专利名称：一种利用植物细胞培养的生物转化方法
技术领域：
本发明涉及一种利用植物细胞培养的生物转化方法，特别涉及用转基因西洋 参冠瘿组织为催化体系，以青蒿酸，二氢青蒿酸等青蒿素生物合成途径的中间体 生物制造青蒿素类化合物的方法。
背景技术：
生物催化体系是迄今为止人类所知的最高效和最具有选择性的温和催化体 系。生物体中的酶以远远超出人们想像的速度催化各种生化反应。酶不仅在生物 体内，也能在生物体外促进天然的和人工合成的化学分子的诸多转化反应，并且 显示出优良的化学选择性、区域选择性和立体选择性。因此生物合成和生物转化 提供了许多常规化学方法不能或不易进行的化合物的合成方法。众多研究结果表 明，利用生物催化与转化体系可以合成和制备许多手性化学品和药物中间体。
转基因冠癭组织系由根癌农杆菌(J^ro/^cte/v'Mz ^/历e/acie/^)侵染植物 而形成。在根癌农杆菌侵染植物的过程中，所含Ti质粒上的T-DNA被整合到植 物细胞的基因组中，其中的生长素及细胞分裂素基因的表达产物即为冠瘿组织 (CroTOgall)。冠癭组织离体培养具有生长迅速、激素自主等优点。而且，细 胞以细胞团组成的颗粒状存在，具有人工固定化培养的优点，又免去人工载体的 使用以及诱导固定化培养的复杂过程；更重要的是由于冠瘿组织的细胞团中呈现 一定程度的分化，往往可以刺激次生代谢途径中表达某些关键酶的基因启动或者 为次生代谢物体提供一种分泌或存储的组织结构，通常比常规的悬浮培养细胞具 有更高且相对稳定的次生代谢物生产能力。目前已经获得的转基因药用植物的种 类还不多见，但是作为一种新型的培养系统，冠瘿组织无论在理论研究还是在实 际应用上都已显示出巨大潜力。20世纪90年代，本研究组利用植物转基因技术， 独家成功地实现了转基因西洋参冠瘿组织诱导，并相继系统地对其培养条件进行 了考察和筛选、转基因培养器官中皂苷类成分的分析和分离鉴定。
发明内容
本发明的目的是利用转基因西洋参冠瘿组织为催化体系，以青蒿酸，二氢青 蒿酸等青蒿素生物合成途径的中间体生物制造青蒿素类化合物。通过本发明的生 产方法制造青蒿素类化合物，可以不受季节的影响，且具有快速，高效的特点， 具有很大的工业应用前景。
本发明公开的利用植物细胞培养的生物转化方法，其特征在于包括以下几 个歩骤1.将青蒿素生物合成途径中的中间体类化合物溶解，加入到对数生长
期的转基因西洋参冠瘿组织中，共培养，抽滤，得到培养物和培养基;2.培养物 用有机溶剂超声提取，提取物减压蒸干，得浸膏I; 3.培养基用有机溶剂萃取， 萃取液减压蒸干，得浸膏II;4.合并两浸膏，分离出青蒿素类成分。
本发明是通过如下的技术方案来实现的。将二氢青蒿酸等中间体溶解，加入 到对数生长期的转基因西洋参冠瘿组织中，共培养一段时间，抽滤，得到培养物 和培养基。培养物用蒸馏水冲洗干净，于6(TC以下的条件烘干至恒重，粉碎，丙 酮超声提取，提取物减压蒸干，得浸膏I。培养基浓縮至适量，用乙酸乙酯萃取， 萃取液减压蒸干，得浸膏II，合并两浸膏，用硅胶柱层析分离，TLC薄层对照， 合并含有青蒿素的组分，用石油醚结晶即得青蒿素纯品。
具体实施例方式
下面结合实例，对本发明作进一步的描述。
实施例l取二氢青蒿酸，用无水乙醇溶解，在无菌的超净台中加入到培养 了十四天的转基因西洋参冠瘿组织悬浮培养液中，共培养两天，终止反应，抽滤， 得到培养物和培养基。培养物用蒸馏水冲洗干净，于55'C条件下烘干至恒重，粉 碎，用八倍丙酮超声提取三次,每次半小时，提取物减压蒸干，得浸膏I。培养基
