专利名称：一种硝化细菌16SrDNA的荧光原位杂交检测方法
技术领域：
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本发明涉及分子生态学领域和环境微生物领域，具体的说涉及硝化细菌16srDNA的荧 光原位杂交技术。
背景技术：
FISH技术可以实现同步显影、鉴定、计算和单个微生物细胞的固定。其突出特点是可 以克服纯培养的技术限制，可以在原位水平进行探测和分析生物处理工艺系统中微生物群 落的组成及演替，以及不同种群的空间联系等生态学变化规律。20世纪90年代以来，FISH 技术在国外已被广泛应用于硝化细菌的快速检测中。利用硝化细菌特异性的靶寡核苷酸探 针，在原位检测水环境或生物膜上的硝化细菌时，不仅能对它们定性地检测，而且还能定 量地反映出环境中硝化细菌的分布和量，为研究硝化系统中硝化细菌类群的空间和数量分 布提供了有效的检测手段。
由于硝化细菌的生长易受温度、pH、溶氧和一些化学因子等环境因素的抑制，且生长 时往往附着在不溶性固体颗粒或器壁表面上，粘连在一起给分离检测工作带来不便。而目 前通用的荧光原位杂交技术由于不能确定检测硝化细菌的最适温度、pH和杂交时间，并且 未能解决硝化细菌生长易粘连的难题，因此不能对硝化细菌的时间和空间分布做出精确定 位
发明内容
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本发明的目的在于够克服由于硝化细菌生长缓慢，长成的菌落细小，容易聚集成团造 成难以观察计数的困难，提供一种能对环境中硝化细菌时间和空间的数量分布分布进行精 确到种属的荧光原位杂交检测方法。
本发明的目的通过如下技术方案实现
一种硝化细菌16SrDNA的荧光原位杂交检测方法，其特征在于包括如下步骤
(1) 玻片进行处理:对玻片进行清洗，硅化处理，以及明胶涂片制备；
(2) 样品的采集及预处理取硝化细菌原始菌液，离心去上清后加入等体积培养基， 通入空气，活化1一2天，用去离子水稀释至10—2-10—5倍，随后离心，弃上清液，加入5ml 磷酸盐缓冲液PBS，充分摇匀分散，取10 u 1分散后的菌液涂至玻片上，调节pH至6. 0-7. 0，再将玻片放置到烘箱内热固定，时间一般为l-3h，再用质量比为4免的多聚甲醛PFA室温下 固定10-20min,冲洗风干；最后将固定后的样品用乙醇脱水3-5min;
(3) 杂交是以16SrDNA作为靶DNA进行荧光原位杂交将NIT3探针用HEX标记，将 CNIT3探针与标记荧光的NIT3探针与杂交液混合于载玻片上在杂交盒内进行杂交反应，杂 交温度控制在46。C-48°C，杂交时间为2-3h，杂交后用洗脱液清洗探针；
(4) 荧光显微镜观察载玻片在荧光显微镜下观察，计数硝化细菌菌体个数。 为进一步实现本发明的目的，所述步骤(1)玻片进行清洗是指用热肥皂水刷洗，自来
水冲洗多次，％%酒精浸泡，灼烧，然后在1% (质量)盐酸中浸泡24h以上，用自来水冲洗， 去离子水洗3-5次。
所述步骤(1)硅化处理是指玻片和盖玻片在1%(质量)盐酸中煮沸10min,去离子水洗， 烘干，锡纸包好4°C以下保存备用。
所述步骤(3) NIT3探针序列为5' -CCTGTGCTCCATGCTCCG-3'的18个核苷酸的寡 核苷酸序列，探针在5' —端用HEX标记；CNIT3探针序列为5' — CCTGTGCTCCAGGCTCCG 一 3，。
所述步骤(3)清洗探针是将杂交盒中取出的载玻片放入48 'C杂交洗脱液,洗脱液中 NaCl浓度控制为60鹏ol/L。
本发明所采用的荧光原位杂交方法，具有如下优点
1、 本发明对荧光原位杂交中预处理条件和杂交反应条件的发明，大大提高了环境中硝 化细菌数量以及分布检测的精确性和时效性。
2、 可用于绘制高精度的硝化细菌生长曲线，直接应用于环境中硝化细菌生长状态的检 测，直接指导了废水处理中投加硝化细菌的时间控制。
3、 大大提高了硝化细菌DNA荧光原位杂交的分辨率。
图1为实施例利用荧光显微镜观察到的杂交效果图。
具体实施例方式
