专利名称：：一种利用限制性内切酶防止pcr污染的方法
技术领域：
：本发明涉及检测领域，更具体地涉及一种利用限制性内切酶防止PCR污染的方法。
背景技术：
：PCR是分子生物学中扩增DNA片段的一种非常常用的方法，灵敏度极高。然而，PCR反应经常会出现污染，从而出现假阳性结果，这是PCR方法面临的最大的问题。—种常见的造成PCR假阳性的主要原因是PCR产物的污染。当一个实验室(如医院的实验室)多次或反复通过某一特定PCR反应进行检测(例如检测模板为受试者的基因组DNA)，那么会在阳性样品的PCR反应中获得正常的PCR产物。然而，这些阳性的PCR产物很可能残留在实验室中的桌面、容器、仪器、或其他地方，并在下次PCR反应的检测过程中混入PCR反应体系中，从而在原本阴性的样品中因为前一次PCR产物的污染而产生假阳性结果。目前常用的和主流的防止PCR污染的办法是UNG酶技术。该方法是在PCR体系中掺入dUTP，从而使得扩增得到的PCR产物中含有dUTP;然后，在后续的PCR体系中加入UNG酶，孵育一段时间后再进行PCR，因UDG可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可除去dU而阻止DNA聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力，因此可以消除由之前的PCR产物引起的污染。然而，此方法有两大缺陷一、由于dUTP不是DNA聚合酶的特异性底物，会大大降低PCR的效率，对长片段的扩增十分不利。二、带有dU的PCR产物不同于正常的DNA，会增加探针杂交、分子克隆等下游实验的难度和烦琐程度。因此，本领域迫切需要开发简便有效地防止PCR污染的方法。
发明内容本发明的目的就是提供一种简便有效地防止PCR污染的方法。在本发明的第一方面，提供了一种减少聚合酶链反应PCR假阳性的方法，包括步骤(a)将PCR反应体系在IIS型限制性内切酶的酶切温度下保温一段时间，从而使得所述的限制性内切酶消化反应体系中可能存在的污染物，其中，所述的PCR体系含有所述IIS型限制性内切酶；(b)灭活PCR反应体系中的所述的IIS型限制性内切酶，从而获得IIS型限制性内切酶被灭活的PCR反应体系；禾口(c)对步骤(b)获得的PCR反应体系进行PCR扩增，从而获得PCR扩增产物。在另一优选例中，所述的PCR扩增包括"变性-退火-延伸"的循环(通常为20-50个循环，较佳地为25-40个循环)。在另一优选例中，所述的污染物是在步骤(a)之前的PCR反应中所形成的、且与步骤(c)中获得的PCR扩增产物相同的扩增产物。在另一优选例中，在步骤(a)中，在酶切温度下的保温时间为5-60分钟，较佳地10-30分钟。在另一优选例中，所述的IIS型限制性内切酶选自下组AlwI、Bbs1、BbvI、BciV工、Bpm工、Bsa1、BsmA1、BsmF工、Eci工、Fok工、Hga工、Hph工、Mbo11、或MmeI。在另一优选例中，所述的IIS型限制性内切酶选自下组BbvI、Bpm1、BsmFI、EciI、FokI、HgaI或MmeI。在另一优选例中，所述的PCR体系中含有的PCR引物具有以下特征引物由3'端、5'端以及位于两端之间的中间区域所构成；引物的3'端为与模板特异性配对(或完全互补)的互补结合区域，互补结合区的长度为15-40个碱基(较佳地为18-30个碱基)，引物的中间区域为IIS型限制性内切酶识别位点，长度为4-6个碱基(更佳地为4-5个碱基)；禾口引物的5'端是IIS型限制性内切酶识别位点的保护区，长度为2-10个碱基(更佳地为3-6个碱基)。在另一优选例中，在步骤(b)中，灭活PCR反应体系中的所述的IIS型限制性内切酶是使得所述的PCR反应体系在60-9『C保持1-15分钟，从而使得不耐热的IIS型限制性内切酶被灭活。在另一优选例中，上述方法中的PCR反应体系是本发明第二方面中所述的PCR反应体系。