专利名称：一种人工合成多肽在细胞大规模培养中作为支架物的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞大规模培养技术领域，具体地说，是涉及一种人工合 成多肽在细胞大规模培养中作为支架物的应用。
背景技术：
哺乳动物和植物细胞大规模培养技术是我们国家近年来扶持力度增大 的生物制品的关键技术。该技术主要应用于复杂，分子量巨大的蛋白表达 及基因治疗药物或疫苗的病毒生产和生物农业等一系列产品生产。由于细 菌等巨核细胞表达系统在转录及修饰方面有缺陷，许多重要价值的蛋白质， 特别是基因工程药物，疫苗，抗体等糖基化的需要，使哺乳动物细胞表达 系统有了一个更合适的工具。因此，哺乳类动物细胞表达系统引起了大家 的重视，以哺乳类动物大规模培养技术为基础的生物制药产业和生物农业 产业在西方发达国家得到了迅速发展。
随着功能基因组学，癌症基因组学和蛋白组学的研究深入，后基因组 时代来临后，各个研究机构、生物制药公司将要对成千上万的蛋白进行功 能研究、筛选及生产，但这么多蛋白不可能在短时间内由一个单位来完成， 所以生物制品(蛋白质产品)市场将是非常巨大。而这一巨大市场的关键 和核心技术是细胞的大规模培养技术(动物细胞生物反应器)，该技术涉及 诸多学科(细胞生物学、生化学、分子生物学、发酵技术、动物细胞营养 学、植物细胞学、机电学、计算机科学、传感技术等)，以细胞培养反应器 的形式表现出各种高新技术含量为机电一体化产品。
细胞培养是指从体内组织取出细胞，摹拟体内环境，在无菌、适当温 度及酸碱度和一定营养条件下，使其在体外生长繁殖、并维持其结构、功 能、及生理特性的一种培养技术。体外培养细胞根据它们在培养器皿是否 能贴附于支持物上生长的特征，可分为贴附型生长和悬浮型生长两大类。贴附型细胞在培养时能贴附在支技物表面生长，悬浮型细胞在培养中悬浮 生长。要使得细胞反应器能产出高效并具有自然细胞活性的产品，关键技 术要仿真培养细胞在体生活环境。细胞培养的环境要求比较严格，细胞的 生长、繁殖、代谢等生理性质在很大程度上受各种环境的影响。为了使细 胞处于最佳的生长状态，选择优良环境是非常重要，除了气体交换、培养
温度、pH、渗透压及其它等因素外，对于贴附型细胞来说，特别重要的是
细胞生长的支架物，这种细胞在体外环境下需在人工支持物上生长(附着 于半固体或固体表面生长)。早期的实验中，用玻璃瓶来做支持物(实验室 培养至今还在用)，后来用塑料制品、微载体、微囊、及膜载体等进行大规 模细胞培养，其原理是模拟细胞在体的三维空间生活环境。
微载体细胞培养法是一种用于培养锚地依赖性细胞的大规模培养技 术。这种培养技术是在生物反应器内加入培养液和一种对细胞无毒害作用 的材料支撑的颗粒(微载体)，使细胞在微载体表面附着和生长，并通过不 断搅拌使微载体保持悬浮状态。但其缺点是搅拌桨及微珠间的碰撞易损伤 细胞，接种密度高，微载体吸附力弱，不适合培养悬浮型细胞。中空纤维 细胞培养技术是模拟细胞在体内生长的三维状态，利用一种人工的"毛细 管"即中空纤维给培养的细胞提供物质代谢条件而建立的一种体外培养系 统。其缺点是中空纤维的污染和堵塞，观察困难，细胞生长或过量气体产
生会 破坏纤维。微囊化培养技术其要点是在无菌条件下将拟培养的细胞、 生物活性物质及生长介质共同包裹在薄的半透膜中形成微囊，再将微囊放 入培养系统内进行培养。其缺点是①微囊制作复杂，成功率不高；②微 囊内死亡的细胞会污染正常产物；③收集产物必须破壁，不能实现生产连 续化。目前采用微载体、微囊、中空纤维等支持物的培养方式，不能做到 真正的三维空间细胞培养环境，因此，培养细胞的制品产量和活性功能都 受一定影响；而且微载体等支持物每次都需要更换新的，成本高，且不容 易洗脱和分离，生产工艺复杂，所以探索一些合成物来解决以上问题是细 胞培养技术所迫切需要的。
综上所述，本发明的目的是提供一种人工合成多肽在细胞大规模培养 中作为支架物的应用。
发明内容
为实现本发明的目的，本发明的技术方案如下
本发明提供一种人工合成多肽在细胞大规模培养中作为支架物的应 用，包括在大规模培养、中试规模的转瓶培养或实验室研究中作为有贴壁 习性细胞生长支架物，该支架物可改变传统的二维生长空间为三维生长空 间，更接近在体活细胞的生活环境。
根据本发明所述的人工合成多肽在细胞大规模培养中作为支架物的应 用，优选地是，所述的多肽是一种合成的人体氨基酸多肽，是由人体必需 氨基酸和非必需氨基酸组成的。多肽氨基酸是能被培养细胞吸收的特殊培 养剂，可作为细胞生长繁殖的营养物质，同样可供机体吸收。具体的说， 所述的多肽是丙氨酸、精氨酸、天门冬酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、谷 氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨 酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸及组氦酸中的一 种或几种。
根据本发明所述的人工合成多肽在细胞大规模培养中作为支架物的应 用，其中优选地是，所述的多肽具有多层次螺旋状结构。蛋白质自组装主 要依靠氢键静电相互作用，静电相互作用，疏水相互作用等次级键的作用， 形成各种不同的蛋白纳米纤维结构，具有多层次螺旋状结构，长度和大小 由特定细胞的生长特性决定。微蛋白质片段的空间造型可以有多种类型， 螺旋状结构更适合有贴壁习性的细胞生长，更能体现活细胞三维空间如同 在体细胞的生长生活环境。本发明的多肽是微小蛋白片段，是现有细胞培 养系统支架物微载体的1/1000，在体积上更接近细胞自我复制的细胞外基 质，可直接或植入体内而没有副作用。在制备生物制品过程中，不需要将 该多肽滤去或分解。
