专利名称：：Abo血型基因检测试剂及定型方法ABO血型基因检测试剂及定型方法[
技术领域：
]本发明涉及一种新的分子生物学检测试剂及方法；尤其涉及一种用于ABO血型抗原和特异性A2抗原同步基因分型的检测试剂及定型方法。[
背景技术：
]ABO血型系是人类血型系中抗原免疫原性最强的一个血型系统。人类的ABO血型系统是由由第9号染色体(9q34.1q34.2)上的A、B和O三个等位基因来控制的，基因通过决定生成的转糖基酶的种类而决定催化何种糖基连接在前驱物质的哪个位置上。A、B抗原都是在H抗原(前驱物质半乳糖末端连接岩藻糖)的基础上形成的，细胞合成的A酶能使一个乙酰半乳糖胺基连接到H抗原上，形成A抗原；B抗原是一个半乳糖基连接到H抗原上。根据人类红细胞表面有无抗原A、B和H，可分为A型、B型、AB型和O型四型，组成ABO血型系统。A型红细胞上有A抗原，B型者有B抗原，AB型者有A和B两种抗原，而O型者两种抗原均无但有H抗原。目前人类ABO血型检测方法有二种一是经典的血清学方法，二是基因方法。血清学方法的缺点是需要新鲜红细胞，需要抽血检验；而基因方法可以弥补这方面的缺陷，因此基因定型方法已逐步运用于临床血型检测中。ABO基因定型方法原理如下鉴于ABO基因产物是糖基转移酶，这些酶控制ABO血型抗原的生物合成。ABO抗原的化学结构是糖蛋白，其血清学特异性取决于糖链末端3个糖基的结构。ABO基因包含长度大小从28-688bp不等的7个外显子和长度约为19514bp的6个内含子,它大约总长为18-20Kb。多数编码序列(1062bp中823bp)位于第6和第7外显子上，它们编码了糖基转移酶的催化区域。ABO血型的其它等位基因的DNA序列高度保守，与A101—致序列的DNA序列紧密相关，仅有几个碱基替换或单个碱基缺失。A102等位基因与A101等位基因相比只是在467位的单个碱基替换(C/T，Pro/Leu)，两者翻译的糖基转移酶活力没有显著性差异。B1基因仅在297、526、657、703、796、803、930和1096位碱基8个位置与A101基因有改变，导致糖基转移酶多肽链上有4个氨基酸替代C526G(Arg/Gly)、G703A(Gly/Ser)、C796A(Leu/Met)、G803C(Gly/Ala)。01基因与A101的差异是第261位核苷酸G缺失，引起了阅读框移动，在351至354位置产生终止密码子，肽链合成在117位氨基酸终止，产生一条无催化能力的短肽链。ABO基因定型方法克服了以往血型血清学方法的限制，可作为一种独立的鉴定手段，为临床解决ABO亚型的鉴定、血型抗原减弱反应、Cis-AB(顺式AB型)、类孟买型、血型嵌合体、正反定型不符等疑难问题，在临床输血医学和遗传学等领域将具有广泛的应用。但鉴于不同民族不同人种的基因构成存在明显差异，采用什么样的检测试剂进行基因检测，有不同的检测效果。研究表明(喻琼,吴国光，邓志辉，等.中国汉族人群A2亚型分子遗传背景的研究.中国输血杂志，2004,17(2):83~86):中国汉族人群与别的人种ABO血型基因分布相比有着自己的特点，中国人群中Al、B、01基因较常见，其中A102基因频率高达0.2231，A101基因频率仅为0.0096，无02基因；中国人群A2等位基因存在多样性并有其自身特点，与国际报道的基因构成存在明显差异，A2等位基因中除ntl061C缺失外，还存在nt4670T、ntl009A〉G等点突变，中国汉族人群A2亚型中以A205等位基因(nt467T、ntl009G)为主。有多个课题组的研究支持中国人群ABO常见血型基因的分布情况(YanL,ZhuF,FuQ,HeJ.ABO,Rh,廳S，Duffy,Kidd,Yt，Scianna,andColtonbloodgroupsystemsinindigenousChinese.Immunohematol.2005;21(1):4-10)Al等位基因(0.1890);A2等位基因(0.0045)，B等位基因(0.2340)，0-l等位基因(0.6380)，未检出O02基因。当前，使用国外设计的ABO常规分型试剂盒并不适合中国人群ABO基因的鉴定。有研究表明(喻琼,吴国光，邓志辉，等.中国汉族人群A2亚型分子遗传背景的研究.中国输血杂志,2004,17(2):83~86)使用以国际报道的ABO基因结构特点为基础、美国G&T公司研制的PCR-SSP法ABO基因定型试剂盒，对260例中国汉族的随机个体进行了基因定型，但未检出A2基因且对20例血清学检出为"A2"亚型的样本，使用美国G&T公司研制的PCR-SSP法ABO基因定型试剂盒，仅有5例能定为A2型，而绝大部分标本不能正确定型，只能定为Al型。表1国外试剂盒中ABO基因分型参数<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>目前国内没有适合中国人群常见ABO血型抗原和特异性A2抗原同步基因分型的试剂盒。如果在基因检测中没有针对中国人A2亚型基因特异性的引物，会造成不正确定型，可能会误定为A1型。A2亚型是ABO血型中常见的变异型，随着临床医学的发展,人们对它的重要性认识越来越深刻。譬如近十年来，发现A2亚型的器官(心脏、肝、肾脏等)供者捐给非A型(包括B型、O型)的受者显著延长存活率、加大了供体库的数量；A2亚型的成分(血小板)血液可称为"万能"成分血。准确的定型具有重要的实际意义。[
