专利名称：一种红曲属菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种红曲菌属菌株及该菌株制备功能性红曲的方法，属于微生 物发酵技术领域。
背景技术：
红曲是我国传统的药、食两用品，是用红曲霉菌在大米中发酵培养而成，其 使用距今已有一千多年的历史，在中药、酿酒、发酵食品、食用色素等方面有 着广泛的应用。我国古代明确记载红曲医疗功效的药书，可以追溯至元朝吴瑞 《日用本草》所叙之"红曲酿酒，破血行药势"。金元四大医家中最有名的朱丹溪 在其《本草衍义补遗》中记载"红曲，活血消食，健脾燥胃，治赤白痢，下水谷， 陈久者良"。根据中国传统医学的理论，红曲味甘性温，具调节血脂浓度的功 效。近年出版的《中药大辞典》将红曲的主要功能定义为"活血化瘀，健脾消食， 治产后恶露不尽，瘀滞腹痛，食积饱胀，赤白下痢及跌打损伤"。
随着人们生活水平的提高和人口的老龄化，高脂血症作为一种"富贵病"成为
危害人类健康的主要杀手。高脂血症主要表现为血清胆固醇TC、甘油三酯TG 升高，高密度脂蛋白胆固醇HDL-C降低、低密度脂蛋白LDL升高的一种全身 脂代谢异常。在胆固醇合成途径中，甲基戊二酰辅酶A (HMG-CoA)还原酶是 控制合成速度的关键酶，所以抑制这种酶的活性就能有效地减少或阻断人体内 胆固醇的合成，从而防治高脂血症。1979年日本学者远藤章首次从红色红曲霉 的代谢产物中发现具有抑制HMG-CoA还原酶活性的物质Monacolin K。 1985 年，美国科学家Goldstein和Brown进一步找出了 Monacolin K抑制胆固醇合成 的作用机理，并因此获得了诺贝尔奖。同年，远藤章又从红色红曲霉中分离出 与Monacolin K结构相似的其他活性成分，分别命名为Monacolin L、 X、 J， Dihydromevinolin禾口 Dihydromonacolin L。经临床验i正，这些Monacolins活性物 质均能有效降低胆固醇。
功能性红曲又称降脂红曲，是一种调脂有效成份Monacolin K (洛伐他汀， lovastatin)为0.4°/。以上的红曲米。研究表明，功能性红曲还含有大量不饱和脂 肪酸、甾醇、皂甙、异黄酮和MoncolinK同系物等多种降血脂、降低胆固醇、 抑制脂肪合成、提高机体免疫力的生理活性物质。红曲中的Y-氨基丁酸 (Y-GABA)还具有降低血压的功效。1995年，Blanc博士发现红曲霉能产生具有肾脏毒性的桔霉素(Citrinin)。 之后，为提高有应用价值的功能因子洛伐他汀的含量，同时减少或消除红曲产 品中的桔霉素，国内外的专家学者进行了大量的工作。保加利亚Rasheva等选育 了一株不产桔霉素紫色红曲霉突变体Went CBS 109.07。日本NIfflRA等筛选得 到一个新的聚酮体合成酶基因，将其应用于构建不产桔霉素的红曲霉菌株。江 南大学生物技术重点实验室筛选得到1株不产桔霉素、高产开环式洛伐他汀的 红曲霉9901菌，用这种菌固态发酵生产的红曲米洛伐他汀的含量可达llmg/g。 CN1065432公开了十九个红曲菌菌种以及用其发酵制备的红曲；CN1206341公 开了一种功能性红曲菌快速固体培养的方法，菌体培养28天时洛伐他汀的含量 可达1.6%; CN100386425公开了不含桔霉素的功能性红曲菌的培养方法； CN1908156筛选了一种红曲属新菌株，红曲中洛伐他汀含量15-30mg/g，桔霉素 小于等于100ppb。因此，寻找高产洛伐他汀而低产或不产桔霉素的红曲霉菌株 尤为必要。
发明内容
本发明涉及一株由酒曲中分离得到的经诱变筛选的高产洛伐他汀的红曲霉 变异株，命名为紫红曲(MonascusPurpureus) 9798-0802。本发明还提供了由该 菌株固体发酵生产功能性红曲的方法，及所得制品。
本发明的目的是提供一种利用紫红曲9798-0802发酵生产功能性红曲的方 法，使红曲霉的功能性代谢产物洛伐他汀高产，不产或低产桔霉素。本发明还 提供了一种功能性红曲，其特征是洛伐他汀的含量4-25mg/g,桔霉素含量小于 等于50ppb。
具体地，本发明的高产洛伐他汀的红曲霉变异株命名为紫红曲(Monascus Purpureus) 9798-0802，该菌株于2008年9月16日保藏于中国微生物菌种保藏 委员会普通微生物中心(北京)，保藏号为CGMCC2668。
本发明的菌株紫红曲9798-0802 (CGMCC2668)具有以下微生物学特性