在本发明的第二方面，提供了一种用于聚合酶链式反应PCR的反应体系，所述的反应体系含有以下组分PCR反应缓冲液；进行PCR反应的原料dATP、dTTP、dCTP和dGTP;正向引物和反向引物；耐热的PCR聚合酶IIS型限制性内切酶并且，其中PCR正向引物和反向引物具有以下特征引物由3'端、5'端以及位于两端之间的中间区域所构成；引物的3'端为与模板特异性配对或完全互补的互补结合区域，互补结合区的长度为15-40个碱基，较佳地为18-30个碱基，引物的中间区域为1IS型限制性内切酶识别位点，长度为4-6个碱基，更佳地为4-5个碱基；禾口引物的5'端是IIS型限制性内切酶识别位点的保护区，长度为2-10个碱基(更佳地为3-6个碱基)。在另一优选例中，所述的反应体系为溶液。更佳地，所述的反应体系中还含有待扩增的模板。更佳地，所述的模板为哺乳动物(如人)的基因组DNA。在本发明的第三方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒包括(i)容器，以及位于容器内的引物对，所述的引物对包括正向引物和反向引物，正向引物和反向引物具有以下5特征引物由3'端、5'端以及位于两端之间的中间区域所构成；引物的3'端为与模板特异性配对或完全互补的互补结合区域，互补结合区的长度为15-40个碱基，较佳地为18-30个碱基，引物的中间区域为1IS型限制性内切酶识别位点，长度为4-6个碱基，更佳地为4-5个碱基；禾口引物的5'端是IIS型限制性内切酶识别位点的保护区，长度为2-10个碱基(更佳地为3-6个碱基)；以及(ii)用于告诉用户按本发明第一方面中所述方法进行PCR检测从而减少聚合酶链反应PCR假阳性的说明书。在本发明的第四方面，提供了一种设计聚合酶链反应的引物的方法，包括步骤(a)根据待扩增的模板，确定待扩增区域所对应的核苷酸序列；(b)分析所述的核苷酸序列，并选择一种在所述核苷酸序列中不存在酶切位点的IIS型限制性内切酶；(c)根据所述的核苷酸序列和所述的IIS型限制性内切酶，设计具有以下特征的聚合酶链反应引物(包括PCR正向引物和/或反向引物)引物由3'端、5'端以及位于两端之间的中间区域所构成；引物的3'端为与模板特异性配对或完全互补的互补结合区域，互补结合区的长度为15-40个碱基，较佳地为18-30个碱基，引物的中间区域为1IS型限制性内切酶识别位点，长度为4-6个碱基，更佳地为4-5个碱基；禾口引物的5'端是IIS型限制性内切酶识别位点的保护区，长度为2-10个碱基(更佳地为3-6个碱基)。在另一优选例中，该方法还包括步骤(d):合成步骤(c)中所设计的引物。在另一优选例中，所述的IIS型限制性内切酶选自下组:AlwI、BbsI、Bbvl、BciVI、Bpm1、Bsa1、BsmA1、BsmF1、Eci1、Fok1、Hga1、Hph1、Mbo11、或MmeI。在另一优选例中，所述的IIS型限制性内切酶选自下组Bbv1、Bpm1、BsmFI、EciI、FokI、HgaI或MmeI。应理解，在本发明范围内，本申请上述以及下述的各技术特征可以各种方式进行组合，以构成各种优选例。例如，IIS型限制性内切酶识别位点的保护区的长度一般范围的下限2个碱基可以与优选范围的上限6个碱基进行组合，从而构成范围2-6个碱基。图1显示了本发明引物的结构示意图。图2显示了本发明方法的作用原理图。图3显示了本发明一个实例中的检测结果。具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了一种在不改变PCR反应体系和PCR产物属性的情况下，利用限制性内切酶，特异性识别位于在引物5'端的特定序列从而在进行PCR扩增之前将可能存在的PCR扩增产物污染物的3'端切断，以消除由PCR产物引起的污染。如本文所用，术语"本发明的限制性内切酶"或"IIS型限制性内切酶"可互换使用。如本领域所知晓的那样，ns型限制性内切酶指一类识别特定的核酸序列，但切口不在识别序列内而是在其外侧若干个(通常为卜20bp)碱基处的限制性内切酶。