专利名称：一种功能菌群在水处理系统中稳定性的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种功能菌群的检测方法。
背景技术：
随着我国经济的高速增长，城市化水平的不断提高，水污染问题日趋严峻。 水处理系统中生物处理以其成本低、效果好、无二次污染成为水污染治理的主 要手段。但是，对于难降解有机化合物而言，传统的生物处理系统中缺乏存在 有效降解微生物，而且传统生物处理方法还存在以下缺陷1)降解速率慢；2) 降解效果不稳定；3)系统中需较长时间才能产生降解性微生物，启动时间长。
直接投加对目标污染物具有特效降解能力的微生物(即功能菌群)是目前 较为常用的技术手段。功能菌经过筛选、培养、驯化之后投入到水处理系统， 可附着在载体上形成生物膜，也可以以游离状态存在。功能菌群以目标污染物 为唯一碳源和能源，具有反应系统启动期短、处理效果稳定、降解速度快、处 理效果好等优点。在生物水处理系统中科研人员希望功能菌群成为优势菌种， 但是功能菌群易受外界环境中物理、化学、营养组成以及其他微生物的影响。
水处理系统中污水(外界环境)发生变化会导致功能菌群优势降低甚至丧 失，致使水处理系统不稳定，影响出水水质。因此，对水处理系统中功能菌群 的稳定性进行跟踪监测，可指导水处理系统工艺的优化和调整，以保证功能菌 群的稳定。
目前，对水处理系统中功能菌群稳定性监测均是采用提取水处理系统中细
菌的总DNA，经PCR扩增后应用于变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析菌群结构。 虽然这种方法能分析水处理系统中的菌群结构，却不能确定菌群的具体种属。 由于随着水处理系统的运行功能菌群可能发生群落演替，而替代功能菌的新优 势菌可能与原功能菌属于同一菌种；因此这种方法的检测结果并不可靠。
目前还有人提出将PCR-DGGE测定后的特异性条带回收后测序，通过 BLAST比对后确定水处理系统中微生物的种属，但是此方法具有以下缺点
第一、只能确定菌属仍然无法确定到种，因此对于功能菌群为伺属不同种或着替代优势菌与功能菌同属情况，难以起到监测的作用；
第二、回收后的条带通常需经过TA克隆后才能进行测序，.因此耗时长， 且耗费高；
第三、检测结果容易出现失真现象，导致鉴定结果与实际不符。
发明内容
本发明的目的是为了解决目前检测水处理系统中功能菌群稳定性的方法 存在无法确定微生物的菌种，检测耗时长、耗费高，及检测结果易失真的问题， 而提供了一种功能菌群在水处理系统中稳定性的检测方法。
功能菌群在水处理系统中稳定性按以下步骤进行检测 一、提取生物水处
理系统中微生物基因组总DNA; 二、用16srDNAV3区通用引物进行PCR扩 增；三、PCR产物与水处理系统功能菌群标准样品同步进行DGGE分析，即 得出检测结果；其中步骤三中水处理系统功能菌群标准样品按以下步骤获得 a、水处理系统功能菌培养后分别固定于活性炭上；b、分别提取水处理系统功 能菌基因组总DNA; c、用16srDNAV3区通用引物进行PCR扩增；d、取每 株功能菌PCR产物100pL混合，然后用核酸共沉剂将DNA沉淀析出，冷冻 干燥后-2(TC保存，使用前溶解于100)iLTE缓冲溶液或无菌去离子水中，制成 样品；e、样品与全部单一功能菌同步进行DGGE分析，样品条带与单一功能 菌条带一一对应为水处理系统功能菌群标准样品；步骤二中16srDNAV3区通 用上游引物BSF338的碱基序列为5，-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3，， 16s rDNA V3 区通用下游引物 BSR534 的碱基.序列为 5'-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG画3，；步骤二 中16s rDNA V3区通用引物PCR反应体系为50jiL，其中上游引物的浓度为 0.5nmol/L、下游引物的浓度为0.5pmol/L、 dNTP的浓度为200pmol/L、模板 为50ng、 10xPCR Buffer缓冲液为12.5pL、 Pfti DNA聚合酶为2.5U以及余量 的无菌纯水；步骤二中16srDNAV3区通用引物PCR反应条件94'C预变性 5min，然后20个循环的降落PCR， 94。C变性30s、退火温度由65。C开始、每 2个循环退火温度降低1°C、退火lmin、 20个循环后退火温度为55°C、 72°C 延伸lmin，之后10个循环94。C变性lmin、 55。C退火min、 72。C延伸lmin， 最后72。C延伸5min;步骤三中水处理系统功能菌群标准样品的制备步骤c中16s rDNA V3 区通用上游引物BSF338 的碱基序列为 5，-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3，， 16s rDNA V3区通用下游引物BSR534 的 碱 基 序 列 为