1、 形态学的特性在显微镜下观察在固体培养基中培养的菌株时，菌丝体 有隔，分枝，为多细胞结构，内含少量浅色油滴。直径4.5-6.8um，分生孢子多 单生，洋梨形或近球形；子囊壳无色，透明，近球形，直径18-30mn，壳壁较厚， 上有附属丝，2-2.5um，少数子囊壳内有色素呈红色，子囊壳内子囊孢子生成欠 佳。子囊孢子卵圆形，光滑无色或淡红色，5.2-6.5x4-5um。
2、 培养学的特性该菌株在麦芽汁琼脂平板上3(TC培养，菌落蔓延生长，呈毡绒状、较平坦，有少量辐射纹，白色，气生菌丝稀疏。菌丝体初期为玉粉
白色，老熟后为石榴水红。基内菌丝淡橙红色。在PDA上3(TC培养，菌落薄绒 状，浅粉红色，较平坦。在CYA培养基上生长时，形成的菌落稀薄，平坦，欠 规则，呈玉粉红色。在以上培养基中没有分泌物及色素形成。
由紫红曲9798-0802发酵生产功能性红曲的方法，其特征在于分高温和低温 发酵培养红曲霉，从而达到提高其代谢洛伐他汀的能力，包括如下步骤
a、 菌种培养
紫红曲9798-0802作为生产用种子，30 4(TC温度下在麦芽汁琼脂培养基 或PDA琼脂培养基中培养3 15天后，经种子培养基培养3 6天作为一级种 子或发酵罐种子液；
b、 发酵培养基制备
发酵培养基按重量比包括淀粉质原料60-85%、大豆蛋白1-10%、糖类或 含糖物质5-15%、酵母0.5-2%;
淀粉质原料和大豆蛋白一起用水浸泡或直接加水蒸煮，然后加入发酵培养 基剩余组分，搅拌均匀后高温灭菌，得到发酵培养基；
c、 生产发酵
所述发酵培养基冷却至4(TC以下接种，接种量为10-30wt%;装入发酵皿， 于35 4rC高温室培养3-5天；待菌丝布满整个培养基，进低温室18 22"C培 养8-20天；发酵产物经烘干、无菌碾粉，得到本发明的功能性红曲。
作为优化，步骤a所述的种子培养基每升含营养肉汤5g，月桂蛋白胨lg， 白糖9.5g， MgSO40.1 g， KH2PO42.0g， NaNO30.15 g，其余为水，用醋酸调节 pH为4.0。
作为优化，步骤b所述的淀粉质原料于12rC灭菌半个小时后冷却至40°C
以下接种。
作为优化，步骤b所述的发酵培养基组成按重量比是淀粉质原料70-85%、 大豆蛋白2-8%、白糖5-12%、酵母0.5-2%、 7_R6-10%。
作为优化，步骤b所述的发酵培养基配方中，淀粉质原料可以是大米、小 米、大麦、玉米中的一种或一种以上。
作为优化，步骤c所述的接种量为20-25wty。。
上述方法制备的功能性红曲，其特征在于洛伐他汀的含量4-25mg/g，含 桔霉素小于等于50ppb，并且可以按照常规的药物制备工艺，直接用于制备各种片剂、胶囊或液体制剂等。
本发明提供的利用紫红曲9798-0802发酵生产的功能性红曲同时具有洛伐 他汀含量高，不产桔霉素或桔霉素产量极微的特点。与市售用于降血脂的他汀 类药物相比，多种活性成分具有协同作用，可同时降血脂、降血压、降胆固醇, 起到综合防治高脂血症及其相关的心脑血管疾病的目的，具有疗效好、安全性 高、价格低等优势。
本发明提供的利用紫红曲9798-0802发酵生产功能性红曲的方法分高、低温 培养红曲霉，可提高其代谢洛伐他汀的能力，所制备的功能性红曲中洛伐他汀 最高可达2.5mg/g。该工艺周期短，效率高，成本低廉，易于操作。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例l:
1、 本发明使用紫红曲9798-0802菌株，在麦芽汁琼脂培养基中38。C培养360h 后，再经种子培养基35'C培养120h作为发酵罐种子液。
种子培养基配方营养肉汤5%，月桂蛋白胨1%，白糖9.5%， MgSO40.1%， KH2PO42.0%， NaNO30.15%，其余为水，用醋酸调节pH为4.0。
2、 发酵培养基配方大米60%，大豆蛋白10%，蔗糖15%，酵母0.5%，牛 肉膏4%，水10.5%。
3、 大米、大豆蛋白用水浸泡lh后蒸煮，添加蔗糖、酵母、牛肉膏、水后105°C 灭菌90min，冷却至3(TC以下接种液体菌种，接种量为10 wt %。
4、 在40'C高温室内发酵培养5天，入19'C低温室继续培养10天。
5、 将培养物高温灭菌，8(TC降压烘干，得到本发明的功能性红曲。用 HPLC法测定洛伐他汀的含量为8.2mg/g。桔霉素含量为40.2ppb，测定方法见功 能性红曲米行业标准(QB/T2847-2007)，下同。