如本文所用，术语"PCR污染物"、"PCR污染产物"或"PCR扩增产物(污染物)"可互换使用，指前次或之前的PCR反应中所形成的、可能会导致假阳性的PCR扩增产物(污染物)。如本文所用，术语"前次"、"以前"或"之前"与PCR产物联用时，可互换使用，都指在本次PCR反应之前的任何一次PCR中所形成的PCR污染产物。简而言之，本发明是利用一类特殊的IIS型限制性内切酶来特异性切断PCR产物污染物中引物3'端结合的部分，使PCR引物不能结合从而消除污染。为了便于理解本发明，本发明人提供了以下基本原理。然而，应理解，本发明的保护范围并不受限于本发明的基本原理。参见图1和图2。本发明的基本原理是，在PCR引物的5'端加入IIS型限制性内切酶的识别位点，这一类酶识别特定的核酸序列，但切口不在识别序列内而是在其外侧若干个(通常为l至20bp)碱基处。应用时，在设计引物时，在引物的5'端增加一个酶的识别位点和保护碱基。这样，首次PCR反应会扩增获得PCR产物。然而该PCR产物可能成为后续PCR反应的污染物。因此，在进行后续的PCR时，在反应体系中加入识别所述位点的IIS型限制性内切酶，于第一次热变性之前孵育一段时间，从而使内切酶消化体系中可能混入的前次PCR产物(污染物)。然后，再进行新一轮的PCR(其中，在高温变性步骤中，不耐热的IIS型限制性内切酶被灭活)。因为本发明的限制性内切酶的切口在靠近引物的3'端(因而也靠近PCR污染物的两端)，在被本发明的限制性内切酶消化后，消化后的PCR污染物就不再含有与引物互补的长度足够长的结合区，因而不能在常规的退火温度下与引物有效结合，因此PCR引物也就不能以前次PCR产物(污染物)为模板进行延伸，从而有效的杜绝了PCR产物的污染问题。引物设计在设计引物时，在引物的5'端增加IIS型限制性内切酶识别位点和保护碱基，如图l所示，引物的3'端为常规的与模板特异性配对的区域，一般为18至30个碱基的，中间为IIS型限制性内切酶识别位点一般为4至6个碱基，最后5'端为3至4个保护碱基。由这样的引物扩增而得的PCR产物，其一个或两个末端含有内切酶识别位点。可用于本发明的IIS型限制性内切酶没有特别限制，可以是本领域中已知的或将来发现的各种IIS型限制性内切酶。代表性的IIS型限制性内切酶包括(但并不限于)下表中所列出的种类。表l:可用的内切酶表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>设计时宜按下面三个原则注意选择适当的限制性内切酶—是目的DNA片段内应无所选择的限制性内切酶的识别序列；二是酶切位置距离识别位点距离越远越好，至少5个碱基以上；三是内切酶在PCR体系里有较高活性和特异性。因此，特别优选的IIS型限制性内切酶是BbvI、BpmI、BsmFI、EciI、FokI、HgaI禾口MmeI。虽然在本发明中可以同时使用一种或多种IIS型限制性内切酶，但通常使用一种就足够了，而且使用一种11S型限制性内切酶时在成本上更为有利。在设计时，应当选用在目标扩增产物中原本没有识别位点的IIS型限制性内切酶。例如，如果PCR扩增产物中原本没有BpmI的识别位点，那么可以在引物5'端加上CTGGAG(BpmI识别位点)，然后在PCR第一次热变性之前加入BpmI于37。C孵育30分钟。酶切反应在本发明方法中，在进行PCR反应之前，用本发明相应的IIS型限制性内切酶对反应体系中可能存在的之前的PCR污染产物进行消化，从而消除假阳性。在本发明中，酶切反应的温度、时间等条件没有特别限制，可按本领域常规的条件进行。例如，对于20-100微升的PCR反应体系而言，通常在PCR反应体系中加入例如15U的IIS型限制性内切酶，在内切酶活性最佳的温度范围内(通常为内切酶的最佳温度士2t:内)孵育5-60分钟(较佳地10-30分钟)后，再进行PCR循环。当然，如果需要，还可适当的增加孵育时间(例如在污染较严重或怀疑存在严重污染的情况下)。PCR反应在本发明方法中，在用IIS型限制性内切酶酶切可能的PCR污染物之后，可先对内切酶进行灭活。