专利名称：基于免疫分子的早期原发性肝癌病人术后转移复发的预测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基于免疫分子的早期原发性肝癌病人术后转移复发的预测试剂盒， 属于生物技术领域。
背景技术：
原发性肝细胞癌(简称肝癌)是我国第二位癌症死因，手术是目前早期肝癌主要的治 疗手段，然而术后高转移复发率(5年复发率达 70%)已成为进一步提高远期疗效的瓶 颈，也是攻克肝癌的重要关键。若能对肝癌根治术后的特定人群进行早期转移复发的预测， 及时给予干预治疗，做到早发现早治疗，会进一步提高根治性术后复发患者的生存率，也 会有重大的社会效益和经济效益，探索具有诊断价值的新型简易生物标记物必将极大延长 肝癌患者术后生存时间。
癌周微环境蛋白或基因表达对肿瘤发生及进展中的作用成为肿瘤研究的热点。许多研 究也显示癌周免疫因子的表达失衡与多种肿瘤进展相关，迄今已发现多种基因表达可以作 为肿瘤预后预测指标。然而，肝癌方面目前临床尚无足够敏感和特异的预测指标来预测肝 癌术后患者的转移复发以及生存情况，甲胎蛋白、肿瘤大小，包膜有无等虽与转移复发有 关但总体来说其预测准确率还很低。叶青海等应用含有9180个基因的细胞DNA芯片，研究 40例伴或不伴肝内转移的原发性肝癌原发瘤的基因表达谱，建立能准确区分有无肝内转移 的153个基因的分子预测模型，初步准确性90%。目前此模型由于涉及指标较多，较难临床 应用，在此基础上进一步探索17个免疫相关基因癌周表达水平可以预测肝癌预后。目前， 如何优化现有预测指标指导肝癌治疗仍然面临巨大挑战。实时荧光定量多聚酶链式反应 (PCR)技术有着成熟稳定，检测准确性高的特点，已经成为分子及细胞生物学研究的常 规手段，在肝癌转移及复发预测方面有很重要的应用价值。肝癌手术患者大多属于早期， 而预后判断的难点也在于此类病人，探索和开发具有预后生物标记物应用前景十分广阔。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于免疫分子的早期原发性肝癌病人术后转移复发的预测 试剂盒。
为了达到上述目的，本发明的技术方案是提供一种基于免疫分子的早期原发性肝癌病 人术后转移复发的预测试剂盒，其特征在于，包括白介素2扩增检测试剂、内参基因扩增检测试剂、正常肝组织对照品、阴性对照品、阳性对照品、无RNA酶水；
其中，所述白介素2扩增检测试剂由5-15mmol/L三羟甲基氨基甲垸盐酸盐、2. 0-3. 0mM 氯化镁，0. 3-0. 4pmol/ul三磷酸脱氧核糖核苷酸，0. 05-0. 15U/Taq酶,0. 3-0. 4pmol荧光 标记白介素2自身淬灭探针及引物，10-30u/ulRNA酶抑制剂和水组成；
内参基因扩增检测试剂由5-15mmol/L三羟甲基氨基甲垸盐酸盐、2. 0_3. 0mM氯化镁， 0. 3-0. 4pmol/ul三磷酸脱氧核糖核苷酸，0. 05-0. 15U/Taq酶，0. 3-0. 4pmol荧光标记3-磷 酸甘油醛脱氢酶基因自身淬灭探针及引物，10-30u/ulRNA酶抑制剂和水组成；
正常肝组织对照品为正常无癌肝组织cDNA;
阴性对照品为无mRNA水；
阳性对照品为正常人白细胞介素2mRNA样品；
无RNA酶水由以下方法制备将去离子水经O. lvoP/。焦炭酸二乙酯处理10-12小时， 110-130摄氏度高压灭菌20-35分钟。
本发明通过探针法多聚酶链反应检测癌周肝脏组织白细胞介素2信使核糖核酸(以下 简称白细胞介素信使核糖核酸)的表达，发现Thl型细胞因子，特别是白细胞介素2信使核 糖核酸作为一种可预测原发性肝癌病人手术后肝癌转移复发的生物标记物，可以成为早期 发现肝癌转移复发的筛查试剂，用于发展成包含该细胞因子的诊断试剂盒。
上述试剂盒可用来预测早期原发性肝癌病人手术后肝癌转移复发，特别针对早期肝癌 病人，其中早期定义为手术时单个肿瘤，无肉眼及镜下癌拴，无远处转移。其具体步骤为 收集早期肝癌患者癌周正常组织(病理学检验证实无脉管内癌拴)和作为对照的8例无肝 癌正常肝组织，摄氏-80度，低温保存。应用分子生物学常规方法抽提25mg组织总核糖核 酸，在液氮中将25mg组织碾磨成粉末，趁液氮尚未挥发光时，将粉末转移到1.5ml离心管 中，力tU.0ml的Trizol试剂(购自美国Invitrogen (英杰)生命技术有限公司)，充分混 匀放置15分钟，后加入200ul三氯甲垸，4'C， 12000转/分钟离心15分钟，吸取上清，加入 500ul异丙醇沉淀后，依商品说明进行得到总RNA，分光光度仪检测浓度。