以下实施例用于对本发明作进一步的说明，但不用来限制本发明的范围。 实施例h
1、玻片处理
(1)玻片清洗热肥皂水刷洗，自来水冲洗5次，96%酒精浸泡，灼烧，然后在1%(质 量)盐酸中浸泡24h，自来水冲洗4次，去离子水洗3-5次。
(2) 硅化处理玻片和盖玻片在rU质量)盐酸中煮沸10min,去离子水洗3次，50°C 烘干，锡纸包好4'C保存备用。玻片经过硅化处理后具有束水性，能有效防止细胞丢失。
(3) 明胶涂片制备将玻片放入明胶液中10min，然后6(TC烘干过夜备用。 明胶液配制称取明胶l.Og溶于500-800mlddH20中，加热搅拌助溶，待明胶完全溶
解后，加入甲明矾0.5g，溶解后稀释至1000ml即可使用。
2、 样品的釆集及预处理
(1) 取用以改善鱼虾塘水质量的硝化细菌菌液500ml，放置半小时使其沉淀，倒掉上 层液体，加入等体积新鲜配制培养基，通入空气，活化l一2天。所述的培养基配方为NaN02 0. 5g， KH2P04 0. 136g， MgS04 7H20 0. 14g NaCl 0. 3g， Na线1. 6g, FeS04 7H20 0. 03g， 蒸馏水1000ml 。
(2) 取活化后的硝化细菌菌液用去离子水稀释，取5ml样品稀释104倍，4000r/min 条件下离心，弃上清液，加入5ml磷酸盐缓冲液(PBS)，充分摇匀分散。取10ul分散后 的菌液涂至玻片上，用稀盐酸调节pH至6.0。
(3) 热固定将玻片放置到5(TC烘箱内热固定lh。
(4) 多聚甲醛固定热固定后，再用4y。多聚甲醛(pareforaldehyde， PFA)室温下固 定10min，用PBS室温冲洗，自然风干。
4。/o多聚甲酸(Pareforaldehyde, PFA): PFA 40g、 1. Omol/L的NaOH 100ml IOXPBS、用 稀盐酸调节pH至7. 0，定容至1000ml。 10XPBS是指PBS使用时稀释十倍。
(5) 脱水将固定后的样品，分别在50%、 80%及96%的乙醇中(乙醇浸没玻片即可) 室温下脱水3min，自然风干。
3、 杂交反应
NIT3是硝化细菌Nitrobacter a-proteobacteria的通用探针，能与硝化细菌的保守序列进 行碱基互补配对，检测出环境中的硝化细菌，序列为5' -CCTGTGCTCCATGCTCCG-3的 18个核苷酸的寡核苷酸序列，探针在5' —端用HEX标记。
竞争性探针CNIT3序列为5， 一 CCTGTGCTCCAGGCTCCG — 3',目的是与硝化细菌保守区 序列相似的的其他杂菌的DNA序列杂交，从而保证硝化细菌原位杂交的精确性。
NIT3和CNIT3探针各0. 5 u L与9. 6 ii L的杂交液混合于载玻片上在杂交盒内进行杂交 反应。反应时间为2h，杂交温度46'C。 4、探针的清洗
杂交盒中取出载玻片放入50ml 48 'C杂交洗脱液，洗脱液中NaCl浓度控制为
60mmol/L。 5、镜检
载玻片在荧光显微镜下观察，激发光经过3号滤光片，即绿色激发光。目镜放大倍数 为10，物镜放大倍数Mob为20。结果如图1所示，图1是镜检出与荧光探针杂交的硝化细 菌，放大200倍，图中可见，通过使用本发明确定的样品稀释度，样品菌液pH，样品热固 定时间，4%多聚甲醛固定时间，乙醇脱水时间，以及杂交温度和杂交时间，使得环境因素 对硝化细菌的生长抑制降至最低，杂交后带有荧光的硝化细菌在视野中非常明显，可以清 楚的数出视野中硝化细菌的数量，从而计算硝化细菌的分布情况，通过对视野中的菌体形 态观察，可以看出，通过本发明提供的荧光原位杂交条件得到的硝化细菌杂交率接近100%， 极大地提高了通过常规荧光原位杂交方法得到的杂交结果。并且无菌体凝结成团现象，改 变了以往荧光原位杂交技术对于硝化细菌的计数不能精确到菌体个数，只能数出凝结菌团 的弊端，本发明可以对硝化细菌的计数精确到菌体个数，解决了硝化细菌严重的菌团凝结 的难题。
后面实施例荧光显微镜观察到的图片与图1相似，不具体说明了。 实施例2:
1、 玻片处理