一种优选的方法是升高PCR体系的温度，并在高温(如60-98°C，较佳地70-98°C，更佳地80-96°C)保温一段时间(如1_15分钟，较佳地2-10分钟，更佳地3_8分钟)，从而使得不耐热的IIS型限制性内切酶灭活。一种典型的灭活手段是在酶切反应后先95t:孵育5分钟，从而灭活内切酶。在IIS型限制性内切酶被灭活后，即可进行PCR反应。在本发明中，PCR反应的循环次数、温度、时间、酶用量等条件没有特别限制，可按本领域常规的PCR条件进行。换言之，在本发明方法中，PCR反应条件与常规PCR—样，无需作特别调整。在本发明的优选例中，PCR反应是在IIS型限制性内切酶和耐高温的聚合酶的优选pH范围内进行，例如在pH7.5-8.8范围中进行，较佳地在pH7.9_8.4范围中进行，以便IIS型限制性内切酶和耐高温的聚合酶(如Taq酶)都能够很好地工作。本发明的主要优点在于(a)本发明方法不改变PCR反应体系和PCR产物属性，便于进行后续的探针杂交、分子克隆等下游实验。(b)本发明方法对长片段的扩增较为有利。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYork:CoIdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1扩增人p53基因外显子-4序列人p53基因外显子-4的序列如SEQIDNO:1所示。tcccccttgccgtcccaagcaatggatgatttgatgctgtccccggacgatattgaacaatggttcactgaagacccaggtccagatgaagctcccagaatgccagaggctgctccccgcgtggcccctgcaccagcagctcctacaccggcggcccctgcaccagccccctcctggcccctgtcatcttctgtcccttcccagaaaacctaccagggcagctacggtttccgtctgggcttcttgcattctgggacagccaagtctgtgacttgcacg(SEQIDNO:1)注粗体部分为外侧引物结合位置，下划线部分为内侧引物结合位置在本实施例中，检测目的是以人的基因组DNA为模板，扩增人p53基因的外显子-4的片段。在本实施例中，鉴于SEQIDNO:1中无BpmI酶切位点，故选用IIS型限制性内切酶BpmI来防止PCR污染(当然，对于SEQIDNO:1而言，也可以选用IIS型限制性内切酶AlwI，BciVI，BsaI，BsmAI，HgaI，HphI，MmeI等)。1.设计引物外侧引物正向引物Primer-Fl:5'-TAACTGGAGCTTGCCGTCCCAAGCTG_3，(SEQIDNO:2)反向引物Primer-Rl:5'-ATACTGGAGGTGCAAGTCACAGAC77GGCTG-3，(SEQIDNO:3)下划线部分为Bpml酶识别位点Bpml酶切位点为5'…CTGGAG(N)w…3，3，...GACCTC(N)14...59因此，BpmI在SEQIDNO:2的斜体"AA"之间(在识别位点下游16个碱基处)和SEQIDN0:3的斜体"TT"之间进行切割。切割后，在PCR产物(污染物)的两端分别仅剩下5个和8个碱基的与引物结合(或咬合)的结合区，因此不能在常规的PCR退火温度下与SEQIDNO:2和3所示的引物有效结合。应注意，因为酶在DNA双链上切割的位置是错开的，即对于引物咬合的模板的互补链是切割在下游14碱基处，而对于引物所代表的DNA链来讲，才是切割在斜体标记的碱基中间。内测引物为了检测PCR污染物的确被IIS型限制性内切酶所消化，还设计合成了以下内侧引物。正向引物Primer-F2:5'-CAATGGATGATTTGATGCTGTC-3'(SEQIDNO:4)反向引物Primer-R2:5'-AGAAGCCCAGACGGAAACC-3，(SEQIDNO:5)内侧引物结合位置为外侧的Primer-Fl/Primer-Rl引物下游15bp以上的区域。:0109]2.