5，-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG-3，；步骤三 中水处理系统功能菌群标准样品的制备步骤c中16srDNAV3区通用引物PCR 反应体系为50|iL，其中上游引物的浓度为0.5nmol/L、下游引物的浓度为 0.5pmol/L、 dNTP的浓度为200(imol/L、模板为50ng、 lOxPCR Buffer缓冲液 为12.5pL、 PfliDNA聚合酶为2.5U以及余量的无菌纯水；步骤三中水处理系 统功能菌群标准样品的制备步骤c中16s rDNA V3区通用引物PCR反应条件 94°C预变性 5min， 然后20个循环的降落PCR， 94t:变性30s、退火温度由65 。C开始、每2个循环退火温度降低1°C、退火lmin、 20个循环后退火温度为 55°C、 72。C延伸lmin，之后10个循环94。C变性lmin、 55。C退火min、 72°C 延伸lmin，最后72'C延伸5min。
本发明方法能够确定被测微生物的菌种，保证了检测结果的可靠性，其检 测结果能更为合理和有效的指导水处理系统工艺，确保水处理系统出水水质。 本发明方法检测耗费低，且检测时间短，省去了条带回收及BLAST比对的时 间。而且，本发明方法检测结果好，条带明亮清晰，不易失真。
图1是具体实施方式
十步骤三中水处理系统功能菌群标准样品的制备步 骤b中水处理系统中功能菌基因组总DNA提取结果图，图1中"M"泳道标 样为Marker, "1"泳道标样为恶臭假单胞菌，"2"泳道标样为穿孔假单胞菌， "3"泳道标样为枯草芽孢杆菌，"4"泳道标样为不动杆菌，"5"泳道标样为 鲁菲氏不动细菌，"6"泳道标样为5株混合菌。图2是具体实施方式
十步骤三 中水处理系统功能菌群标准样品的制备步骤e中样品与全部单一功能菌同步 进行DGGE分析结果图，图2中"1"泳道标样为样品(5株功能菌)，"2"泳 道标样为不动杆菌，"3"泳道标样为恶臭假单胞菌，"4"泳道标样为鲁菲式不 动细菌，"5"泳道标样为穿孔假单胞菌，"6"泳道标样为枯草芽孢杆菌。图3 是具体实施方式
十步骤三中PCR产物与水处理系统功能菌群标准样品同步进 行DGGE分析的结果图，图3中"1"泳道标样为水处理系统功能菌群标准样品，"2"泳道标样为水处理系统微生物PCR产物。图4是具体实施方式
十中 常规细菌基因组DNA提取方法分别提取水处理系统功能菌基因组总DNA的 结果图，图4中"1"泳道标样为穿孔假单胞菌，"2"泳道标样为恶臭假单胞 菌，"3"泳道标样为不动杆菌，"4"泳道标样为鲁菲氏不动细菌，"5"泳道标 样为枯草芽孢杆菌，"M"泳道标样为Marker。图5是具体实施方式
十中现有 细菌基因组DNA提取方法分别提取水处理系统功能菌基因组总DNA的结果 图，图5中"1"泳道标样为恶臭假单胞菌，"2"泳道标样为穿孔假单胞菌， "3"泳道标样为枯草芽孢杆菌，"4"泳道标样为不动杆菌，"5"泳道标样为 鲁菲氏不动细菌，"M"泳道标样为Marker。
具体实施例方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方 式间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式功能菌群在水处理系统中稳定性按以下步骤 进行检测 一、提取生物水处理系统中微生物基因组总DNA; 二、用16srDNA V3区通用引物进行PCR扩增；三、PCR产物与水处理系统功能菌群标准样品 同步进行DGGE分析，即得出检测结果；其中步骤三中水处理系统功能菌群 标准样品按以下步骤获得a、水处理系统功能菌培养后分别固定于活性炭上； b、分别提取水处理系统功能菌基因组总DNA; c、用16srDNAV3区通用引 物进行PCR扩增；d、取每株功能菌PCR产物10(HiL混合，然后用核酸共沉 剂将DNA沉淀析出，冷冻干燥后-2(TC保存，使用前溶解于IO(VL TE缓冲溶 液或无菌去离子水中，制成样品；e、样品与全部单一功能菌同步进行DGGE 分析，样品条带与单一功能菌条带一一对应为水处理系统功能菌群标准样品； 步骤二中16s rDNA V3区通用上游引物BSF338的碱基序列为 5，-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3，， 16srDNAV3区通用下游引物BSR534