2ug总RNA通过常规逆转录得到cDNA。正常组织通过同样方法获得相应cDNA，后混合 8例样品，形成正常对照品。所有常规试剂均有商品化试剂。应用实时荧光定量PCR仪 (ABI7900HT)检测白细胞介素2表达水平，GAPDH作为样品内参照。
所有探针引物均选用美国国立医学图书馆(NCBI)基因数据库(Genbank)人类IL2及 GADPH信使核糖核酸序列为模版设计。
以正常对照品基因表达水平作为衡量标准，肝癌病人白细胞介素2信使核糖核酸表达量除以此标准，从而确定肝癌病人白细胞介素2信使核糖核酸相对于正常人的表达比例， 其中大于或等于1为增高，小于1为降低，白细胞介素2信使核糖核酸表达增高的肝癌病 人术后2年内极易出现转移或复发及死亡。
本试剂盒每次检测均需设置阳性及阴性对照。
本试剂盒于零下20度可稳定储存1年，避免反复冻融。
试剂盒预测效果在66例患者的癌周组织中白细胞介素2信使核糖核酸能较准确地 预测肝癌患者术后的转移复发，白细胞介素2信使核糖核酸还可以预测肝癌患者术后的生 存或死亡。如图1和图2所示，癌旁组织白细胞介素信使核糖核酸、表达不同的患者有着 显著不同的预后(p〈0.05)，其中，图1中曲线l表示白细胞介素高表达，曲线2表示白 细胞介素低表达，图2中曲线1表示白细胞介素高表达，曲线2表示白细胞介素低表达。 本发明具有以下优点
1. 本发明首次提出白细胞介素2信使核糖核酸单独或与其它临床指标组合可成为肝癌 预后诊断的主要指标。
2. 白细胞介素2信使核糖核酸水平作为预测指标明显优于目前用于预测肝癌患者术 后复发和生存的临床指标，如甲胎蛋白、肿瘤大小，包膜有无等，而且测定此基因表达水 平简单易行可靠。
图1为白细胞介素2信使核糖核酸的无瘤生存曲线图； 图2为白细胞介素2信使核糖核酸的总生存曲线图。
具体实施例方式
下面结合实施例来具体说明本发明。
实施例l
一种基于免疫分子的早期原发性肝癌病人术后转移复发的预测试剂盒，包括白介素2 扩增检测试剂、内参基因扩增检测试剂、正常肝组织对照品、阴性对照品、阳性对照品、 无RNA酶水；
其中，所述白介素2扩增检测试剂由10mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、2. 5mM氯化镁， 0.35pmol/ul三磷酸脱氧核糖核苷酸，0. 10U/Taq酶，0. 35pmol荧光标记白介素2自身淬灭 探针及引物，20u/ulRNA酶抑制剂和水组成；
内参基因扩增检测试剂由10mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、2.5mM氯化镁， 0. 35pmol/ul三磷酸脱氧核糖核苷酸，0. 10U/Taq酶，0. 35pmol荧光标记3-磷酸甘油醛脱氢酶基因自身淬灭探针及引物，20u/ulRNA酶抑制剂和水组成； 正常肝组织对照品为正常无癌肝组织cDNA; 阴性对照品为无mRNA水； 阳性对照品为正常人白细胞介素2mRNA样品；
无RNA酶水由以下方法制备将去离子水经O. 1% (v/v)焦炭酸二乙酯处理ll小时，120 摄氏度高压灭菌30分钟。
早期肝癌患者于首次手术时，留取癌旁正常肝脏组织，摄氏-80度保存。参照分子生 物学常规方法，依商品化RNA抽提试剂及逆转录试剂说明抽提25mg癌旁正常肝脏组织 总RNA,逆转录生成cDNA产物。 试剂盒使用步骤
1. 吸取2ul上述逆转录产物后加入10ul本试剂盒中白介素2扩增检测试剂，后用试剂盒 提供无核糖核酸酶水补至25ul;备用，此混合物最好于12小时内使用。
2. 同时吸取2ul相同逆转录产物加入试剂盒提供内参基因扩增检测试剂10ul，后用试剂 盒提供无核糖核酸酶水补至25ul，备用；试剂盒内阳性对照品及阴性对照品分别吸取2ul 分别与10ul白介素2扩增检测试剂混合，后用试剂盒提供无核糖核酸酶水补至25ul。上 述混合液，均按相同步骤操作，加入96孔板中，每份肝脏组织样品设置三次重复对照。 上好样品的96孔板，应用美国应用系统生物公司ABI7900实时荧光定量仪扩增，条件为 95'C10分钟；95'C15秒、60°C1分钟共40循环。相同操作条件检测试剂盒内正常肝组织 对照品白细胞介素2表达量。根据循环数相对定量法计算癌旁白细胞介素2信使核糖核酸 表达，与正常对照品表达比较，确定上述基因表达变化趋势，表达降低则提示患者预后较 差，术后需加强监测，适当加以辅助治疗；表达增高提示患者预后较好，术后2年内不易 复发。