配置PCR体系:0110]10XTaq缓冲液5ii1:0川]d證(各2.5mM):5ii1:0112]正向引物(SEQIDNO:2或4)氺(2iiM):1:0113]反向引物(SEQIDNO:3或5)*(2iiM):1:0114]模板2.0ill:0115]TaqDNA聚合酶(5U/ii1):0.5ii1:0116]BpmI(5U/ii1):0.5ii1:0117]ddH20:力瞎50iU*注在l-4号反应管中引物使用Primer-Fl/Primer-Rl，5号管引物使用内侧引物Primer-F2/Primer-R2。PCR反应体系的pH值为8.4。分别以含有人p53基因外显子-4片段的市售pSK-p53质粒(A)或稀释10000倍的前次PCR产物(B)(污染物)为模板，在体系中加入或者不加入Bpml进行PCR反应。3.反应参数<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>反应产物保存于4t:。当引物对是外侧引物Primer-Fl/Primer-Rl时，扩增产物长度为292bp。当引物对是内侧引物Primer-F2/Primer-R2时，扩增产物长度为225bp。4.电泳鉴定对PCR反应进行常规的电泳检测，结果如图3所示。图3中，泳道1-4都是用Primer-Fl/Rl扩增的产物，而5是用Primer-F2/R2扩增的产物。泳道1和2是以质粒为模板扩增的产物，都有明显条带，说明能够扩增出目的片段，并且BpmI不影响PCR反应。泳道3和4是以稀释10000倍的前次PCR产物为模板扩增的产物，模拟PCR污染的状况，其中泳道4为加入了BpmI处理，产物中没有条带，而3号样品没有加入BpmI处理，则扩增出了明显的条带，表明经BpmI处理后，消除了由前次PCR产物引起的污染。泳道5为使用内侧引物以稀释10000倍的前次PCR产物为模板，并且加入了BpmI处理后扩增的产物，有明显条带，证明BpmI只是切断了前次PCR产物的两端外侧引物结合的小片段，而不影响内部的片段，其可以被内侧引物扩增。上述结果表明，用IIS型限制性内切酶BpmI消化了前次PCR污染物后，可以有效地显著减少甚至消除PCR污染物所导致假阳性。实施例2扩增人p53基因外显子-4序列重复实施例l，不同点仅在于用常规方法抽提的人基因组DNA替换实施例1中的含有人p53基因外显子-4片段的市售pSK-p53质粒(A)。结果同样表明，用IIS型限制性内切酶BpmI消化了前次PCR污染物后，可以有效地显著减少甚至消除PCR污染物所导致假阳性。实施例3扩增人DAPK基因重复实施例2，不同点在于本实施例中检测对象是人DAPK基因，其长度为1707bp。因此，所用的IIS型限制性内切酶为FokI，所用的引物如下正向引物5'-ATTGGATGAGGTTGCCACGCTCCACTA-3，(SEQIDNO:6)反向引物5'-AATGGATGCGCCTCACTGGGAGCAATC-3，(SEQIDNO:7)下划线部分为FokI酶识别位点Fokl酶切位点为5'…GGATG(N)9…3'3，...CCTAC(N)13...5分别以常规方法抽提的人基因组DNA(A)或稀释10000倍的前次PCR产物(B)(污染物)为模板，在体系中加入或者不加入IIS型限制性内切酶FokI进行PCR反应。其中，PCR反应体系的pH值为8.4。结果表明，用IIS型限制性内切酶FokI消化了前次PCR污染物后，可以有效地显著减少甚至消除PCR污染物所导致假阳性。并且，对于长扩增产物而言，在添加了IIS型限制性内切酶并灭活后，对于长片段PCR产物的扩增几乎无影响(与未添加IIS型限制性内切酶的对照相比)，因此与常规的UNG酶技术相比，更为有利。