的 碱 基 序 列 为
5,-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG-3，；步骤二 中16s rDNA V3区通用引物PCR反应体系为50(iL，其中上游引物的浓度为 0.5|iimol/L、下游引物的浓度为0.5jimol/L、 dNTP的浓度为200pmol/L、模板 为50ng、 10xPCR Buffer缓冲液为12.5卩iL、 PfU DNA聚合酶为2.5U以及余量的无菌纯水；步骤二中16srDNAV3区通用引物PCR反应条件94。C预变性 5min，然后20个循环的降落PCR， 94'C变性30s、退火温度由65。C开始、每 2个循环退火温度降低1°C、退火lmin、 20个循环后退火温度为55°C、 72°C 延伸lmin，之后10个循环94。C变性lmin、 55。C退火min、 72。C延伸lmin， 最后72。C延伸5min;步骤三中水处理系统功能菌群标准样品的制备步骤c中 16s rDNA V3 区通用上游引物BSF338 的碱基序列为 5，-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3，， 16s rDNA V3区通用下游引物BSR534 的 碱 基 序 列 为
5，-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG-3，；步骤三 中水处理系统功能菌群标准样品的制备步骤c中16s rDNA V3区通用引物PCR 反应体系为50pL，其中上游引物的浓度为0.5pmol/L、下游引物的浓度为 0.5nmol/L、 dNTP的浓度为20(Himol/L、模板为50ng、 10xPCR Buffer缓冲液 为12.5^iL、 PfUDNA聚合酶为2.5U以及余量的无菌纯水；步骤三中水处理系 统功能菌群标准样品的制备步骤c中16srDNAV3区通用引物PCR反应条件 94。C预变性5min，然后20个循环的降落PCR， 94。C变性30s、退火温度由65 'C开始、每2个循环退火温度降低TC、退火lmin、 20个循环后退火温度为 55°C、 72i:延伸lmin，之后10个循环94。C变性lmin、 55。C退火min、 72°C 延伸lmin，最后72"C延伸5min。
本实施方式中步骤三按DGGE操作指南进行操作。本实施方式中步骤三 中水处理系统功能菌群标准样品的制备步骤e与步骤三中DGGE的操作相同。
本实施方式中生物水处理系统中微生物DGGE分析条带与水处理系统功 能菌群标准样品条带进行一一比对。如水处理系统中微生物条带能与功能菌群 标准样品条带对应，则说明所对应的功能菌存在于水处理系统中；如水处理系 统中微生物条带没有对应的功能菌群标准样品条带，则说明水处理系统中定该 微生物不属于功能菌群所在菌种，需要水处理系统进行调整或优化。
本实施方式步骤二中16s rDNA V3区通用引物PCR反应体系中10xPCR Buffer缓冲液中含有MgCl2。
本实施方式步骤三中水处理系统功能菌群标准样品的制备步骤c中16s rDNAV3区通用引物PCR反应体系中10xPCRBuffer缓冲液中含有MgCl2。
具体实施方式
二本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤三中水 处理系统功能菌群标准样品的制备步骤a水处理系统功能菌培养后分别固定
于活性炭上分别挑选水处理系统功能菌单菌落转入5mL LB培养基中培养 l2~16h，然后离心，离心沉淀分别用lmL无菌水重悬，再将重悬液接种于无 菌的活性炭体系中，固定48h;其中活性炭体系由100mL水和10g活性炭组 成。其它步骤及参数与实施方式一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
二的不同点是步骤三中水 处理系统功能菌群标准样品的制备步骤b将5g固定有功能菌群的活性炭置于 三角瓶中加入5mL DNA抽提缓冲液进行超声振荡，然后加入100 浓度为 50mg/mL的蛋白酶K，在37°C、 225r/min的条件下摇床30min，之后加入3mL 质量浓度为10%的SDS裂解液，再置于65。C环境中水浴2h，而后将三角瓶 中的物质移入50mL离心管在室温、12000r/min的条件下离心10min,向离心 上清液中加入等体积的氯仿/异戊醇在12000r/min条件下离心30min，并用体 积浓度为75%乙醇清洗离心沉淀，再将离心沉淀溶解于TE缓冲液，即可得到 功能菌群基因组总DNA。其它步骤及参数与实施方式二相同。