实施例2:
1、 本发明使用紫红曲9798-0802菌株，在PDA琼脂培养基中35'C培养260h 后，经种子培养基35i:培养90h作为一级种子，在38'C培养60h作为二级种子。 种子培养基配方同实施例l。
2、 发酵培养基配方大米25%，小麦60%，大豆蛋白1%，糖蜜8%，牛肉 膏4%，水2%。
3、 大米、小麦、大豆蛋白用水浸泡2h后蒸煮，添加糖蜜、牛肉膏、水后121°C
6灭菌30min，冷却至28'C以下接种液体菌种，接种量为20wtM。
4、 在38'C高温室内发酵培养4天，入2(TC低温室继续培养15天。
5、 将培养物高温灭菌，8(TC降压烘干，得到本发明的功能性红曲。洛伐他 汀的含量为20.5mg/g，桔霉素含量为48.4ppb。
实施例3:
1、 本发明使用紫红曲9798-0802菌株，在PDA琼脂培养基中35'C培养320h 后，经种子培养基35'C培养90h作为一级种子，在38t:培养60h作为二级种子。 种子培养基配方同实施例l。
2、 发酵培养基配方大米73%,大豆蛋白6%，白糖10%，酵母1%，水10%。
3、 大米、大豆蛋白用水浸泡1.5h后蒸煮，添加白糖、酵母、水后ll(TC灭 菌60min，冷却至28""C以下接种液体菌种，接种量为28 wt %。
4、 在38t:高温室内发酵培养5天，入2(TC低温室继续培养13天。
5、 将培养物高温灭菌，8(TC降压烘干，得到本发明的功能性红曲。洛伐他 汀的含量为13.6mg/g,桔霉素含量为43.1ppb。
实施例4:
1、 本发明使用紫红曲9798-0802菌株，在麦芽汁琼脂培养基中38。C培养260h 后，经种子培养基35。C培养100h作为发酵罐种子液。种子培养基配方同实施例
lo
2、 发酵培养基配方小麦60%，麦麸10%,大豆蛋白8%，白糖12°/。，酵 母0.5%，水9.5%。
3、 小麦、麦麸、大豆蛋白用水浸泡lh后蒸煮，添加白糖、酵母、水后高温 蒸汽灭菌20min,冷却至28t:以下接种液体菌种，接种量为30wt。/。。
4、 在4rC高温室内发酵培养3天，入19"C低温室继续培养12天。
5、 将培养物高温灭菌，8(TC降压烘干，得到本发明的功能性红曲。洛伐他 汀的含量为11.7mg/g，桔霉素含量为47.6ppb。
实施例5:
1、 本发明使用紫红曲9798-0802菌株，在PDA琼脂培养基中35'C培养260h 后，经种子培养基35。C培养90h作为一级种子，在38。C培养60h作为二级种子。 种子培养基配方同实施例l。
2、 发酵培养基组成按重量比是大米25%，糙米20%，大麦40%，大豆蛋 白2%，白糖5%，酵母2%，水6%。3、 大米、糙米、大麦和大豆蛋白用水浸泡2h后蒸熟，添加白糖、酵母、水 后12rC灭菌30min，冷却至28°C以下接种液体菌种，接种量为25wt%。
4、 在38。C高温室内发酵培养4天，入2(TC低温室继续培养15天。
5、 将培养物高温灭菌，8(TC降压烘干，得到本发明的功能性红曲。洛伐他 汀的含量为25.0mg/g，桔霉素含量为46.9ppb。
实施例6:
1、 本发明使用紫红曲9798-0802菌株，在PDA琼脂培养基中35。C培养260h 后，经种子培养基35-C培养90h作为一级种子，在38'C培养60h作为二级种子。
种子培养基配方同实施例l。
2、 发酵培养基组成按重量比是小米25%，大米50%，大豆蛋白1%，麦芽 糖5%，酵母1%，牛肉膏3%，蛋白胨7%，水8%。
3、 大米、小米和大豆蛋白用水浸泡2h后蒸熟，添加麦芽糖、酵母、牛肉膏、 蛋白胨、水后121 r灭菌30min，冷却至28"C以下接种液体菌种，接种量为25wt%。
4、 在38'C高温室内发酵培养4天，入2(TC低温室继续培养15天。
5、 将培养物高温灭菌，8(TC降压烘干，得到本发明的功能性红曲。洛伐他 汀的含量为15.0mg/g，桔霉素含量为46.0ppb。
实施例7:
1、 本发明使用紫红曲9798-0802菌株，在PDA琼脂培养基中35。C培养260h 后，经种子培养基35'C培养90h作为一级种子，在38。C培养60h作为二级种子。 种子培养基配方同实施例l。
2、 发酵培养基组成按重量比是玉米80%，大豆蛋白5%,白糖10%，酵母 1%，水4%。
3、 玉米和大豆蛋白用水浸泡2h后蒸熟，添加白糖、酵母、水后115。C灭菌 50min，冷却至28。C以下接种液体菌种，接种量为20wt%。