根据本发明所述的人工合成多肽在细胞大规模培养中作为支架物的应 用，优选地是，所述的细胞包括哺乳动物细胞和植物细胞。
根据本发明所述的人工合成多肽在细胞大规模培养中作为支架物的应 用，更优选地是，所述的哺乳动物细胞选自人或其他哺乳动物的各类干细 胞、祖细胞、293HEK动物细胞、CHO细胞、杂交瘤人细胞等；所述的植物细胞选自有经济价值的植物细胞等。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果
现在有贴壁习性的动物细胞大规模培养过程中都釆用微载体、微囊或 中空纤维作培养细胞的贴粘支架，以上物质在培养过程中有两个关键性要 素对生产成本产生负面影响微载体在培养完成后，要丢弃并更新，增加 了生产成本；在生产过程先要洗脱微载体，使细胞与微载体分离，再纯化， 生产过程更复杂，成本更高。其它如微囊和中空纤维，也存在类同的问题。 采用本发明的技术，生产过程更简单，不需要洗脱、分离和纯化，生产使 用的设备更简单，生产成本更低。
采用本发明技术可以解决现有大规模培养中许多技术难题1.动物 293HEK (解除从贴壁驯化到悬浮过程中)；2.细胞结团问题；3.延长细 胞的生长时间，增加生长的密度，细胞产量大量增加，制品的表达量大量 增加，产品的活性增强，可进行商业化生产。
图1 (1)是Alanine (丙氨酸)；
图1 (2)是Arginine (精氨酸)；
图1 (3)是Asparagine (天门冬酰胺);
图1 (4)是Aspartic acid (天门冬氨酸)；
图1 (5)是Cysteine (半胱氨酸)；
图1 (6 )是Glutamine (谷氨酰胺)；
图1 (7)是Glutamic acid (谷氨酸)；
图1 (8)是Glycine (甘氨酸)；
图1 (9)是Isoleucine (异亮氨酸)；
图1 (10)是Leucine (亮氨酸)；
图1 (11)是Lysine (赖氨酸)；
图1 (12)是Methionine (蛋氨酸)；
图1 (13)是Phenylalanine (苯丙氨酸)；
图1 (14)是Proline (脯氨酸)；图1 (15)是Serine (丝氨酸)；
图1 (16)是Threonine (苏氨酸)；
图1 (17)是Tryptophan (色氨酸)；
图1 (18)是Tyrosine (酪氨酸)；
图1 (19)是Valine (缬氨酸)；
图1 (20)是Histidine (组氨酸)。
图2 (a)和图2 (b)是本发明实施例中的干细胞培养生长状态图片。
图3 (a)和图3 (b)是本发明实施例中的干细胞染色状态的图片。
具体实施例方式
下面参照实施例，更具体地说明本发明内容。应当理解，下面的实施 例用于说明本发明的内容，而非限定本发明的内容，任何形式上的变动和/ 或变通，将落入本发明的保护范围。 实施例1
自组装氨基酸多肽按培养器具的面积大小的比例(20: 1)，加在培养 液中，做为细胞培养的支架物用于细胞规模。HEK-293细胞生长过程中有 大部分细胞贴在支架物上，也有部分贴在培养瓶玻璃壁(如转瓶)上，观 察细胞生长在倒置显微镜下，同普通的贴壁细胞相同，等细胞长到需求的 量，再做转染，然后收集细胞。干细胞生长状态和染色状态见图2 (a)、 图2 (b)和图3 (a)、图3 (b)。可见，采用本方法所培养的细胞与本领 域常用方法所培养的细胞其形态基本相同。
权利要求
1、一种人工合成多肽在细胞大规模培养中作为支架物的应用。
2、 如权利要求l所述的应用，其特征在于，所述的多肽是一种合成的 人体氨基酸多肽。
3、 如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的多肽是丙氨酸、精 氨酸、天门冬酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、 异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨 酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸及组氨酸中的一种或几种。
4、 如权利要求l所述的应用，其特征在于，所述的多肽具有多层次螺 旋状结构，且所述的多肽是微小蛋白片段，是现有细胞培养系统支架物微 载体的1/1000。
5、 如权利要求l-4任意一项所述的应用，其特征在于，所述的细胞包 括动物细胞和植物细胞。
6、 如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的动物细胞选自人或 其它哺乳动物的各类干细胞、祖细胞、293HEK细胞、CHO细胞、杂交瘤 人细胞；所述的植物细胞选自有经济价值的植物细胞。
全文摘要
本发明公开一种人工合成多肽在细胞大规模培养中作为支架物的应用，所述的多肽是人工合成的氨基酸多肽，具有多层次螺旋状结构。采用本发明的技术，与现有技术相比，生产过程更简单，支架物不需要洗脱、分离和纯化，生产使用的设备更简单，生产成本更低。
文档编号C12N5/12GK101434933SQ200810177468
公开日2009年5月20日 申请日期2008年11月25日 优先权日2007年11月30日
发明者张云福, 裘建英 申请人:芮屈生物技术(上海)有限公司