本实施方式步骤三中水处理系统功能菌群标准样品的制备步骤b中超声 振荡时间为10s，超声振荡时间过长易导致DNA片段断裂。
本实施方式步骤三中水处理系统功能菌群标准样品的制备步骤b中65°C 水浴过程中每隔15 20min摇动三角瓶一次。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
三的不同点是步骤三中水 处理系统功能菌群标准样品的制备步骤b中氯仿/异戊醇中氯仿与异戊醇的体 积比为24:1。其它步骤及参数与实施方式三相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
三的不同点是步骤三中水 处理系统功能菌群标准样品的制备步骤b中DNA抽提缓冲液中Tris-HCl的浓 度为10Ommol/L、 EDTA的浓度为10Ommol/L、磷酸盐缓冲液的浓度为 10Ommol/L、 NaCl的浓度为1.5mol/L、 CTAB的浓度为1% (质量浓度)；DNA 抽提缓冲液pH值为8.0。其它步骤及参数与实施方式三相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
一、二、三、四或五的不同 点是步骤三中DGGE分析中选用浓度为8。/。的聚丙烯酰胺凝胶，变性剂高浓度端浓度为60%,变性剂低浓度端浓度为30%; DGGE分析在150V电压、60 。C条件下电泳4h。其它步骤及参数与实施方式一、二、三、四或五相同。 本实施方式其它操作均与DGGE操作指南相同。
本实施方式步骤三中水处理系统功能菌群标准样品的制备步骤e中的 DGGE操作与步骤三中DGGE操作相同。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
一、二、三、四、五或六的 不同点是步骤一将5g功能菌群负载载体置于三角瓶中加入5mL DNA抽提 缓冲液进行超声振荡，然后加入100 浓度为50mg/mL的蛋白酶K，在37 °C、 225r/min的条件下摇床30min，之后加入3mL质量浓度为10%的SDS 裂解液，再置于65。C环境中水浴2h，而后将三角瓶中的物质移入50mL离心 管在室温、12000r/min的条件下离心10min，向离心上清液中加入等体积的氯 仿/异戊醇在12000r/min条件下离心30min，并用体积浓度为75%乙醇清洗离 心沉淀，再将离心沉淀溶解于TE缓冲液，即可得到微生物基因组总DNA。 其它步骤及参数与实施方式一、二、三、四、五或六相同。
本实施方式功能菌群若以游离状态存在于水处理系统中则用5mL含菌液 替代本实施方式步骤一中的5g功能菌群负载载体。
本实施方式步骤一中超声振荡时间为10s。
本实施方式步骤一中65。C水浴过程中每隔15 20min摇动三角瓶一次。
具体实施方式
八本实施方式与具体实施方式
七的不同点是步骤一中氯
仿/异戊醇中氯仿与异戊醇的体积比为24:1。其它步骤及参数与实施方式七相同。
具体实施方式
九本实施方式与具体实施方式
七或八的不同点是步骤一
中DNA抽提缓冲液中Tris-HCl的浓度为100mmol/L、 EDTA的浓度为 10Ommol/L、磷酸盐缓冲液的浓度为10Ommol/L、 NaCl的浓度为1.5mol/L、 CTAB的浓度为1。/。(质量浓度)；DNA抽提缓冲液pH值为8.0。其它步骤及 参数与实施方式七或八相同。
具体实施方式
十本实施方式水处理系统中功能菌群由不动杆菌 (細WtefeW謂-mcbrellneri )、 鲁菲式不动细菌(爿c/"eto6"Clwoffii画GC subgroup)、恶臭假单胞菌(尸"wfifomo"os-putida-biotype A)、穿孔假单胞菌(/^M(i蘭owas-pertucinogena)、枯草芽孢杆菌(B鎖7/,subtilis)组成；本实 施方式将5株功能菌(不动杆菌、鲁菲式不动细菌、恶臭假单胞菌、穿孔假单 胞菌和枯草芽孢杆菌)发酵后混合固定于活性炭上，固定化后通水洗脱培养基， 之后在水处理系统中运行7天，取样监测功能菌群稳定情况。
功能菌群在水处理系统中稳定性按以下步骤进行检测 一、提取生物水处