(1) 玻片清洗热肥皂水刷洗，自来水冲洗3次，96%酒精浸泡，灼烧，然后在1% (质 量分数)盐酸中浸泡24h，自来水冲洗5次，去离子水洗3-5次。
(2) 硅化处理玻片和盖玻片在1%(质量分数)盐酸中煮沸10min,去离子水洗3次， 5(TC烘干，锡纸包好4X:保存备用。玻片经过硅化处理后具有束水性，能有效防止细胞丢失。
(3) 明胶涂片制备将玻片放入明胶液中10min,然后6(TC烘干过夜备用。 明胶液配制称取明胶l.Og溶于500-800mlddH20中，加热搅拌助溶，待明胶完全溶
解后，加入甲明矾0.5g，溶解后稀释至1000ml即可使用。
2、 样品的采集及预处理
(1) 取用以改善鱼虾塘水质量的硝化细菌菌液500ml，放置半小时使其沉淀，倒掉上 层液体，加入等体积新鲜配制培养基，通入空气，活化l一2天。所述的培养基配方为NaN02 0. 5g， KH2P04 0. 136g， MgS04 7H20 0. 14g NaCl 0. 3g， NaHC03 1. 6g， FeS04 7H20 0. 03g， 蒸馏水1000ml 。
(2) 取活化后的菌液用去离子水稀释，取5ml样品稀释103倍，4000r/min条件下离 心，弃上清液，加入5mlPBS,充分摇匀分散。取10y 1分散后的菌液涂至玻片上，用稀盐
酸调节pH至7.0。
(3) 热固定将玻片放置到50。C烘箱内热固定3h。
(4) 多聚甲醛固定热固定后，4%多聚甲醛(pareforaldehyde,PFA)室温下固定20min， 用PBS室温冲洗，自然风干。
4免多聚甲醛(Pareforaldehyde，PFA): PFA 40g、 1. Omol/L的NaOH 100ml IOXPBS、用 稀盐酸调节pH至7.0，定容至1000ml
(5) 脱水将固定后的样品，分别在50%、 80%及96%的乙醇中室温下脱水5min (乙 醇浸没玻片即可)，自然风干。
3、 杂交反应
NIT3是硝化细菌Nitrobacter a-proteobacteria的通用探针，能与硝化细菌的保守 序列进行碱基互补配对，序列为5' -CCTGTGCTCCATGCTCCG-3的18个核苷酸的寡核苷
酸序列，探针在5' —端用HEX标记。
竞争性探针CNIT3序列为5' — CCTGTGCTCCAGGCTCCG — 3'，目的是与硝化细菌保守区
序列相似的的其他杂菌的DNA序列杂交，从而保证硝化细菌原位杂交的精确性。NIT3和
CNIT3探针各0.5wL与9.6uL的杂交液混合于载玻片上在杂交盒内进行杂交反应。反应
时间为3h，杂交温度47。C。
4、 探针的清洗
杂交盒中取出载玻片放入50ml 48 'C杂交洗脱液，洗脱液中NaCl浓度控制为 60mmol/L。
5、 镜检
载玻片在荧光显微镜下观察，激发光经过3号滤光片，即绿色激发光。目镜放大倍数为 10，物镜放大倍数Mob为20。放大200倍，图中可见杂交信号非常明显且无菌体凝结成团 现象。
实施例3: 1、玻片处理
(1) 玻片清洗热肥皂水刷洗，自来水冲洗多次，96%酒精浸泡，灼烧，然后在1% (质 量分数)盐酸中浸泡24h,自来水冲洗多次，去离子水洗3-5次。
(2) 硅化处理玻片和盖玻片在1%(质量分数)盐酸中煮沸10min,去离子水洗3次， 5(TC烘干,锡纸包好4'C保存备用。玻片经过硅化处理后具有束水性，能有效防止细胞丢失。(3)明胶涂片制备将玻片放入明胶液中10min,然后6(TC烘干过夜备用。明胶液配 制称取明胶1.0g溶于500-800mlddH20中，加热搅拌助溶，待明胶完全溶解后，加入甲 明矾0. 5g，溶解后稀释至1000ml即可使用。
2、 样品的采集及预处理
(1) 取用以改善鱼虾塘水质量的硝化细菌菌液500ml，放置半小时使其沉淀，倒掉上 层液体，加入等体积新鲜配制培养基，通入空气，活化l一2天。所述的培养基配方为NaN02 0. 5g， KH2P04 0. 136g， MgS04 7H20 0. 14g NaCl 0. 3g， Na跳1. 6g， FeS04 7H20 0. 03g， 蒸馏水1000ml 。