4、 在38'C高温室内发酵培养4天，入2(TC低温室继续培养15天。
5、 将培养物高温灭菌，8(TC降压烘干，得到本发明的功能性红曲。洛伐他 汀的含量为16.2mg/g，桔霉素含量为43.9ppb。
实施例8:
1、本发明使用紫红曲9798-0802菌株，在PDA琼脂培养基中35。C培养260h 后，经种子培养基35t:培养卯h作为一级种子，在38'C培养60h作为二级种子。 种子培养基配方同实施例l。2、 发酵培养基组成按重量比是小米72%，大豆蛋白8%，白糖10%，酵母 2%，水8%。
3、 小米和大豆蛋白用水浸泡1.5h后蒸熟，添加白糖、酵母、水后121'C灭 菌30min，冷却至28'C以下接种液体菌种，接种量为25wt%。
4、 在38'C高温室内发酵培养4天，入2(TC低温室继续培养15天。
5、 将培养物高温灭菌，80。C降压烘干，得到本发明的功能性红曲。洛伐他 汀的含量为24.2mg/g，桔霉素含量为45.3ppb。
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权利要求
1、一种红曲属菌株，命名为紫红曲(Monascus Purpureus)9798-0802，由中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC 2668。
2、 一种根据权利要求l所述的菌株制备功能性红曲的方法，包括如下步骤:a、 菌种培养紫红曲9798-0802作为生产用种子，30 4(TC温度下在麦芽汁琼脂培养基或PDA琼脂培养基中培养3 15天后，经种子培养基培养3 6天作为一级种子或发酵罐种子液；b、 发酵培养基制备发酵培养基按重量比包括淀粉质原料60-85%、大豆蛋白1-10%、糖类或含糖物质5-15°/。、酵母0.5-2%;淀粉质原料和大豆蛋白一起用水浸泡或直接加水蒸煮，然后加入发酵培养基剩余组分，搅拌均匀后高温灭菌，得到发酵培养基；c、 生产发酵所述发酵培养基冷却至4(TC以下接种，接种量为10-30wt%;装入发酵皿，于35 4rC高温室培养3-5天；待菌丝布满整个培养基，进低温室18 22。C培养8-20天；发酵产物经烘干、无菌碾粉，得到本发明的功能性红曲。
3、 根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤a所述的种子培养基每升含营养肉汤5g，月桂蛋白胨lg，白糖9.5g， MgSO40.1 g， KH2PO42.0g， NaN030.15 g，其余为水，用醋酸调节pH为4.0。
4、 根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤b所述的淀粉质原料于12rC灭菌半个小时后冷却至4(TC以下接种。
5、 根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤b所述的发酵培养基组成按重量比是淀粉质原料70-85%、大豆蛋白2-8%、白糖5-12%、酵母0.5-2%、水6-10%。
6、 根据权利要求2或5所述的方法，其特征在于步骤b所述的发酵培养基配方中，淀粉质原料可以是大米、小米、大麦、玉米中的一种或一种以上。
7、 根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤c所述的接种量为20-25wt%。
8、 一种根据权利要求2所述的方法制备的功能性红曲，其特征在于洛伐他汀的含量4-25mg/g，含桔霉素小于等于50ppb。全文摘要
本发明公开了一株由酒曲中分离到的经诱变筛选获得的高产洛伐他汀的红曲霉变异株，命名为紫红曲(Monascus Purpureus)9798-0802。本发明同时提供利用该菌株制备功能性红曲的方法及其产品。此种功能性红曲的洛伐他汀含量高达25mg/g，桔霉素含量小于等于50ppb。本发明提供的功能性红曲可用于治疗高脂血症及其相关的心脑血管疾病，长期服用无临床意义上的副作用。本发明提供的功能性红曲的生产工艺分高、低温培养红曲霉，可提高其代谢洛伐他汀的能力，并且工艺简单、成本低廉、易于操作。
文档编号C12N1/14GK101475912SQ200810181529
公开日2009年7月8日 申请日期2008年11月20日 优先权日2008年10月13日
发明者丁予章 申请人:丁予章