理系统中微生物基因组总DNA; 二、用16srDNAV3区通用引物进行PCR扩 增；三、PCR产物与水处理系统功能菌群标准样品同步进行DGGE分析，即 得出检测结果(将凝胶银染后如图3所示)；其中步骤三中水处理系统功能菌 群标准样品按以下步骤获得a、水处理系统功能菌培养后分别固定于活性炭 上；b、分别提取水处理系统功能菌基因组总DNA (提取结果如图1所示)；c、 用16srDNAV3区通用引物进行PCR扩增；d、取每株功能菌PCR产物lOOpL 混合，然后用核酸共沉剂将DNA沉淀析出，冷冻干燥后-20。C保存，使用前溶 解于100pLTE缓冲溶液或无菌去离子水中，制成样品；e、样品与全部单一功 能菌同步进行DGGE分析(分析结果如图2所示)样品条带与单一功能菌条 带一一对应，说明是水处理系统功能菌群标准样品；步骤二中16srDNAV3 区通用上游引物 BSF338 的碱基序列为 5，-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3，， 16srDNAV3区通用下游引物可以不写 的 碱 基 序 列 为
5'-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG-3，；步骤二 中16s rDNA V3区通用引物PCR反应体系为50jiL，其中上游引物的浓度为 0.5pmol/L、下游引物的浓度为0.5|amol/L、 dNTP的浓度为200jmiol/L、模板 为50ng、 10xPCR Buffer缓冲液为12.5jjL、 Pfb dna聚合酶为2.5U以及余量 的无菌纯水；步骤二中16srDNAV3区通用引物PCR反应条件94"C预变性 5min，然后20个循环的降落PCR， 94'C变性30s、退火温度由65。C开始、每 2个循环退火温度降低1°C、退火lmin、 20个循环后退火温度为55°C、 72°C 延伸lmin，之后10个循环94。C变性lmin、 55。C退火min、 72。C延伸lmin， 最后72。C延伸5min;步骤三中水处理系统功能菌群标准样品的制备步骤c中 16s rDNA V3 区通用上游引物BSF338 的碱基序列为 5，-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3，， 16s rDNA V3区通用下游引物BSR534的 碱 基 序 列 为
5 ，画CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG隱3 ，；步骤三
中水处理系统功能菌群标准样品的制备步骤c中16s rDNA V3区通用引物PCR 反应体系为50pL，其中上游引物的浓度为0.5pmol/L、下游引物的浓度为 0.5pmol/L、 dNTP的浓度为20(Vmol/L、模板为50ng、 10xPCR Buffer缓冲液 为12.5piL、 PfUDNA聚合酶为2.5U以及余量的无菌纯水；步骤三中水处理系 统功能菌群标准样品的制备步骤c中16srDNAV3区通用引物PCR反应条件 94。C预变性5min，然后20个循环的降落PCR， 94。C变性30s、退火温度由65 "C开始、每2个循环退火温度降低1°C、退火lmin、 20个循环后退火温度为 55°C、 72。C延伸lmin，之后10个循环94。C变性lmin、 55。C退火min、 72°C 延伸lmin，最后72t:延伸5min。
本实施方式步骤二中16s rDNA V3区通用引物PCR反应体系中10xPCR Buffer缓冲液中含有MgCl2。
本实施方式步骤三中水处理系统功能菌群标准样品的制备步骤c中16s rDNAV3区通用引物PCR反应体系中10xPCRBuffer缓冲液中含有MgCl2。
本实施方式步骤三中水处理系统功能菌群标准样品的制备步骤a水处理 系统功能菌培养后分别固定于活性炭上分别挑选水处理系统功能菌单菌落转 入5mLLB培养基中培养14h，然后离心，离心沉淀分别用lmL无菌水重悬， 再将重悬液接种于无菌的活性炭体系中，固定48h;其中活性炭体系由lOOmL 水和10g活性炭组成。
本实施方式步骤三中水处理系统功能菌群标准样品的制备步骤b将5g在 水处理系统中运行7天的样品(固定有功能菌群的活性炭)置于三角瓶中加入 5mL DNA抽提缓冲液进行超声振荡10s，然后加入100 浓度为50mg/mL的 蛋白酶K，在37'C、 225r/min的条件下摇床30min，之后加入3mL质量浓度 为10%的SDS裂解液，再置于65"C环境中水浴2h，水浴过程中每隔15 20min 摇动三角瓶一次，而后将三角瓶中的物质移入50mL离心管在室温、12000r/min 的条件下离心10min，向离心上清液中加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比为 24:1)在12000r/min条件下离心30min，并用体积浓度为75%乙醇清洗离心沉 淀，再将离心沉淀溶解于TE缓冲液，即可得到功能菌群基因组总DNA。本实施方式步骤三中水处理系统功能菌群标准样品的制备步骤b中DNA 抽提缓冲液中Tris-HCl的浓度为100mmol/L、 EDTA的浓度为100mmol/L、磷 酸盐缓冲液的浓度为100mmol/L、 NaCl的浓度为1.5mol/L、 CTAB的浓度为 1% (质量浓度)；DNA抽提缓冲液pH值为8.0。