(2) 取活化后的菌液用去离子水稀释，取5ml样品稀释105倍，4000r/rain条件下离 心，弃上清液，加入5mlPBS，充分摇匀分散。取lOiil分散后的菌液涂至玻片上，用稀盐 酸调节pH至6.5。
(3) 热固定将玻片放置到5(TC烘箱内热固定2h。
(4) 多聚甲酸固定热固定后，4"/。多聚甲醛(pareforaldehyde，PFA)室温下固定15min， 用PBS室温冲洗，自然风干。
4。/o多聚甲醛(Pareforaldehyde，PFA): PFA 40g、 1. Omol/L的NaOH 100ml IOXPBS、用 稀盐酸调节pH至7.0，定容至1000ml
(5) 脱水将固定后的样品，分别在50%、 80%及96%的乙醇中室温下脱水5min (乙 醇浸没玻片即可)，自然风干。
3、 杂交反应
NIT3是硝化细菌Nitrobacter a -proteobacteria的通用探针，能与硝化细菌的保守 序列进行碱基互补配对，序列为5' -CCTGTGCTCCATGCTCCG-3的18个核苷酸的寡
核苷酸序列，探针在5' —端用HEX标记。竞争性探针CNIT3序列为5' —
CCTGTGCTCCAGGCTCCG — 3，，目的是与硝化细菌保守区序列相似的的其他杂菌的DNA
序列杂交，从而保证硝化细菌原位杂交的精确性。
NIT3和CNIT3探针各0. 5 y L与9. 6 u L的杂交液混合于载玻片上在杂交盒内进行杂交
反应。反应时间为3h，杂交温度48。C。
4、 探针的清洗
杂交盒中取出载玻片放入50ml 48 'C杂交洗脱液，洗脱液中NaCl浓度控制为 60鹏ol/L。
5、 镜检
载玻片在荧光显微镜下观察，激发光经过3号滤光片，即绿色激发光。目镜放大倍数为 10,物镜放大倍数Mob为20。放大200倍，图中可见杂交信号非常明显且无菌体凝结成团 现象。
实施例4:
1、 玻片处理
(1) 玻片清洗热肥皂水刷洗，自来水冲洗多次，96%酒精浸泡，灼烧，然后在1% (质 量分数)盐酸中浸泡24h，自来水冲洗多次，去离子水洗3-5次。
(2) 硅化处理玻片和盖玻片在1%(质量分数)盐酸中煮沸lOmin，去离子水洗3次， 5(TC烘干，锡纸包好4'C保存备用。玻片经过硅化处理后具有束水性，能有效防止细胞丢失。
(3) 明胶涂片制备将玻片放入明胶液中10min，然后6(TC烘千过夜备用。明胶液配 制称取明胶l.Og溶于500-800mlddH20中，加热搅拌助溶，待明胶完全溶解后，加入甲 明矾0. 5g，溶解后稀释至1000ml即可使用。
2、 样品的采集及预处理
(1) 取实验室富集培养的用以改善鱼虾塘水质量的硝化细菌菌液500ffll，放置半小时 使其沉淀，倒掉上层液体，加入等体积新鲜配制培养基，通入空气，活化1一2天。所述的 培养基配方为NaN02 0.5g， KH2P040, 136g， MgS04 *7仏0 0. 14g NaCl 0. 3g， NaHC031. 6g， FeS04 7H20 0. 03g，蒸馏水1000ml 。
(2) 取活化后的菌液用去离子水稀释，取5ml样品稀释102倍，4000r/min条件下离
心，
弃上清液，加入5mlPBS，充分摇匀分散。取10ul分散后的菌液涂至玻片上，用稀盐 酸调节pH至6.7。
(3) 热固定将玻片放置到5(TC烘箱内热固定2h。
(4) 多聚甲醛固定热固定后，4y。多聚甲醛(pareforaldehyde，PFA)室温下固定15min， 用PBS室温冲洗，自然风干。4免多聚甲醛(Pareforaldehyde,PFA): PFA 40g、 1. 0mol/L的 Na0H 100ml 10XPBS、用稀盐酸调节pH至7. 0，定容至1000ml
(5) 脱水将固定后的样品，分别在50%、 80%及96%的乙醇中室温下脱水4min (乙 醇浸没玻片即可)，自然风干。
3、 杂交反应
NIT3是硝化细菌Nitrobacter a-proteobacteria的通用探针，能与硝化细菌的保守序列进