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可11以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表〈110〉上海透景生命科技有限公司<120>—种新型的利用限制性内切酶防止PCR污染的方法〈130〉088289〈160>7〈170>PatentInversion3.5〈210>1〈211>279〈212〉DNA〈213〉智人(Homosapiens)〈400〉1tcccccttgccgtcccaagcaatggatgatttgatgctgtccccggacgatattgaacaa60tggttcactgaagacccaggtccagatgaagctcccagaatgccagaggctgctccccgc120gtggcccctgcaccagcagctcctacaccggcggcccctgcaccagccccctcctggccc180ctgtcatcttctgtcccttcccagaaaaccteccagggcagctecggtttccgtctgggc240ttcttgcattctgggacagccaagtctgtgacttgcacg279〈210>2〈211>28<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221>misc—feature〈223〉引物<400>2taactggagcttgccgtcccaagcaatg28〈210>3〈211>31〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉〈221>misc_feature〈223〉引物〈400>3atactggaggtgcaagtcacagacttggctg31〈210>4〈211>22〈212>DNA120185]〈213〉人工序列0186]〈220〉0187]〈221>misc_feature0188]〈223〉引物0189]〈400>40190]caatggatgatttgatgctgtc0191]〈210>50192]〈211>190193]〈212>DNA0194]〈213〉人工序列.0195]<220>:0196]〈221>misc_feature:0197]〈223〉引物:0198]〈400>5:0199]3g朋gccc3g3cgg朋acc:0200]〈210>6:0201]〈211>27:0202]〈212>DNA:0203]〈213〉人工序列:0204]〈220〉:0205]〈22l>misc—feature:0206]〈223〉引物〈400〉6attggatgaggttgccacgctccacta〈210>7〈211>27〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221>misc_feature〈223〉引物〈400>7aatggatgcgcctcactgggagc朋tc1权利要求一种减少聚合酶链反应PCR假阳性的方法，其特征在于，包括步骤(a)将PCR反应体系在IIS型限制性内切酶的酶切温度下保温一段时间，从而使得所述的限制性内切酶消化反应体系中可能存在的污染物，其中，所述的PCR体系含有所述IIS型限制性内切酶；(b)灭活PCR反应体系中的所述的IIS型限制性内切酶，从而获得IIS型限制性内切酶被灭活的PCR反应体系；和(c)对步骤(b)获得的PCR反应体系进行PCR扩增，从而获得PCR扩增产物。2.如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述的污染物是在步骤(a)之前的PCR反应中所形成的、且与步骤(c)中获得的PCR扩增产物相同的扩增产物。3.如权利要求l所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，在酶切温度下的保温时间为5-60分钟，较佳地10-30分钟。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的IIS型限制性内切酶选自下组AlwI、BbsI、BbvI、BciVI、BpmI、BsaI、BsmAI、BsmFI、EciI、FokI、HgaI、HphI、MboII、或MmeI。