发明内容]针对现有技术存在的问题，本发明构思了一种新的用于ABO血型抗原和特异性A2抗原同步基因分型的检测试剂及定型方法，可以克服现有技术的缺陷。本发明是这样实现的一种ABO血型基因检测试剂，可以对中国人群常见的ABO血型抗原的血型基因进行同步扩增，包括2条内对照寡核苷酸引物HGH-A链序列5'-tgccttcccaaccatteccctta-3，，HGH-B链序列5，-ccaetcacggatttctgttgtgtttc-3，，其特征在于，还至少包括下述任意一组2条基因特异性寡核苷酸引物(1)Mix-A5'陽ggaaggatgtectegaggtg-3.5，-tgaggatgtggatgttgaat-3，(2)Mix-A1025，-acgtggctttectgatgctg-3，5，-gcggggcaccgcggcca-3，(3)Mix-B5，-ctgteagtgctggacgtgg-3，5，-tecacgcacaccaggtaatc-3，(4)Mix-05，-ggaaggatgtectectggta-3，5，-cttgatggcaaacacagttaac-3又一种ABO血型基因检测试剂，可以对中国人群常见的ABO血型特异性A2亚型抗原的血型基因进行同步扩增，包括2条内对照寡核苷酸引物-HGH-A链序列5，-tgccttcccaaccatteccctta-3，，HGH-B链序列5，-ccaetcacggatttctgttgtgtttc-3，，其特征在于，还至少包括下述任意一组2条基因特异性寡核苷酸引物(1)Mix-15'陽acgtggctttectgatgctg-3'5，-gcggggcaccgcggcca-3，(2)Mix-25，-caggecaacggcategag-3，5，-ctggcagecgetcacggt-3'(3)Mix-35，-caggecaacggcategag-3"5，-agecgcteaegggttcca-3，(4)Mix-45'隱caggecaacggcategag-3，5，國agccgcteaegggttccc-3，(5)Mix-55，-gggggteggtgcaagaga-35;，-cgcagtgaacctcagcttc-35(6)Mix-6:，隱cagctgteagtgctggagg-3，國agaaatcgccctcgtgetta-3，(7)Mix-7'陽cagctgteagtgctggagg-3，，-ggctgcttccgtagaaget-3，(8)Mix-8，-caggecaacggcategag-3，，國gcagtgaacetcagettccc-3(9)Mix-9，國acgtggctttectgaagetg-3，，-gcggagcagcgcggccg-3，一种ABO血型基因检测方法，其特征在于包括2条内对照寡核苷酸引物:HGH-A链序列5'陽tgccttcccaaccatteccctta-3，，HGH-B链序歹U:5，-ccaetcacggatttctgttgtgtttc-3，，以及至少包括下述任意一组2条基因特异性寡核苷酸引物(1)Mix-A5，-ggaaggatgtectegaggtg-3，5，-tgaggatgtggatgttgaat-3，(2)Mix-A1025'墨acgtggctttectgatgctg-3'5，-gcggggcaccgcggcca-3，(3)Mix-B5，-ctgteagtgctggacgtgg-3'5'-tecacgcacaccaggtaatc-3'(4)Mix-05，-ggaaggatgtectectggta-3，5'-cttgatggcaaacacagttaac-3其反应体系中还包括0.2mMDNTP2-20%1.5mMMgC124-25%进行PCR扩增反应。又一种ABO血型基因检测方法，其特征在于包括2条内对照寡核苷酸引物HGH國A链序列5'陽tgccttcccaaccatteccctta-3，，HGH-B链序歹!j:5，-ccaetcacggatttctgttgtgtttc-3，，以及至少包括下述任意一组2条基因特异性寡核苷酸引物(1)Mix隱l5，-acgtggctttectgatgctg-3'5，-gcggggcaccgcggcca-3'(2)Mix-25，-caggeeaacggcategag隱3，5，-ctggcagecgetcacggt陽3，(3)Mix-35，-caggecaacggcategag-3，5，-agecgcteaegggttcca-3，(4)Mix-45，-caggecaacggcategag-3，5，-agecgcteaegggttccc-3，(5)Mix-55，-gggggteggtgcaagaga-3，5，-cgcagtgaacctcagcttc-3，(6)Mix-65,-cagctgteagtgctggagg-3，5，-agaaatcgccctcgtgetta隱3，(7)Mix-75，-cagctgteagtgctggagg-3，5'-ggctgcttccgtagaaget-3'(8)Mix-85'-caggccaacggcatcgag-3，5'-gcagtgaacetcagettccc隱3'(9)Mix-95'-acgtggctttcctgaagctg-3'5，-gcggagcagcgcggccg-3，其反应体系中还包括0.2rnMDNTP2-20%1.5mMMgC124-25%进行PCR扩增反应。通过采用本发明的技术方案，基于中国人群ABO血型基因和A2亚型遗传学基础，根据A2亚型的突变位点特异性，设计聚合酶链反应-序列特异性引物法(PCR-SSP)检测试剂盒，通过设计ABO血型基因各自的特异性引物、摸索最佳退火温度及调节Mg2+离子和引物浓度等条件，可以对中国人群常见的ABO血型抗原及特异性A2亚型抗原的血型基因进行同步扩增。基于这些引物的本发明的试剂盒及分型方法，可以对中国人群常见的ABO血型抗原及特异性A2亚型抗原的血型基因进行同步扩增。具有先进性，特异性和高准确性，而且该法简便、直观，适合中国汉族人ABO血型基因的鉴定以及用于人类ABO血型的研究。[]图1为本发明检测A102/B101、B101/001、A102/001、001/0014种基因型的电泳图；图2为本发明检测A102、A201、A205基因型电泳结果图。[具体实施方式]本发明基于中国人群ABO血型基因和A2亚型遗传学基础，根据己有的研究成果及所有已报道的A2亚型的突变位点特异性，发明人设计了聚合酶链反应-序列特异性引物法(PCR-SSP)检测试剂盒，通过设计ABO血型基因各自的特异性引物、摸索最佳退火温度及调节Mg2+离子和引物浓度等条件，可以对中国人群常见的ABO血型抗原及特异性A2亚型抗原的血型基因进行同步扩增。ABO特异性血型基因与X7W—致序列的DNA序列紧密相关，仅有几个碱基替换或单个碱基缺失。^7M等位基因与等位基因相比只是在467位的单个碱基替换(C/T，Pro/Leu)，两者翻译的糖基转移酶活力没有显著性差异。577基因仅在297、526、657、703、796、803、930和1096位碱基8个位置与爿"基因有改变，导致糖基转移酶多肽链上有4个氨基酸替代C526G(Arg/Gly),G703A(Gly/Ser)，C796A(Leu/Met)，G803C(Gly/Ala)。W基因与J7W的差异是第261位核苷酸G缺失，引起了阅读框移动，在351至354位置产生终止密码。」207基因与J70/相比是在467位的单个碱基替换(C/T)和1059位1061位有一个C缺失，导致阅读框增加了64个核苷酸，A2型糖基转移酶在C端增加了21个氨基酸。是在的基础上多了个1054OT,^20是在基础上多了个1054OG突变，」204是B基因与O02的杂合，在基础上多了297A>G、526C>G、657C>T、730G>A、771C>T、829G>]，占中国汉族人群大多数的A205基因与A101相比有467位的单个碱基替换和1009位的错义突变(A>G)。基于上述ABO常见血型和A2亚型遗传学基础，发明人发明了PCR-SSP(Sequence-specificprimerPCR)检测试剂盒，可检测出ABO常见基因及所有已报道的A2等位基因，且是同步条件扩增，同步条件电泳、一次性就可获得受检者ABO血型的基因型。同步分型的关键在于摸索一个合适的退火温度，可通过调节Mg2+浓度和序列特异性引物等来实现。实施例一对于ABO系统常见基因与A2亚型基因检测与鉴定发明的DNA序列共设计特异性引物共13对，委托上海生工公司合成(见表l，2)，每个ABO血型基因检测试剂，含4条引物，其中2条为序列特异性引物亚型基因与常见基因，另2条为内对照引物，内对照引物为人类生长激素(HGH)基因特异性引物，HGH-A链序列5，-tgccttcccaaccatteccctta-3，,HGH-B链序列5，-ccactcacggatttctgttgtgtttc-3，，扩增产物长度434bp。本试剂盒可检测中国人群最为常见的AlOl、A102、BlOl、0014种等位基因与A201、A202、A203、A204、A205、A2066个所有的A2等位基因。表l常见ABO基因特异性引物序列及所检测的等位基因l物名称检测的等位基因引物序列5'-3'受检核苷酸位置产物长度(bp)Mix—AMix一A102Mix一BMix-0雄/,扁《j風掘么齒6譜《，？