行碱基互补配对，序列为5' -CCTGTGCTCCATGCTCCG-3的18个核苷酸的寡核苷酸序列， 探针在5' —端用HEX标记。
竞争性探针CNIT3序列为5， 一 CCTGTGCTCCAGGCTCCG — 3'，目的是与硝化细 菌保守区序列相似的的其他杂菌的DNA序列杂交，从而保证硝化细菌原位杂交的精确性。
NIT3和CNIT3探针各0.5 u L与9.6 u L的杂交液混合于载玻片上在杂交盒内进行杂交 反应。反应时间为3h，杂交温度45'C。
4、 探针的清洗
杂交盒中取出载玻片放入50ml 48 'C杂交洗脱液，洗脱液中NaCl浓度控制为 60mmol/L。
5、 镜检
载玻片在荧光显微镜下观察,激发光经过3号滤光片，即绿色激发光。目镜放大倍数为 10，物镜放大倍数Mob为20。放大200倍，图中可见杂交信号非常明显且无菌体凝结成团 现象。
权利要求
1、一种硝化细菌16SrDNA的荧光原位杂交检测方法，其特征在于包括如下步骤(1)玻片进行处理对玻片进行清洗，硅化处理，以及明胶涂片制备；(2)样品的采集及预处理取硝化细菌原始菌液，离心去上清后加入等体积培养基，通入空气，活化1-2天，用去离子水稀释至10-2-10-5倍，随后离心，弃上清液，加入5ml磷酸盐缓冲液PBS，充分摇匀分散，取10μl分散后的菌液涂至玻片上，调节pH至6.0-7.0，再将玻片放置到烘箱内热固定，时间一般为1-3h，再用质量比为4％的多聚甲醛PFA室温下固定10-20min，冲洗风干；最后将固定后的样品用乙醇脱水3-5min；(3)杂交将NIT3探针用HEX标记，将CNIT3探针与标记荧光的NIT3探针与杂交液混合于载玻片上在杂交盒内进行杂交反应，杂交温度控制在46℃-48℃，杂交时间为2-3h，杂交后用洗脱液清洗探针；以16SrDNA作为靶DNA进行荧光原位杂交。(4)荧光显微镜观察载玻片在荧光显微镜下观察，计数硝化细菌菌体个数。
2、 根据权利要求1所述的一种硝化细菌16SrDNA的荧光原位杂交检测方法，其特征在 于所述步骤(1)玻片进行清洗是指用热肥皂水刷洗，自来水冲洗多次，96%酒精浸泡，灼 烧，然后在1% (质量)盐酸中浸泡24h以上，用自来水冲洗，去离子水洗3-5次。
3、 根据权利要求1所述的一种硝化细菌16SrDNA的荧光原位杂交检测方法，其特征在 于所述步骤(1)硅化处理是指玻片和盖玻片在1%(质量)盐酸中煮沸10min，去离子水洗， 烘干，锡纸包好4°C以下保存备用。
4、 根据权利要求1所述的一种硝化细菌16SrDNA的荧光原位杂交检测方法，其特征在 于所述步骤(3) NIT3探针序列为5， -CCTGTGCTCCATGCTCCG-3的18个核苷酸的寡 核苷酸序列，探针在5， 一端用HEX标记；CNIT3探针序列为5' — CCTGTGCTCCAGGCTCCG 一 3，。
5、根据权利要求1所述的一种硝化细菌16SrDNA的荧光原位杂交检测方法，其特征在 于所述步骤(3)清洗探针是将杂交盒中取出的载玻片放入45'C-48'C的杂交洗脱液,洗 脱液中NaCl浓度控制为60mmol/L。
全文摘要
本发明公开了一种硝化细菌16SrDNA的荧光原位杂交检测方法，该方法先对玻片进行处理，然后对样品采集及预处理，再进行杂交，最后在荧光显微镜观察，计数硝化细菌菌体个数。其杂交是将NIT3探针用HEX标记，将CNIT3探针与标记荧光的NIT3探针与杂交液混合于载玻片上在杂交盒内进行杂交反应，杂交温度控制在46℃-48℃，杂交时间为2-3h，杂交后用洗脱液清洗探针。该发明可直接应用于硝化系统中硝化细菌的数量分布和空间分布的检测，直接指导了自然界以及人工条件下硝化细菌群落多样性的测定；大大提高了硝化细菌群落分布监测的精确度和时效性，本发明尤其适用于硝化细菌的荧光原位杂交。
文档编号C12Q1/06GK101348836SQ20081019830
公开日2009年1月21日 申请日期2008年8月31日 优先权日2008年8月31日
发明者星 张, 朱雅楠, 林炜铁, 周 王 申请人:华南理工大学