实施例2
一种基于免疫分子的早期原发性肝癌病人术后转移复发的预测试剂盒，包括白介素2 扩增检测试剂、内参基因扩增检测试剂、正常肝组织对照品、阴性对照品、阳性对照品、 无RNA酶水；
其中，所述白介素2扩增检测试剂由5mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、2. OmM氯化镁， 0.3pmol/ul三磷酸脱氧核糖核苷酸，0.05U/Taq酶，0. 3pmol荧光标记白介素2自身淬灭探 针及引物，10u/ulRNA酶抑制剂和水组成；
内参基因扩增检测试剂由5腿ol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、2.0mM氯化镁，
60. 3ptnol/ul三磷酸脱氧核糖核苷酸，0. 05U/Taq酶，0. 3pmol荧光标记3-磷酸甘油醛脱氢酶 基因自身淬灭探针及引物，10u/ulRNA酶抑制剂和水组成；
正常肝组织对照品为正常无癌肝组织cDNA;
阴性对照品为无mRNA水；
阳性对照品为正常人白细胞介素2mRNA样品；
无RNA酶水由以下方法制备将去离子水经O. lvoW焦炭酸二乙酯处理10小时，IIO摄 氏度高压灭菌20分钟。 操作步骤同实施例l。
实施例3
一种基于免疫分子的早期原发性肝癌病人术后转移复发的预测试剂盒，包括白介素2 扩增检测试剂、内参基因扩增检测试剂、正常肝组织对照品、阴性对照品、阳性对照品、 无RNA酶水；
其中，所述白介素2扩增检测试剂由15mmol/L三羟甲基氨基甲垸盐酸盐、3. OmM氯化镁， 0.4pmol/ul三磷酸脱氧核糖核苷酸，0. 15U/Taq酶，0. 4pmol荧光标记白介素2自身淬灭探 针及引物，30u/ul腦A酶抑制剂和水组成；
内参基因扩增检测试剂由15mmol/L三羟甲基氨基甲垸盐酸盐、3.0mM氯化镁， 0. 4pmol/ul三磷酸脱氧核糖核苷酸，0. 15U/Taq酶，0. 4pmol荧光标记3-磷酸甘油醛脱氢酶 基因自身淬灭探针及引物，30u/ulRNA酶抑制剂和水组成；
正常肝组织对照品为正常无癌肝组织cDNA;
阴性对照品为无mRNA水；
阳性对照品为正常人白细胞介素2mRNA样品；
无RNA酶水由以下方法制备将去离子水经O. lvoW焦炭酸二乙酯处理12小时，130摄 氏度高压灭菌35分钟。 操作步骤同实施例1。
权利要求
1. 一种基于免疫分子的早期原发性肝癌病人术后转移复发的预测试剂盒，其特征在于，包括白介素2扩增检测试剂、内参基因扩增检测试剂、正常肝组织对照品、阴性对照品、阳性对照品、无RNA酶水；其中，所述白介素2扩增检测试剂由5-15mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、2.0-3.0mM氯化镁，0.3-0.4pmol/ul三磷酸脱氧核糖核苷酸，0.05-0.15U/Taq酶，0.3-0.4pmol荧光标记白介素2自身淬灭探针及引物，10-30u/ulRNA酶抑制剂和水组成；内参基因扩增检测试剂由5-15mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、2.0-3.0mM氯化镁，0.3-0.4pmol/ul三磷酸脱氧核糖核苷酸，0.05-0.15U/Taq酶，0.3-0.4pmol荧光标记3-磷酸甘油醛脱氢酶基因自身淬灭探针及引物，10-30u/ulRNA酶抑制剂和水组成；正常肝组织对照品为正常无癌肝组织cDNA；阴性对照品为无mRNA水；阳性对照品为正常人白细胞介素2mRNA样品；无RNA酶水由以下方法制备将去离子水经0.1vol％焦炭酸二乙酯处理10-12小时，110-130摄氏度高压灭菌20-35分钟。
全文摘要
本发明提供了一种基于免疫分子的早期原发性肝癌病人术后转移复发的预测试剂盒，其特征在于，包括白介素2扩增检测试剂、内参基因扩增检测试剂、正常肝组织对照品、阴性对照品、阳性对照品、无RNA酶水。本发明的白细胞介素2基因信使核糖核酸表达量作为标志物，明显优于目前用于预测肝癌患者术后复发和生存的临床指标，可以作为早期肝癌患者预后判断生物标记物。
文档编号C12Q1/68GK101481732SQ20081020436
公开日2009年7月15日 申请日期2008年12月10日 优先权日2008年12月10日
发明者炯 史, 叶青海, 周海军, 贾户亮, 钦伦秀 申请人:复旦大学附属中山医院;复旦大学生物医学研究院