醛附着在PCR管；(2)用超纯水清洗PCR管；(3)将捕捉肺炎球菌靶分子的配基/抗体包被在PCR管上；(4)用pH值为7.4的含5。/。的脱脂奶粉、甘氨酸、牛血清白蛋白和龟精DNA的碳酸氢钠缓冲液封闭PCR管，经干燥得PCR管；(5)配制检测试剂A液将检测肺炎球菌的抗体和经序列修饰的抗体特异寡核苷酸配基在pH值为7.4的磷酸盐缓冲液中孵育并通过紫外线交联，或用磷酸盐缓冲液溶解配基即可；(6)配制检测试剂B液将B液各组分混合后加水即得；(7)将干燥后的PCR管、检测试剂A液和B液与标准检测样品、阴性和阳性对照样品组装，放入试剂盒即可。8、如权利要求7所述的制备肺炎球菌的抗原及配体管式PCR检测试剂盒的方法，其特征在于所述步骤(3)中的配基包被在PCR管上是指先将链酶亲和素包被在PCR管上，再加入带有生物素的配体捕捉配基，通过链酶亲和素和生物素的结合，使捕捉配基固着在PCR管上。9、如权利要求7所述的制备肺炎球菌的抗原及配体管式PCR检测试剂盒的方法，其特征在于所述步骤(3)中的抗体包被在PCR管上是指将单克隆抗体用pH值为9.6的碳酸氢钠缓冲液包被在PCR管上。10、一种如权利要求1所述的肺炎球菌的抗原及配体管式PCR检测试剂盒在检测获得性人类免疫缺陷病肺炎球菌的特异寡核苷酸配体中的应用，包括以下步骤①设置阴性和和阳性标准曲线；②待测样品的制备；③在PCR管中加入待测样品和阴阳对照样品，在37土rC孵育45~120分钟；④将步骤③中孵育后的PCR管用洗液冲洗；⑤在PCR管中加入A液，在37±rC孵育45~120分钟；⑥将步骤(D中孵育后的PCR管用洗液冲洗；⑦在PCR管中加入B液后再加入标准品，采用实时定量-PCR检测，并进行数据采集和处理。11、如权利要求10所述的肺炎球菌的抗原及配体管式PCR检测试剂盒在检测获得性人类免疫缺陷病肺炎球菌的特异寡核苷酸配体中的应用，其特征在于所述步骤④和⑥中的洗液是指pH值为7.4、含0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液。12、如权利要求10所述的肺炎球菌的抗原及配体管式PCR检测试剂盒在检测获得性人类免疫缺陷病肺炎球菌的特异寡核苷酸配体中的应用，其特征在于所述步骤⑦中的实时定量-PCR检测的标记物选自化学发光物质、酶、荧光和同位素中的一种或多种。全文摘要本发明涉及一种肺炎球菌的抗原及配体PCR管式检测试剂盒，该试剂盒包括包被捕捉获得性人类免疫缺陷病肺炎球菌靶分子的抗体或配基的PCR管、用于获得性人类免疫缺陷病肺炎球菌配体/抗原检测的检测试剂A液和B液、标准品和对照品。本发明通过特异寡核苷酸配基(或携带信号分子的特异寡核苷酸配基)与配体直接结合，将配体信号转换成核酸配基信号，然后经PCR扩增放大、检测，来测定配体，因此其检测配体具有快速、灵敏度高、可定量检测的特点。同时本发明还公开了该试剂盒的制备方法和在检测获得性人类免疫缺陷病肺炎球菌的特异寡核苷酸配体中的应用方法。文档编号C12Q1/68GK101429547SQ200810177278公开日2009年5月13日申请日期2008年12月2日优先权日2008年12月2日发明者廖世奇申请人:兰州普利生物技术开发有限公司