柳7,柳《A似5飾/歸/,婦《腳7,您似gg33gg3tgtcctcgaggtgtgaggatgtggatgttgaatacgtggctttcctgatgctggcggggcaccgcggccactgteagtgctggacgtggtccacgcacaccaggtaatcggaaggstgtcctcctggcttgatggcaaacacagttaacnt261G及nt297Ant396G,nt467T，nt526G及nt613Gnt261G缺失及nt351G75107125131表2A2亚型基因特异性引物序列引物名称引物序列5'-3，引物所处位置受检核苷酸位置产物长度(bp)Mix-l3CgtggctttcctgatgctgE7nt377-nt396nt467T107gcggggcaccgcggccaE7nt467-nt483Mix-2C3ggccaacggcategagE7nt874-nt891nt腿Gdel203CtggcagccgetC3CggtE7ntl059-nt翻Mix-3caggccaacggcateE7nt874-nt891ntl054T1983gCcgcteaegggttCC3E7ntl054-ntl071Mix-4caggccaacggcategagE7nt874-nt891ntl054G198cgcteaegggttcccE7ntl054-ntl071Mix-5gggggteggtgc卿agaE7nt812-nt829nt829A218<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>注E7表示ABO基因的第7外显子，nt表示核苷酸序列位置，从ABO基因cDNA的第1个核苷酸数起。ABO系统常见基因与A2亚型基因同步PCR扩增操作方法如下:(1)采用25-50yL反应体系，包括IOXPCR缓冲液2.5-5.0^10.2mMdNTP2-5^11.5mMMgCl23-6^1l.OnMABO序列特异性引物0.2mM内对照引物0,3UDNATaq酶0.1,1100ngDNA3-10|al加水至25-50pl采用Enpendorf基因扩增仪(德国)，多重PCR反应扩增条件:95°C5min预变性95°C0.5min变性，60-65°C50S退火72°C1.5min链延伸，共反应30个循环72°C5min延伸降温至4。C，结束整个反应IOXPCR缓冲液配制100mmol/LTris-HCl(PH9.0)500mmol/LKC11%TritonX1000.1%明胶15mraol/LMgCl210%DMS02%Tween20取PCR扩增产物于含0.5Ug/mL溴乙淀2%琼脂糖凝胶中电泳25min后，置紫外检测仪上观察特异性条带，并记录实验结果。图1为本发明检测A102/B101、B101細、A102/001、001/0014种基因型的电泳图;图2为本发明检测A102、A201、A205基因型电泳结果图。和传统的鉴别技术相比，本发明实施例中用于中国人群常见ABO血型抗原和特异性A2抗原同步基因分型的引物及试剂盒及定型方法，可以正确定出所有常见的中国人群的ABO血型基因和包括A205等位基因在内的所有A2亚型血型基因。并且此技术能够使ABO系统等位基因在同一条件下进行同步扩增和扩增产物在同一凝胶中进行同步电泳；ABO基因分型方法适合中国人ABO基因常规鉴定与研究。此试剂盒可解决ABO疑难血型鉴定问题，保障了临床血液的安全输注。权利要求1、一种ABO血型基因检测试剂，包括2条内对照寡核苷酸引物HGH-A链序列5’-tgccttcccaaccattcccctta-3’，HGH-B链序列5’-ccactcacggatttctgttgtgtttc-3’，其特征在于，还至少包括下述任意一组2条基因特异性寡核苷酸引物(1)Mix-A5’-ggaaggatgtcctcgaggtg-3’5’-tgaggatgtggatgttgaat-3’(2)Mix-A1025’-acgtggctttcctgatgctg-3’5’-gcggggcaccgcggcca-3’(3)Mix-B5’-ctgtcagtgctggacgtgg-3’5’-tccacgcacaccaggtaatc-3’(4)Mix-O5’-ggaaggatgtcctcctggta-3’5’-cttgatggcaaacacagttaac-3。全文摘要本发明公开了一种用于ABO血型抗原和特异性A2抗原同步基因分型的检测试剂及定型方法，含4条引物，其中2条为序列特异性引物，另2条为内对照引物，可以对中国人群常见的ABO血型抗原及特异性A2亚型抗原的血型基因进行同步扩增。检测中国人群最为常见的A101、A102、B101、O014种等位基因与A201、A202、A203、A204、A205、A2066个所有的A2等位基因。与传统的检测方法相比，本发明是一种快速、简单、实用、特异和敏感的检测方法。适合中国汉族人ABO血型基因的鉴定以及用于人类ABO血型的研究。文档编号C12Q1/68GK101403007SQ20081021716公开日2009年4月8日申请日期2008年11月3日优先权日2008年11月3日发明者琼喻,邓志辉申请人:深圳市血液中心