本实施方式步骤三中DGGE分析中选用浓度为8%的聚丙烯酰胺凝胶，变 性剂高浓度端浓度为60%,变性剂低浓度端浓度为30%; DGGE分析在150V 电压、60。C条件下电泳4h。本实施方式中步骤三按DGGE操作指南进行操作， 其它均与DGGE操作指南相同。本实施方式步骤三中水处理系统功能菌群标 准样品的制备步骤e中的DGGE操作与步骤三中DGGE操作相同。
本实施方式步骤一将5g负载有功能菌群的活性炭置于三角瓶中加入5mL DNA抽提缓冲液进行超声振荡10s，然后加入100 (iL浓度为50mg/mL的蛋白 酶K，在37°C、 225r/min的条件下摇床30min，之后加入3mL质量浓度为10% 的SDS裂解液，再置于65"C环境中水浴2h，水浴过程中每隔15 20min摇动 三角瓶一次，而后将三角瓶中的物质移入50mL离心管在室温、12000r/min的 条件下离心10min，向离心上清液中加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比为24:1) 在12000r/min条件下离心30min，并用体积浓度为75%乙醇清洗离心沉淀，再 将离心沉淀溶解于TE缓冲液，即可得到微生物基因组总DNA。
本实施方式步骤一中DNA抽提缓冲液中Tris-HCl的浓度为10Ommol/L、 EDTA的浓度为10Ommol/L、磷酸盐缓冲液的浓度为10Ommol/L、 NaCl的浓 度为1.5mol/L、 CTAB的浓度为1% (质量浓度)；DNA抽提缓冲液pH值为 8.0。 -
图3检测结果表明除穿孔假单胞菌(第3条)量小稳定性差之外，其余功 能菌群生长正常。本发明可以直观观察出菌群种类变化。
采用常规细菌基因组DNA提取方法分别提取水处理系统功能菌基因组总 DNA:
取恶臭假单胞菌、穿孔假单胞菌、枯草芽孢杆菌、不动杆菌和鲁菲氏不动 细菌单菌落接种于5mLLB培养基中在3(TC条件下培养16 24h后，无菌条件 下取500|aL菌液转入50mL LB培养基中扩大培养16 24h，温度为30°C 。50mL 菌液离心后，弃上清，用lmLPBS(100mmol/LNaCl， 0.01g/mlPVP， 20mmol/LEDTA， 50mmol/LTris， pH值为10)缓冲液清洗沉淀，12000r/min离心5min， 取沉淀，加入567nL的TE缓冲液重悬，加入30 质量浓度为10%的SDS 和3 )iL浓度为20mg/mL的蛋白酶K混匀，于37 。C温育lh。之后加入100 )iL 浓度为5mol/L的NaCl溶液，充分混匀，再加入80pL CTAB/NaCl溶液混匀， 于65 。C温育10min，加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，12000r/min离心4 5min，将上清转入一只新离心管中，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，混匀，离 心5min，将上清转入新离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，醇沉30min， 12000r/min离心5min，弃上清，加入lml75。/。乙醇清洗，弃上清，干燥后，溶 于50pL的TE (10mmol/LTris-Hcl， lmmol/LEDTA， pH值为8.0)缓冲液中。
常规细菌基因组DNA提取方法提取水处理系统中功能菌基因组总DNA 的结果如图4所示。图4显示出提取过程中由于不动杆菌和鲁菲氏不动细菌以 及两株假单胞菌菌液粘稠，离心过程中菌体不易沉淀，因此提取效果差，而且 DNA片段严重断裂。
采用现有细菌基因组DNA提取方法分别提取水处理系统功能菌基因组总 DNA:
将10g固定有功能菌群的活性炭置于三角瓶中加入12mL DNA抽提缓冲 液进行超声振荡10s，然后加入100 ^L浓度为100mg/mL的蛋白酶K，在37 °C、 225r/min的条件下摇床30min，之后加入3mL质量浓度为10%的SDS 裂解液，再置于65。C环境中水浴2h，而后将三角瓶中的物质移入50mL离心 管在室温、5000r/min的条件下离心10min，取离心上清液，再向离心沉淀中 再加入4mL质量浓度为10%的SDS裂解液振荡10s，然后置于65"C环境中 水浴10min，再在室温、5000r/min的条件下离心10min，合并离心上清液、混 匀，之后加入等体积的氯仿/异戊醇在9000r/min条件下离心30min，并用体积 浓度为75%乙醇清洗离心沉淀，再将离心沉淀溶解于TE缓冲液，即可得到功 能菌群基因组总DNA。
现有细菌基因组DNA提取方法提取水处理系统中功能菌基因组总DNA 的结果如图5所示。现有细菌基因组DNA提取方法提取量大，且提取片段整 齐，不断裂；但步骤繁琐，而且试剂和样品用量大。由于该检测方法活性炭用 量大，实际运用中会导致反应器内活性炭大量减少，影响水处理效果。序列表
〈110>哈尔滨工业大学
〈120〉 一种功能菌群在水处理系统中稳定性的检测方法
〈160〉 2
<210〉 1
〈211〉 20
<212> DNA <213〉人工序列
〈220>
〈223〉 16srDNAV3区通用上游引物BSF338。 <400〉 1
actcctacgg gaggcagcag 20
〈210〉 2 <211> 40 〈212〉腿 〈213〉人工序列
〈220〉
〈223〉 16srDNAV3区通用下游引物BSR534。 <400〉 2
cgcccgccgc gccccgcgcc cgtcccgccg cccccgcccg 40
权利要求
1、一种功能菌群在水处理系统中稳定性的检测方法，其特征在于功能菌群在水处理系统中稳定性按以下步骤进行检测一、提取生物水处理系统中微生物基因组总DNA；二、用16s rDNA V3区通用引物进行PCR扩增；三、PCR产物与水处理系统功能菌群标准样品同步进行DGGE分析，即得出检测结果；其中步骤三中水处理系统功能菌群标准样品按以下步骤获得a、水处理系统功能菌培养后分别固定于活性炭上；b、分别提取水处理系统功能菌基因组总DNA；c、用16s rDNA V3区通用引物进行PCR扩增；d、取每株功能菌PCR产物100μL混合，然后用核酸共沉剂将DNA沉淀析出，冷冻干燥后-20℃保存，使用前溶解于100μL TE缓冲溶液或无菌去离子水中，制成样品；e、样品与全部单一功能菌同步进行DGGE分析，样品条带与单一功能菌条带一一对应为水处理系统功能菌群标准样品；步骤二中16s rDNA V3区通用上游引物BSF338的碱基序列为5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’，16s rDNA V3区通用下游引物BSR534的碱基序列为5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG-3’；步骤二中16s rDNA V3区通用引物PCR反应体系为50μL，其中上游引物的浓度为0.5μmol/L、下游引物的浓度为0.5μmol/L、dNTP的浓度为200μmol/L、模板为50ng、10×PCR Buffer缓冲液为12.5μL、Pfu DNA聚合酶为2.5U以及余量的无菌纯水；步骤二中16s rDNA V3区通用引物PCR反应条件94℃预变性5min，然后20个循环的降落PCR，94℃变性30s、退火温度由65℃开始、每2个循环退火温度降低1℃、退火1min、20个循环后退火温度为55℃、72℃延伸1min，之后10个循环94℃变性1min、55℃退火min、72℃延伸1min，最后72℃延伸5min；步骤三中水处理系统功能菌群标准样品的制备步骤c中16s rDNA V3区通用上游引物BSF338的碱基序列为5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’，16s rDNA V3区通用下游引物BSR534的碱基序列为5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG-3’；步骤三中水处理系统功能菌群标准样品的制备步骤c中16s rDNA V3区通用引物PCR反应体系为50μL，其中上游引物的浓度为0.5μmol/L、下游引物的浓度为0.5μmol/L、dNTP的浓度为200μmol/L、模板为50ng、10×PCR Buffer缓冲液为12.5μL、Pfu DNA聚合酶为2.5U以及余量的无菌纯水；步骤三中水处理系统功能菌群标准样品的制备步骤c中16s rDNA V3区通用引物PCR反应条件94℃预变性5min，然后20个循环的降落PCR，94℃变性30s、退火温度由65℃开始、每2个循环退火温度降低1℃、退火1min、20个循环后退火温度为55℃、72℃延伸1min，之后10个循环94℃变性1min、55℃退火min、72℃延伸1min，最后72℃延伸5min。