浓缩至适量，用等量乙酸乙酯萃取，萃取液减压蒸干，得浸膏n，合并两浸膏，
用硅胶柱层析分离，TLC薄层对照，合并含有青蒿素的组分，用石油醚结晶即得 纯青蒿素。
实施例2取青蒿酸，用无水乙醇溶解，在无菌的超净台中加入到培养了十 四天的转基因西洋参冠瘿组织悬浮培养液中，共培养两天，终止反应，抽滤，得 到培养物和培养基。培养物用蒸馏水冲洗干净，于55。C条件下烘干至恒重，粉碎，
用八倍丙酮超声提取三次，每次半小时，提取物减压蒸干，得浸膏I。培养基浓縮
至适量，用等量乙酸乙酯萃取，萃取液减压蒸干，得浸膏n，合并两浸膏，用硅
胶柱层析分离，TLC薄层对照，合并含有青蒿素的组分，用石油醚结晶即得纯青 蒿素。
实施例3取青蒿素B，用无水乙醇溶解，在无菌的超净台中加入到培养了十 四天的转基因西洋参冠瘿组织悬浮培养液中，共培养两天，终止反应，抽滤，得 到培养物和培养基。培养物用蒸馏水冲洗干净，于55'C条件下烘干至恒重，粉碎， 用八倍丙酮超声提取三次，每次半小时，提取物减压蒸干，得浸膏I。培养基浓缩
至适量，用等量乙酸乙酯萃取，萃取液减压蒸干，得浸膏n，合并两浸膏，用硅
胶柱层析分离，TLC薄层对照，合并含有青蒿素的组分，用石油醚结晶即得纯青 蒿素。
实施例4取二氢青蒿酸，用无水乙醇溶解，在无菌的超净台中加入到培养 了十四天的转基因西洋参冠瘿组织悬浮培养液中，共培养两天，终止反应，抽滤， 得到培养物和培养基。培养物用蒸馏水冲洗干净，于55"C条件下烘干至恒重，粉 碎，用八倍体积氯仿超声提取三次，每次半小时，提取物减压蒸干，得浸膏I。培
养基浓缩至适量，用等量氯仿萃取，萃取液减压蒸干，得浸膏n，合并两浸膏，
用硅胶柱层析分离，TLC薄层对照，合并含有青蒿素的组分，用石油醚结晶即得 纯青蒿素。
权利要求
1.一种利用植物细胞培养的生物转化方法，其特征在于包括以下几个步骤(1)将青蒿素生物合成途径中的中间体类化合物溶解，加入到对数生长期的转基因西洋参冠瘿组织中，共培养，抽滤，得到培养物和培养基；(2)培养物以有机溶剂提取，提取物减压蒸干，得浸膏I；(3)培养基用有机溶剂萃取，萃取液减压蒸干，得浸膏II；(4)合并两浸膏，分离出青蒿素类成分。
2. 根据权利要求1的一种利用植物细胞培养的生物转化方法，其特征在于，所 述的青蒿素生物合成途径中的中间体类化合物为青蒿酸或二氢青蒿酸或青蒿素 B。
3. 根据权利要求1的--种利用植物细胞培养的生物转化方法，其特征在于，第 (2)步骤中所述的有机溶剂为丙酮，第(3)步骤中所述的有机溶剂为乙酸乙酯。
全文摘要
本发明公开了一种利用植物细胞培养的生物转化方法，其步骤包括将青蒿素生物合成途径中的中间体类化合物溶解，加入到对数生长期的转基因西洋参冠瘿组织中，共培养，抽滤，得到培养物和培养基；培养物丙酮超声提取，提取物减压蒸干，得浸膏I；培养基用乙酸乙酯萃取，萃取液减压蒸干，得浸膏II；合并两浸膏，分离出青蒿素类成分。利用本法生产青蒿素具有快速、高效的特点，具有很大的工业应用前景。
文档编号C12P17/18GK101353679SQ20081019865
公开日2009年1月28日 申请日期2008年9月22日 优先权日2008年9月22日
发明者于荣敏, 朱建华 申请人:于荣敏