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的IIS型限制性内切酶选自下组BbvI、BpmI、BsmFI、EciI、FokI、HgaI或MmeI。6.如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述的PCR体系中含有的PCR引物具有以下特征引物由3'端、5'端以及位于两端之间的中间区域所构成；引物的3'端为与模板特异性配对或完全互补的互补结合区域，互补结合区的长度为15-40个碱基，较佳地为18-30个碱基，引物的中间区域为IIS型限制性内切酶识别位点，长度为4-6个碱基；禾口引物的5'端是IIS型限制性内切酶识别位点的保护区，长度为2-10个碱基。7.如权利要求l所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，灭活PCR反应体系中的所述的IIS型限制性内切酶是使得所述的PCR反应体系在60-9『C保持1-15分钟，从而使得不耐热的IIS型限制性内切酶被灭活。8.—种用于聚合酶链式反应PCR的反应体系，其特征在于，所述的反应体系含有以下组分PCR反应缓冲液；进行PCR反应的原料dATP、dTTP、dCTP和dGTP;正向引物和反向引物；耐热的PCR聚合酶IIS型限制性内切酶并且，其中PCR正向引物和反向引物具有以下特征引物由3'端、5'端以及位于两端之间的中间区域所构成；引物的3'端为与模板特异性配对或完全互补的互补结合区域，互补结合区的长度为15-40个碱基，较佳地为18-30个碱基，引物的中间区域为IIS型限制性内切酶识别位点，长度为4-6个碱基；禾口引物的5'端是IIS型限制性内切酶识别位点的保护区，长度为2-10个碱基。9.一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括(i)容器，以及位于容器内的引物对，所述的引物对包括正向引物和反向引物，正向引物和反向引物具有以下特征引物由3'端、5'端以及位于两端之间的中间区域所构成；引物的3'端为与模板特异性配对或完全互补的互补结合区域，互补结合区的长度为15-40个碱基，较佳地为18-30个碱基，引物的中间区域为IIS型限制性内切酶识别位点，长度为4-6个碱基；禾口引物的5'端是IIS型限制性内切酶识别位点的保护区，长度为2-10个碱基；以及(ii)用于告诉用户按本发明第一方面中所述方法进行PCR检测从而减少聚合酶链反应PCR假阳性的说明书。10.—种设计聚合酶链反应的引物的方法，其特征在于，包括步骤(a)根据待扩增的模板，确定待扩增区域所对应的核苷酸序列；(b)分析所述的核苷酸序列，并选择一种在所述核苷酸序列中不存在酶切位点的IIS型限制性内切酶；(c)根据所述的核苷酸序列和所述的IIS型限制性内切酶，设计具有以下特征的聚合酶链反应引物，所述的引物包括PCR正向引物和/或反向引物引物由3'端、5'端以及位于两端之间的中间区域所构成；引物的3'端为与模板特异性配对或完全互补的互补结合区域，互补结合区的长度为15-40个碱基，较佳地为18-30个碱基，引物的中间区域为IIS型限制性内切酶识别位点，长度为4-6个碱基；禾口引物的5'端是IIS型限制性内切酶识别位点的保护区，长度为2-10个碱基。全文摘要本发明提供了一种利用限制性内切酶防止PCR污染的方法。具体地，本发明方法包括步骤(a)将PCR反应体系在IIS型限制性内切酶的酶切温度下保温一段时间，从而消化反应体系中可能存在的污染物；(b)灭活IIS型限制性内切酶；和(c)对PCR反应体系进行退火-延伸-变性的循环，从而获得PCR扩增产物。本发明可简便有效地防止前次PCR产物所造成的污染。文档编号C12Q1/68GK101768629SQ200810208128公开日2010年7月7日申请日期2008年12月29日优先权日2008年12月29日发明者姚见儿,李久彤,白艳军,谈畅申请人:上海透景生命科技有限公司