2、 根据权利要求1所述的一种功能菌群在水处理系统中稳定性的检测方 法，其特征在于步骤三中水处理系统功能菌群标准样品的制备步骤a水处理系 统功能菌培养后分别固定于活性炭上分别挑选水处理系统功能菌单菌落转入 5mLLB培养基中培养12 16h，然后离心，离心沉淀分别用lmL无菌水重悬， 再将重悬液接种于无菌的活性炭体系中，固定48h;其中活性炭体系由100mL 水和10g活性炭组成。
3、 根据权利要求2所述的一种功能菌群在水处理系统中稳定性的检测方 法，其特征在于步骤三中水处理系统功能菌群标准样品的制备步骤b将5g固 定有功能菌群的活性炭置于三角瓶中加入5mL DNA抽提缓冲液进行超声振 荡，然后加入100nL浓度为50mg/mL的蛋白酶K，在37。C、 225r/min的条件 下摇床30min，之后加入3mL质量浓度为10%的SDS裂解液，再置于65°C 环境中水浴2h，而后将三角瓶中的物质移入50mL离心管在室温、12000r/min 的条件下离心10min，向离心上清液中加入等体积的氯仿/异戊醇在12000r/min 条件下离心30min，并用体积浓度为75%乙醇清洗离心沉淀，再将离心沉淀溶 解于TE缓冲液，即可得到功能菌群基因组总DNA。
4、 根据权利要求3所述的一种功能菌群在水处理系统中稳定性的检测方 法，其特征在于步骤三中水处理系统功能菌群标准样品的制备步骤b中氯仿/ 异戊醇中氯仿与异戊醇的体积比为24:1。
5、 根据权利要求3所述的一种功能菌群在水处理系统中稳定性的检测方 法，其特征在于步骤三中水处理系统功能菌群标准样品的制备步骤b中DNA 抽提缓冲液中Tris-HCl的浓度为10Ommol/L、 EDTA的浓度为10Ommol/L、磷 酸盐缓冲液的浓度为10Ommol/L、 NaCl的浓度为1.5mol/L、 CTAB的浓度为1% (质m浓度)；DNA抽提缓冲液pH值为8.0。
6、 根据权利要求l、 2、 3、 4或5所述的一种功能菌群在水处理系统中稳 定性的检测方法，其特征在于步骤三中DGGE分析中选用浓度为8%的聚丙烯 酰胺凝胶，变性剂高浓度端浓度为60%,变性剂低浓度端浓度为30%; DGGE 分析在150V电压、60"C条件下电泳4h。
7、 根据权利要求6所述的一种功能菌群在水处理系统中稳定性的检测方 法，其特征在于步骤一将5g功能菌群负载载体置于三角瓶中加入5mL DNA 抽提缓冲液进行超声振荡，然后加入100 jiL浓度为50mg/mL的蛋白酶K，在 37°C、 225r/min的条件下摇床30min，之后加入3mL质量浓度为10%的SDS 裂解液，再置于65。C环境中水浴2h，而后将三角瓶中的物质移入50mL离心 管在室温、12000r/min的条件下离心10min，向离心上清液中加入等体积的氯 仿/异戊醇在12000r/min条件下离心30min，并用体积浓度为75%乙醇清洗离 心沉淀，再将离心沉淀溶解于TE缓冲液，即可得到微生物基因组总DNA。
8、 根据权利要求7所述的一种功能菌群在水处理系统中稳定性的检测方 法，其特征在于步骤一中氯仿/异戊醇中氯仿与异戊醇的体积比为24:1。
9、 根据权利要求7或8所述的一种功能菌群在水处理系统中稳定性的检 测方法，其特征在于步骤一中DNA抽提缓冲液中Tris-HCl的浓度为 10Ommol/L、 EDTA的浓度为10Ommol/L、磷酸盐缓冲液的浓度为10Ommol/L、 NaCl的浓度为1.5mol/L、 CTAB的浓度为1°/。(质量浓度)；DNA抽提缓冲液 pH值为8.0。
全文摘要
一种功能菌群在水处理系统中稳定性的检测方法，它涉及一种功能菌群的检测方法。它解决了目前检测水处理系统中功能菌群稳定性的方法存在无法确定微生物的菌种，检测耗时长、耗费高，及检测结果易失真的问题。检测方法一、提取生物水处理系统中微生物基因组总DNA；二、用16s rDNA V3区通用引物进行PCR扩增；三、PCR产物与水处理系统功能菌群标准样品同步进行DGGE分析。本发明方法能够确定被测微生物的菌种，保证了检测结果的可靠性，其检测结果能更为合理和有效的指导水处理系统工艺，确保水处理系统出水水质。本发明方法检测耗费低，且检测时间短；而且本发明方法检测结果好，条带明亮清晰，不易失真。
文档编号C12Q1/68GK101440406SQ200810209800
公开日2009年5月27日 申请日期2008年12月26日 优先权日2008年12月26日
发明者张多英, 李伟光, 王广智, 解丰波, 郜玉楠 申请人:哈尔滨工业大学